大腸桿菌o157恆溫核酸擴增快速檢測試劑盒及其用法的製作方法

2023-05-14 15:17:11

專利名稱：大腸桿菌o157恆溫核酸擴增快速檢測試劑盒及其用法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種恆溫核酸擴增檢測方法，具體涉及一種大腸桿菌0157恆溫核酸擴增快速檢測 試劑紐其用法。
背景技術：
腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157是一種重要的人獸共患病病原菌.主要il3S食物和水源傳播， 該病可引繊瀉、出血性腸炎、繼發溶血性尿毒綜合症加S)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等。 HUS和TTP的病情兇險，病死率高。自1982年美國首次分離出該菌以來，世界各地不斷有散發和暴 發的報告。我國近幾年已陸續有十多個省份在食品、家禽、家畜、昆蟲和腹瀉病患者中檢出該致 病菌，存在著疫清暴發、流行的潛在麵。由於大腸桿菌0157感染劑量樹氐，食入不足100個細菌 就可引起疾病，且病程急，病情嚴重；此外，除臨床樣品外，對水及食品等微生物區系複雜的樣 品進行檢湖附，在這些樣品中致病菌的數量可能很少，因此篩檢大腸桿菌0157的方法是否靈敏、 特異及快速至關重要。隨著分子生物學技術的飛速發展使這種要求成為可能。
採用特異序列的原位擴增可便於探測細菌細胞內部的單拷貝功能基因。多種版本的原核原位 PCR(聚合酶鏈反應)和反轉錄PCR(聚合酶鏈反應)法已經發展到可以探測單細胞的特異基因的水 平。早期的報告指出，HNPP—Fast Red TR體系曾用於原位PCR產品的高靈鵬檢測。然而，原 位PCR有許多不利的因素(1)由於透化作用與熱循環的作用，擴增產品中的細胞被損壞，這使 得劍門難以使用螢光標記抗體鄉行同步的細胞識別；(2)細胞壁的不滲透性和由DNA聚合酶抑 製劑引起的PCR擴增反應中的幹擾會產生假的陰性結果；(3)已標記的擴增產物的擴散，及包含 它的細胞所弓l起的陽性結果，或者通過切口轉譯活動產生糊一特異性結合的有標記的核苷^;躬I 起的陽性結果，都縫成假陽性結果。

發明內容
本發明的目的在於克服上述技術缺陷，掛共一種大腸桿菌0157恆溫核酸擴增快速檢測試齊U盒 及用法。
為達到本發明的目的，採用以下技術方案
本發明的一種大腸桿菌0157恆溫核酸擴增快速檢測方法，其試劑包括 (D弓卿混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol/Ml，引物序歹咖下
夕卜弓l物l: GCTATACCACGTTACAGCGTG;
夕卜弓l敝ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
內引物l: GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG;
內引物2: CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC; ②磷酸緩衝液； (D多聚甲醛為2-4%質量；
④多聚賴氨酸為O. 03-0. 05%質量；
溶菌酶溶液濃度為O. 6《8mg/ml;
⑥ 蛋白,濃度為0.1-0.3mg/ml;
⑦ RNA酶濃度為1-2mg/ml;
⑧ BWDNA聚，(嗜熱脂肪芽胞杆SDNA酶大片段)濃度為8U4tl; (D反應緩衝液lOmMdNTP (脫氧核糖核苷酸)lOxThemioPol (耐熱聚合酶)反應緩衝
液:150mMMgSCXr8:5:2體積； ⑩樣品預處理液pH7.0-8.0、 20mMTris-HCl (三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽)，2mMEDTA
(乙二胺四乙酸)，1.2% TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)； @顯色劑螢光染料l-2mg/ml DAPI (4,6- -2-苯基吲哚二鹽酸鹽)； 系列濃度乙醇溶液為30-70%體積乙醇、70-90%體積乙醇、90-100%體積乙醇； 陽性對照為0157大腸桿菌基因組DNA，陰性對照為不含模板的反應混合液。 所述的磷酸緩衝液組分為137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， pH7.0-8.0、 1.5mM KH2P04。
用上述試劑盒檢測大腸桿菌Ol 57的方法包括以下步驟
1)被檢樣品的預處理將待檢測樣品懸浮於磷酸緩衝液中，離心，取上清液；上清液依次
做10倍稀釋度稀釋，針稀釋度取0.5-2!111塗平 行細胞計數；離心，沉澱上清中的細 胞，然後用磷酸緩衝液衝洗細胞兩次,240/。質量多聚甲醛固定15-20h;細脫懸浮液1(M0W 滴加到用O. 03-0. 05%質量多聚賴氨酸處理過的玻璃板孔中，風乾；
(2) 細胞壁ffljg性處理將固定好的細胞分別置於30-70%， 70-90%, 90-100%體積的乙醇液 中各處理l-3min，進行脫水；用0.6-0.8mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細胞10-15min， 達到部分降解細胞壁的目的，其中溶菌酶用樣品預處理液溶解；用0.1-0.3Mg/ml的蛋白酶 K室溫下處理細胞8-12min，去除細胞壁以及與DNA結合的蛋白；最後用l-2mg/ml的RNA 酶處理12-15 min;
(3) 環介導等溫擴增反應在50-20(WPCR管配置反應體系，加入引物混合液3-12W，反應 緩衝液4.75-19|4， B" DNA聚合斷.25-114，模柳NA卜4W，加水至12. 5-5(￥1;將配 置好的反應混合液滴加至個定有細胞的玻板孔中，聚酯封層；恆溫反應1-1.5h; 所用陽性對照為0157大腸桿菌基因組DNA;
(4) 反應結束後，將玻片置於l-2mg/mlDAPI染料中染色10-12min，然後在無菌水中漂洗， 自然幹；
(5) 分析判斷反應產物結果。將乾燥的玻片置於螢光顯微鏡下觀察，調M距，打開螢光， 在卞鵬中看至微發螢光的細胞就是陽性結果，細胞形態以陽性對照為準，細胞形態以陽 性對照為準，反之，紫外光下可以看到而螢光激發下看不到的細胞即為陰性結果，在熒 光顯微鏡下最低可以檢測到1個細胞，未發現假陽性。
步驟(3)所述的恆溫反應SS在63-65"C範圍。
步驟(1)所述的多聚甲醛固定時間為15-20h。
步驟(1)所述的離心取上清液的,為1000-2000 rpm，時間為l-2min。
步驟(1)所述的離心沉澱上清液中細胞的轉速為10000-15000rpm，時間為l-5min。
步驟(4)戶;M的漂洗次數為2次以上，優選2次，時間為每次12min。
本發明的一種沙門氏菌恆溫基因擴增快速檢測試劑盒及方法有以下有益效果
1、 高特異性本發明根據大腸桿菌0157K 7基因保守區設計了四雑異性引物 外引物I: GCTATACCACGTTACAGCGTG;
外引物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
內引物1: GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG; 內引物2: CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAAnTGCC;
應用上述四條引物，根據是否擴增就能判斷革巴標物質的存在與否，陽性率可達大於99%， 假陽性率小於1%;
2、 無需增菌檢測之前不需要對待檢菌進1fi咅養；
3、 實現樣品原位檢測在不增菌的條件下，直接對樣本中的病原菌微生物進行原位基因擴增;
4、 快速、高效擴增擴增在不到2h即可完成，且產率高；
5、 靈驗高在複雜體系中可檢觀倒單個細胞的靶目標，最低檢領販限達到10CFU/ml，標本
的檢出率達到99%;
6、 鑑定簡便通過螢光顯微鏡觀察細胞是否發熒 行鑑定，無需電泳等其他樹可分析步驟。
具體實肺式 魏例l
按下列配方配置大腸桿菌0157恆溫基因擴增快速檢測試劑盒 弓嫩混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol/nl，引物序列如下 夕卜弓嫩l: GCTATACCACGTTACAGCGTG; 外引物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
內引物l: GCTCTTGCCACAGACTGCACATrCGTTGACTACTTCTTATCTGG; 內弓l敏CTGTGACAGCTGAAGCnTACGCGAAATCCCCTCTGAATITGCC; 磷酸緩衝、艦BS: 137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， pH7.0、 1.5mMKH2P04;
多聚甲醛為2%質量； 多聚賴氨酸為0.03%質量；
溶菌膝濃度為0.6mg/ml; 蛋白獻濃度為O. lmg/ml; RNA酶濃度為lmg/ml; Bs,DNA聚合酶濃度為8乖反應緩衝液10mM dNTP， 50W lOXThemoPol Buffer, 20W 150mM MgS04; 樣品預處理液pH7.0、 20mMTris-HCl， 2mMEDTA， 1.2%TritonX-l00; 系列濃度乙醇溶液為30%體積乙醇、70%體積乙醇、90%體積乙醇； 顯色劑螢光染料lmg/mlDAPI;
陽性對照為0157大腸桿菌基因組DNA，陰性對照為不含模板的反應混合液。
用上述試劑盒按以下方法對大腸桿菌0157進行檢測
1、被檢樣品的預處理
(1) 將待檢樣品懸浮於磷酸緩衝溶液中，取0.5! 1細胞懸浮液於將待檢測樣品懸浮於離心管 中，1000ipm離心2min,取上清；
(2) 上清液依次做10倍稀釋度稀釋，針稀釋度取0.51111塗平板進行細胞計數；
(3) 10000rpm離心5min沉澱上清中的細胞，然後用磷酸緩衝液衝洗細胞兩次，2%多聚甲醛 固敦Oh;
(4) 細胞懸浮液lOMl滴加到用多聚賴氨酸處理過的玻璃板孔中.自然風乾。
2、 細胞壁ffl3g性處理
(1) 將固定好的細胞分別置於30%， 70%， 90。/。濃度的乙醇液中各處理2min，進行脫水；
(2) 用0.6mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細胞15min，其中溶菌酶用樣品預處理液溶解；
(3) 用0.1Mg/ml的蛋白酶K室溫下處理細胞12min;
(4) 最後用lmg/ml的RNA酶處理15min。
3、 環介導等溫擴增(LAMP)反應
(1) 在5(MPCR管配置反應體系加入3pl引物混合液，反應緩衝液4.75W， BstDNA聚合 酶0.25Ml (8U)， ,DNA1W，加水至12.5l4;
(2) 將配置好的反應混合液滴加到固定有細胞的玻板孔中，聚酯封層；63'C恆溫反應1. 5h。
4、 反應結束後，將玻片置於lmg/mlDAPI染料中染色12min，然後在無菌水中漂洗兩次，每次 12min，自然幹。
5、 分析判斷反應產物結果。將千燥的玻片置於螢光顯微鏡下觀察，調整焦距，打開螢光，在視 野中看到激發螢光的細胞就是陽性結果，細胞形態以陽性對照為準，反之，紫外光下可以看到而 螢光激發下看不到的細胞即為陰性結果。在螢光顯微鏡下最低可以檢測到1個細胞，未發現假陽 性。
實施例2
按下列配方配置大腸桿菌0157恆溫基因擴增快速檢測試劑盒 引物混合液混合液中四條引物濃度均為lOpmo,，引物序列如下 外引物l: GCTATACCACGTTACAGCGTG; 外引物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
內引物l: GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCG1TGACTACTTCTTATCTGG;
內引做CTGTGACAGCTGAAGCnTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC; 磷酸緩衝、鞭BS: 137mMNaCl， 2.7mMKCl， 8.1mMNa2HP04， pH7.2、 1.5mMKH2P04;
多聚甲醛為3%質量； 多聚賴氨酸為0.04%質量；
溶菌酶濃度為0.7mg/ml; 蛋白鵬濃度為0.2mg/ml; 腿酶濃度為lmg/ml; Bs,DNA聚合酶濃度為8U/Ml;
反應緩衝液80)4 10mM dNTP， 50l4 lOXThemoPol Buffer, 20)-i1 150mM MgS04; 樣品預處理液pH8.0、 20mMTris陽HCl， 2mMEDTA， 1.2% Triton X-100; 系列濃度乙醇溶液為60%體積乙醇、80%體積乙醇、100% #|只乙醇； 顯色劑螢光染料lmg/mlDAPI;
陽性對照為0157大腸桿菌基因組DNA，陰性對照為不含模板的反應混合液。 用上述試劑盒按以下方法對大腸桿菌0157進行檢測
1、被檢樣品的預處理
(1) 將待檢樣品懸浮於磷酸緩衝溶液中，取lml細胤懸浮液於離心管中，1000ipm離心2min， 取上清；
(2) 上清液依次做10倍稀釋度稀釋，^稀釋度取lml塗平板進行細胞計數；
(3) 12000rpm離心3min沉澱上清中的細胞，然後用磷酸緩衝液衝洗細胞兩次，3%多聚甲醛 固定16h;
(4) 細胞懸浮液2(M滴加至,多mil氨酸處理過的玻璃板孔中，自然風乾。
2、 細胞壁鵬性處理
(1) 將固定好的細胞分別置於60%， 80%， 100%濃度的乙醇液中各處理lmin，進行脫水；
(2) 用0.7mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細胞12min,其中溶菌酶用樣品預處理液溶解;
(3) 用0.2Mg/ml的蛋白酶K室溫下處理細胞10min;
(4) 最後用lmg/ml的RNA酶處理15min。
3、 環介導等溫擴增(LAMP)反應
(1) 在50WPCR管配置反應體系加入6pl弓l物混合液，反應緩衝液9. ， B對DNA聚合 酶0.5)4 (8U)，模板DNA2W，加水至25nl;
(2) 將配置好的反應混合液滴加到固定有細胞的玻板 L中，聚酯封層；64'C恆溫反應1.2h。
4、 反應結束後，將玻片置於lmg/mlDAPI染料中染色12min，然後在無菌水中漂洗兩次，每次 12min，自然幹。
5、 分析判斷反應產物結果。將乾燥的玻片置於螢光顯微鏡下觀察，調整焦距，打開螢光，在
視野中看到激發螢光的細胞就是陽性結果，細胞形態以陽性對照為準，反之，紫外光下可以看到
而螢光激發下看不到的細胞即為陰性結果。在螢光顯微鏡下劇氐可以檢測到1個細胞，未發現假陽性。
實施例3
按下列配方配置大腸桿菌0157恆溫基因擴增快速檢測試劑盒-引物混合液混合液中四條引物濃度均為lOpmo,,引物序列如下-外引物l: GCTATACCACGTTACAGCGTG; 夕卜弓l物2: ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC;
內引物l: GCTC1TGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG; 內弓l物2: CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC; 磷酸緩衝淑BS: 137mMNaCl,2.7mMKCl,8.1mMNa2HP04，pH8、 1.5mMKH2P04;
多聚甲醛為4%質量； 多聚賴氨酸為0.05%質量；
溶菌酶溶液濃度為0.8mg/ml; 蛋白酶K:濃度為0.3mg/ml; RNA酶濃度為2mg/ml; B對DNA聚合酶濃度為8U/^1;
反應緩衝液8(M 10mM dNTP， 5(M lOXThemoPol Buffer,150mM MgS04; 樣品預處理液pH8.0、 20mMTris-HCl， 2mMEDTA， 1.2% Triton X-l00; 系列濃度乙醇溶液為70%體積乙醇、90%體積乙醇、100%體積乙醇； 顯色劑螢光染料2呢MDAPI;
陽性對照為0157大腸桿菌基因組DNA,陰性對照為不含模板的反應混合液。
用上述試劑盒按以下方法對大腸桿菌0157進行檢測
1、被檢樣品的預處理
(1) 將待檢樣品懸浮於磷酸緩衝溶液中，取2ml細胞懸浮液於離心管中，2000ipm離心lmin， 取上清；
(2) 上清液依次做10倍稀釋度稀釋，^h稀釋度船ml塗平板進行細胞計數；
(3) 15000ipm離心lmin沉澱上清中的細胞，然後用磷酸緩衝液衝洗細胞兩次，4%多聚甲醛 固定15h;
(4) 細胞懸浮液4(^1滴加到用多 氨酸處理過的玻璃板孔中，自然風乾。 2、細胞壁M性處理
(1) 將固定好的細胞分別置於70%， 90%， 100%濃度的乙醇液中各處理0.5111111，進行脫水；
(2) 用0.8mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細胞10min，其中溶菌酶用樣品預處理液溶解;
(3) 用0.3Mg/ml的蛋白酶K室溫下處理細胞8min;
(4) 最後用2mg/ml的RNA酶處理12min。
3、環介導等溫擴增(LAMP)反應
(1) 在200WPCR管配置反應體系加入12pl弓l物混合液，反應緩衝液， DNA聚合 酶1W，模板DNA4W，加水至50W;
(2) 將配置好的反應混合液滴加至睏定有細胞的玻板孔中，聚酯封層；65卩恆溫反應lh。
4、 反應結束後，將玻片置於2mg/mlDAPI染料中染色10min，然後在無菌水中漂洗兩次，每次 12min，自然幹。
5、 分析判斷反應產物結果。將乾燥的玻片置於螢光顯微鏡下觀察，調鶴距，打開螢光，在視 野中看到激發螢光的細胞就是陽性結果，細胞形態以陽性對照為準，反之，紫外光下可以看到而 螢光激發下看不到的細胞即為陰性結果。在螢光顯微鏡下最低可以檢測到1個細胞，未發現假陽 性。
權利要求
1、一種大腸桿菌O157大腸桿菌恆溫核酸擴增快速檢測試劑盒，其特徵在於，試劑包括①引物混合液混合液中四條引物濃度均為10pmol/μl，引物序列如下外引物1GCTATACCACGTTACAGCGTG；外引物2ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC；內引物1GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；內引物2CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC；②磷酸緩衝液；③多聚甲醛為2-4％質量；④多聚賴氨酸為0.03-0.05％質量；⑤溶菌酶溶液濃度為0.6-0.8mg/ml；⑥蛋白酶K濃度為0.1-0.3mg/ml；⑦RNA酶濃度為1-2mg/ml；⑧Bst DNA聚合酶濃度為8U/μl；⑨反應緩衝液10mMdNTP∶10×ThermoPol反應緩衝液∶150mMMgSO4＝8∶5∶2體積；⑩樣品預處理液pH7.0-8.0、20mMTris-HCl，2mMEDTA，1.2％TritonX-100； top= "138" left = "23"/>顯色劑螢光染料1-2mg/mlDAPI； top= "145" left = "23"/>系列濃度乙醇溶液為30-70％體積乙醇、70-90％體積乙醇、90-100％體積乙醇； top= "153" left = "23"/>陽性對照為O157大腸桿菌基因組DNA，陰性對照為不含模板的反應混合液。
2、 根據權利要求l所述的試劑盒，其特徵在於，戶腿的磷酸緩衝液組分為137mMNaCl， 2.7mM KC1， 8.1mMNa2HP04， pH 7.0-8.0、 1.5mMKH2P04。
3、 一種用權利要求1所述的試劑盒檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1) 被檢樣品的預處理將待檢測樣品懸浮於磷酸緩衝液中，離心，取上清液；上清液依次做IO 倍稀釋度稀釋，*稀釋度取0.5-21111塗平板進行細胞計數；離心，沉澱上清中的細胞，然後 用磷酸緩衝液衝洗細胞兩次，24%質量多聚甲醛固定15-2011;細胞懸浮液1040W滴加至, 0.03-0. 05%質量多 氨酸處理過的玻璃板孔中，風乾；(2) 細胞壁M性處理將固定好的細胞分別置於30-70%， 70-90%， 90-100%體積的乙醇液中各 處理l-3min，進行脫水；用0.6-0.8mg/ml濃度的溶菌酶溶液室溫下處理細胞10-15min，其中溶 菌酶用樣品預處理液溶解；用0.1-0.3Pg/ml的蛋白llK室溫下處理細胞8-12min，去除細胞壁以 及與DNA結合的蛋白；最後用l-2mg/ml的RNA酶處理12-15 min;(3)環介導等溫擴增反應在50-2(XMPCR管配置反應體系，加入引物混合液3-12Ml，反應緩衝 液4.75-19W， Bst DNA聚合,.25-1W，模板DNA1-叫1，加水至12.5-5(M;將配置好的反 應混合液滴加到固定有細胞的玻板孔中，聚酯封層；恆溫反應1-1.5h; 所用陽性對照為0157大腸桿菌基因組DNA;(4) 反應結束後，將玻片置於l-2mg/mlDAPI染料中染色10-12min，然後在無菌水中漂洗，自然 幹；(5) 分析判斷反應產物結果。將乾燥的玻片置於螢光顯微鏡下觀察，調整焦距，打開螢光，在視 野中看到 螢光的細胝就是陽性結果，細胞形態以陽性對照為準，細胞形態以陽性對照為 準，反之，紫夕卜光下可以看到而螢光激發下看不到的細胞即為陰性結果，在螢光顯微鏡下最 低可以檢領倒1個細胞，未發現假陽性。
4、 根據權禾腰求3所述的方法，其特徵在於步驟(3)所述的恆溫反應鵬在63-65'C範圍。
5、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於步驟(1)所述的多聚甲酸固定時間為15-20h。
6、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於步驟(1 )所述的離心取上清液的轉速為1000- 2000 rpm， 時間為l-2min。
7、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於步驟(1)所述的離心沉澱上清液中細胞的轉速為 10000-15000ipm，時間為l-5min。
8、 根據權禾腰求3戶腿的方法，其特徵在於步驟(4)所述的漂洗次數為2次，每次12min。
全文摘要
本發明公開了一種大腸桿菌O157恆溫核酸擴增快速檢測試劑盒及其用法，試劑盒包括引物混合液，其序列為外引物1GCTATACCACGTTACAGCGTG；外引物2ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC；內引物1GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；內引物2CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC；磷酸緩衝液PBS、多聚甲醛、多聚賴氨酸、溶菌酶、蛋白酶K、RNA酶、BstDNA聚合酶、反應液、樣品預處理液、顯色劑、陽性對照及陰性對照。利用該試劑盒通過大腸桿菌O157菌體固定處理、細胞通透性處理、恆溫基因擴增反應、判斷反應產物結果實現對大腸桿菌O157高特異性、快速、高效、高靈敏度、簡便的原位檢測。
文檔編號C12Q1/10GK101343661SQ20081003033
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月22日 優先權日2008年8月22日
發明者常彥磊, 琳 李, 王秋豔, 磊 石, 帆 黃 申請人:華南理工大學