通過吸附和洗脫從乳清中選擇性地提取金屬蛋白質的方法

2023-05-11 22:29:01

專利名稱：通過吸附和洗脫從乳清中選擇性地提取金屬蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種從乳清中選擇性地提取某些蛋白質的方法，即提取金屬蛋白質，尤其是固定鐵的金屬蛋白質，例如乳鐵傳遞蛋白，乳過氧化物酶和鐵傳遞蛋白。
眾所周知，蛋白質有好幾千種。單是乳清就含有幾百種蛋白質，其中有的是微量的金屬蛋白質。
所謂「金屬蛋白質」，是指對金屬特別是對鐵具有某種良好親和性的蛋白質，現在研究這些蛋白質的人愈來愈多了，不僅因為它們具有營養意義，特別是作為生物學方法為乳嬰提供鐵質(例如乳鐵傳遞蛋白)，而且更重要的還在於它們具有藥理學特性，特別是作為抗菌劑使用時更是如此。
已知有幾種提取乳清蛋白質的方法。
在文獻GB-A-871，541中曾建議一般採用離子交換樹脂接觸法來提取蛋白質，樹脂是由一種惰性基質(硅藻土)組成，比表面積大，包被一種交換劑凝膠(苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)。這種陳舊的技術可以大量地提取蛋白質，但沒有選擇性。
在文獻FR-A-2，505，615(相應於US-A-4，436，658)中，曾建議對所需的乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶這些金屬蛋白質有選擇地提取，辦法是先在一種堅硬的固體支持物上，例如二氧化矽支持物上，在弱鹼性介質(PH7.9-8.5)中滲濾乳清，然後用一種酸性溶液洗脫被吸附的蛋白質。這種方法所得結果極佳，因為這是選擇性提取。可以，此方法幾乎沒有得到發展，因為處理過的乳清立刻變成一種鹼性物質，要是以後不做任何昂貴的處理，那麼動物是無法食用這種鹼性物質的。
在文獻FR-A-2，359，634(相應於US-A-4，100，149)中，曾建議使乳清與一種陽離子交換樹脂接觸來提取蛋白質，樹脂是由一種帶孔隙的無機支持物組成的，粒度適宜(圓粒二氧化矽)，包被一層網狀人工合成高分子膜，膜上帶有諸如羧基，磺基和膦基之類的用酸性官能團表示的陽離子交換基團。這一系統能夠回收金屬蛋白質，但上面結合著相當大比例的免疫球蛋白(參閱US-A-4，100，149，本專利的實例3和下文的實例7)。此外，金屬蛋白質的提取收率低，據認為這些蛋白質的純度也不夠，要是以後不作昂貴的加工處理，則在經濟上是不足取的。
在文獻FR-A-2，319，299(相應於GB-A-1，544，867和US-A-4，673，734)中，曾主張一般地提取據說有好幾千種的蛋白質，辦法是把它們與一種帶孔隙的無機支持物接觸，支持物表面包被一層胺化多糖生物高分子。使用這種系統來純化和分離諸如γ球蛋白、血紅蛋白、清蛋白之類的生物大分子會獲得極佳的結果，但用在乳清上卻是無效的，因為這時結合的只是蛋白質的主要部分，而未結合那些諸如金屬蛋白質之類的具有陽離子特徵的蛋白質。因此這一技術不適合於從乳清中選擇性地分離這些金屬蛋白質。
本發明改正了這些缺陷。它涉及一種從乳清中提取金屬蛋白質的方法，特別是通過吸附在某些固體支持物上，然後再將已吸附的蛋白質進行洗脫，提取結合鐵的蛋白質。更為特別的是，本發明涉及這樣一種方法，它具有選擇性、經濟性，且便於操作，尤其是它能真正選擇性地和經濟地從乳清中回收金屬蛋白質，而不使乳清本身發生改變，就是說使乳清本身完全仍可利用，特別是既可以作為營養素，又可以作為能量供應體用於動物飼料，這些都是人們迄今尚未實現的。
通過把蛋白質吸附於顆粒狀的，帶孔隙的一種無機支持物上，然後使用一些溶液洗脫如此吸附的蛋白質，從乳清中提取這些金屬蛋白質的這一方法，其特徵在於所述顆粒表面包被了一層胺化多糖，該多糖具有酸性官能團。
在以後的描述和權利要求書中，我們用「胺化多糖」來表示具有某種陽離子特徵的一種胺化的生物高分子，例如葡聚糖、澱粉、纖維素、瓊脂糖，以及其它糖類。根據本發明，這些生物高分子還具有一些酸性官能團，特別是具有像羧基或磺基之類的官能團。
換句話說，本發明為了要從已知含有幾百種蛋白質的乳清中特異提取金屬蛋白質，主要在於選擇一種帶孔隙的無機支持物，例如二氧化矽，其主要特徵是，一方面它不是用人工合成高分子包被的，而是用一種特定的生物高分子，即用一種胺化多糖包被的，而已知(FR-A-2，319，299)這一類型具有陽離子特徵的生物高分子是不適用於這類提取的;另一方面，它具有某些酸性基團，而人們從另一文獻(FR-A-2，359，634)得知這些酸性基團從工業方面看，所導致的選擇性極差，因為回收率和純度不夠。
先有技術迫使人們一度放棄使用某些生物高分子，而本發明恰巧就在這時以完全意料不到的方式證實，利用特異性生物高分子，在這種情況下既然是通過酸性基團鍵合的，那麼它就不僅可以選擇性地提取乳清中的金屬蛋白質，而且尤其還可以將此金屬蛋白質與免疫球蛋白很好地分開，最後有可能使回收率和蛋白質純度有明顯的改進，且操作條件可與工業加工過程相適合。這一選擇尤其出人意料，事實上技術現狀絲毫未使專業人員產生把具有陽離子特徵的材料和另一種具有陰離子特徵的材料結合起來的想法，因為這些特點從本質上說是對立的。
更出人意料的是，人們是用與酸性基團鍵合的多糖來包被帶孔隙的二氧化矽顆粒才能成功，並且這是為了取得這樣一種選擇性。而已知具有酸性官能團的這一類型的陽離子交換樹脂據說曾一度被拒絕(參閱上文述及的FR-A-2，359，654第1頁第17行及下文)作為陽離子交換樹脂用於蛋白質(根據失敗的技術範疇所作的預測)。
因此，本發明在於一種獨具特色的選擇，以便在一個大類中進行精確的選擇，這樣一種選擇本可以有利和經濟地解決某一個問題，降低製造成本，提高生產力，然而先有技術卻迫使人們放棄這樣的挑選。
本申請人以一種完全出乎人們意料的方式證實，選擇這些特異的帶孔隙的無機物顆粒可以一方面大大改進提取收率(兩倍以上);
另一方面也是更主要的方面，特異地，選擇性地並且是方便地從乳清中提取所要的金屬蛋白質，同時又不使它與其它蛋白質混合，而提取收率和純度也有很明顯的改進(省時，省力，提高了生產率);
最後是，經過如此處理過的乳清不受影響，仍完全適於食用，保存了全部的營養價值。
這種選擇還可以在接近中性PH的條件下操作，特別是可以在允許選擇性地和經濟地收集所述的可溶狀態金屬蛋白質的某些條件下操作。
可以認為本發明中的選擇是先有技術的綜合。這些技術一方面是相互對立的，另一方面也是更重要的方面，已知某種化學產品不是它的不同組分的混合物。
實際操作時優先使用包被無機物顆粒表面的多糖是葡聚糖或葡聚糖衍生物，例如一種胺化衍生物;
最好使用二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)型的化合物，分子量至少為104道爾頓，最好為105-106道爾頓;
酸性基團是羧基或磺基;這些酸性基團最好通過二價烴基結合於糖類生物高分子上，尤其是通過諸如亞甲基或亞丙基之類的亞烷基結合於糖類生物高分子上。
帶孔隙的無機物顆粒優先採用無機氧化物，例如最好採用二氧化矽球形顆粒，特別是經過熱解獲得的二氧化矽球粒;
二氧化矽顆粒採用的是球粒，其特徵為·粒度在10-1000μm之間，最好在100-300μm之間;
·比表面積在1-400m2/g之間，最好在15-200m2/g之間;
·平均孔徑在5-200nm之間;
在一個變通辦法中，處理乳清時，首先使它流經上文談及的第一組型號的二氧化矽顆粒，此第一組型號含有弱陽離子交換劑酸性基團，特別是羧基，這是為了截留乳鐵傳遞蛋白;然後在第二階段將處理過的乳清分批地流經第二組型號的二氧化矽顆粒，此第二組型號含有強陽離子交換劑酸性基團，特別是磺酸基團，這是為了截留乳過氧化物酶;
乳清是一種新鮮乳清，就是說，其PH值在6.3-6.6之間;在一個變通辦法中，可以使用一種酸性乳清，就是說，其PH值在4.3-4.6之間。
用於實施本發明的方法，以及由此而顯示出的優點都將在下文敘述的已實現的實例中一再得到重複，下列實例有示範意義，但無限制性，附圖
則簡要表示了一種適於實施本發明方法的裝置。
實例一在貯罐(1)中盛入400升乾酪製備過程中得到的新鮮乳清(2)(PH6.4)。輕輕攪拌使之均勻。按已知方法將此乳清重新冷卻至3-8℃之間。此乳清(2)約含有74.6mg/l乳鐵傳遞蛋白和50.5mg/l乳過氧化物酶。
在另一貯罐(3)中盛入20升第一種溶液(4)，此溶液約含有3g/l氯化鈉(PH中性)。
將4千克帶孔隙的二氧化矽球狀顆粒(6)裝入柱(5)，這種顆粒是IBF-Biotechnics公司銷售的，註冊商標為「CM-SPHERODEX-LS」，粒度在100-300μm之間，乳徑約為100nm，比表面積約為25m2/g，孔壁包被一層薄薄的不留空隙的二乙胺乙基葡聚糖，它具有羧酸基團。
在第一階段首先使貯罐(1)中的乳清(2)用4.5小時的時間流經二氧化矽(6)。
把處理過的乳清(7)收集到另一個貯罐(8)中，然後把它泵入(9)中按常規法進行濃縮和乾燥處理。這種PH未發生變化的乳清仍然含有大部分蛋白質。這樣便可以將它用於動物飼料，作為營養添加劑使用。
一旦所有的乳清(2)通過了二氧化矽(6)，開啟閥門(10)，以便將20升第一種中性PH的洗滌溶液(4)送至吸附柱中，用左上角編號(11)表示。
二氧化矽(6)已吸附乳清(2)中的所需的金屬蛋白質。
一旦洗滌溶液(4)通過柱，即往貯罐(3)泵入15升第二種鹽溶液(12)，每升溶液含氯化鈉13克。
待到此第二種溶液(12)自由地流過吸附柱(11)，再開啟閥門，把洗滌液收集到水槽(14)中。隨後使用14升第三種鹽溶液(32)洗滌被吸附的二氧化矽(6，11)，此第三種鹽溶液來自貯罐(3)，每升溶液含氯化鈉45克。將它們回收在另一個水槽(15)內。
將水槽(14)中的溶液移入到另一個水槽(20)內，然後再從那裡移入一個超濾器(21)中，超濾器內注入一部分透析水(31)以便減小礦物質含量。使內容物流經有機膜(33)，膜孔徑相應於104道爾頓，溫度在12-50℃之間。
然後將水槽(15)中的內容物移入水槽(20)中，方法同上。
把得到的滲透液回收到(34)中，用於在其它洗脫步驟中重新利用。
截留物(22)在超濾器(21)的出口回收。藉助一個閥門(23)可以將這些截留物移到
冷凍乾燥器(24)，從中回收到大量所需的金屬蛋白質;
乾燥塔(35)，從中也回收到大量所需的金屬蛋白質;
最好是一種分級分離裝置(25)，在IBFBIOTECHNIX公司出售的，註冊商標為「SP-TRISACRYLLS」市售型號的有機凝膠上進行離子交換層析，把所需的兩種蛋白質進行分級分離，它們分別是乳鐵傳遞蛋白(26)和乳過氧化物酶(27)。
隨後用來自貯罐(3)的水(29)洗滌二氧化矽(6)。經過這次洗滌後，再進行一次酸洗(1/10N鹽酸溶液)。最後通過用20升PH5.5的醋酸鈉溶液滲濾，使二氧化矽(6)再生。
於是，從初始的400升乳清(2)中得到一方面，幾乎400升乳清提取液，適合直接用於動物飼料中，它保存有全部的營養價值;
另一方面·23·6克乳鐵傳遞蛋白，即79%的提取比率，其純度與此溶液中的其它蛋白質比較，至少為80%;
·2·8克乳過氧化物酶，即14%的提取比率，其純度高於50%。
實例二重複實例一，在透析水(31)中加入2g/l用抗壞血酸穩定的硫酸亞鐵銨。這樣便使所需的蛋白質達到鐵飽和狀態，這就提高了蛋白質的營養功效。
實例三重複實例一，並做下列變動。
首先是不用二氧化矽(6)，而用註冊商標為SP-SPHERODEX-LS的市售型號的帶孔隙二氧化矽顆粒，用量相同，顆粒壁包被一層二乙胺乙基葡聚糖，它是用磺基丙基鍵合的，其物理性質接近實例一的顆粒。
處理306升來自乾酪製備過程的新鮮乳清，PH為6.4，含乳鐵傳遞蛋白46.2mg/l和乳過氧化物酶44.7mg/l。把流量調至100升/小時。在貯罐(3)中盛入17升含氯化鈉3g/l的第一種溶液(4)。
洗脫液(12)由28升鹽溶液組成，氯化鈉濃度為15g/l，此洗脫液能回收1.23克乳鐵傳遞蛋白和0.6克乳過氧化物酶於(14)中。
第二種洗脫液(32)由27升濃度為45g/l氯化鈉的溶液組成，此洗脫液能回收2.7克乳鐵傳遞蛋白和5.1克乳過氧化物酶於(15)中。
最後，用另一種洗脫液(30)處理，它由21升濃度為60克/升的氯化鈉溶液組成。獲得4.0克乳鐵傳遞蛋白。
於是就能回收·7.93克乳鐵傳遞蛋白(收率為57%)·5.7克乳過氧化物酶(收率為42%)實例四重複實例一，不用乾酪製造中的新鮮乳清，代替它的是198升PH4.5的酪蛋白生產中的酸性乳清，乳鐵傳遞蛋白的含量為84.0mg/l，乳過氧化物酶含量為37.0mg/l。
乳清在含羧基的二氧化矽顆粒上面的流量調至100升/小時。
同前，用20升氯化鈉濃度為3g/l的溶液(4)洗滌。
第一次洗脫(12)用20升氯化鈉濃度為15g/l的溶液進行。獲得2.08克乳鐵傳遞蛋白和1.6克乳過氧化物酶。
第二次洗脫(32)用31升氯化鈉濃度為45g/l的溶液進行。獲得3.7克乳鐵傳遞蛋白。
於是回收到·5.78克乳鐵傳遞蛋白(收率為35%)，·1.6克乳過氧化物酶(收率為22%)。
實例五重複實例三，用180升酪蛋白生產中的PH4.5的酸性乳清，乳鐵傳遞蛋白的含量為87mg/l，乳過氧物化酶含量為33mg/l。
含鹽洗滌液(4)的氯化鈉濃度為3g/l，共12升。
第一次洗脫(12)用38升氯化鈉濃度為15g/l的溶液進行。獲得1.3克乳鐵傳遞蛋白和0.16克乳過氧化物酶。
第二次洗脫(32)用28升氯化鈉濃度為45g/l的溶液進行。獲得3.0克乳鐵傳遞蛋白和3.9克乳過氧化物酶。
於是便回收到·4.3克乳鐵傳遞蛋白(收率為27%)，·4.06克乳過氧化物酶(收率為69%)。
實例六這個實例說明按本發明所進行囊恢執恚詞僱蝗榍辶骶礁齟鬧扛鮒骱恢植煌偷畝躉榪帕＃潯詘渙艘徊惆坊嗵恰 第一個柱含有4千克與實例一相同的(羧基)CMSPHERODEXLS二氧化矽顆粒，用2.5小時滲濾250升乾酪製造中的新鮮乳清，乳清中的乳鐵傳遞蛋白含量為81.5mg/l，乳過氧化物酶的含量為52.0mg/l。
把經過如此處理的乳清盛入一個適當的貯罐內，然後用15升氯化鈉濃度為3g/l的水溶液(4)洗滌二氧化矽(6，11)。
接著先用15升氯化鈉濃度為13g/l的第一種溶液(12)洗脫，所收集的溶液中含1.87克乳過氧化物酶和0.85克乳鐵傳遞蛋白，然後再用16升氯化鈉濃度為45g/l的溶液進行第二次洗脫(32)，這時就可以收集到19.0克乳鐵傳遞蛋白。
如此收集到·19.85克乳鐵傳遞蛋白(收率為98%)·1.87克的乳過氧化物酶(收率為14%)。
第二個柱盛有2.5千克與實例三相同的SPSPHERODEXLS顆粒(磺基丙基)，用此柱滲濾250升經處理過的貯存乳清，乳清的流量為100升/小時。
這種乳清實際上不再含有乳鐵傳遞蛋白，但還含有乳過氧化物酶，含量為42.1mg/l。
經過滲濾後，用20.5升氯化鈉濃度為3g/l的溶液洗柱。
然後再用37升氯化鈉濃度為15g/l的溶液洗脫，獲得1.7克乳過氧化物酶。
接著用18升氯化鈉濃度為45g/l的溶液洗脫，獲得9.3克乳過氧化物酶。
結果，第二次處理獲得11克乳過氧化物酶，幾乎等於初始乳清中的總量(每升含13克中就被洗脫出11+1.87＝12.87克)。
換言之，在兩種型號不同的二氧化矽顆粒上連續兩次乳清滲濾操作，有可能從初始乳清中提取到幾乎全部的乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶。
實例七重複實例一，不用「CM-SPHERODEX-LS」二氧化矽，代替它的是一種「親水性的」帶孔隙二氧化矽，其物理性質實例一所示相同。在這種親水性帶孔隙的二氧化矽上包被著一層鍵合了羧甲基酸性基團的人工合成丙烯聚合物，符合序言中提到的FR-A-2，359，634的技術。
用300升PH6.4的新鮮乳清流過2.5千克的這種二氧化矽，流量為75升/小時，乳清中乳鐵傳遞蛋白含量為50.2mg/l，乳過氧化物酶含量為33.8mg/l。
洗脫後，獲得一方面，300升乳清(9)，可用作供家畜食用的營養素;
另一方面·120克各類蛋白質，主要含有免疫球蛋白，·7.1克乳鐵傳遞蛋白(對照實例一79%的收率，此處為47%)，對照80%的純度，此處為不足40%，·0.9克乳過氧化物酶(對照14.9%的收率，此處為9%)，對照實例一50%的純度，此處的純度低於30%。
這樣，這種乳鐵傳遞蛋白和這種乳過氧物化酶便與比例頗大的免疫球蛋白混合在一起，因此，必須把它們分離開來。
換言之，這種先有技術用於金屬蛋白質時，不僅收率明顯低，而且這些金屬蛋白質的純度也較差，於是這就需要以後進行一些純化操作。
實例八重複實例一，使用與實例1相同的帶孔隙二氧化矽，但包被的是IBF-BIOTECHNICS公司銷售的二乙胺乙基葡聚糖膜，商品名為DEAESPHERODEX-LS(專利US-A-4，673，734的技術)。
乳清中的主要蛋白質部分被結合，不包括所要的乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶，它們是與乳清(9)一起流走的。
最後這兩個實例很好地說明，按本發明所做的選擇有出人意料的效果。
利用包被了一種胺化的但沒有被鍵合的生物高分子，就得不到所需結果，即不能特異地提取乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶。
這樣，二氧化矽球粒雖然相同，但這裡用的球粒上麵包被了一層具有酸性官能團的人工合成高分子，使用這些二氧化矽球粒就可以收集到金屬蛋白質，但結合有其它蛋白質，收率和純度也都明顯不夠(參閱上文實例七)。
本發明的提取乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶的方法，與迄今所提出的方法是不同的，其區別主要表現在選擇性地提取這兩種蛋白質，這是一直難以提取的，因為這類蛋白質的數量極少，而且是與其它蛋白質混合在一起的;
操作簡便;
提取收率特別高，與先有技術收率相比，差不多高出兩倍(主要參閱實例七和八)。
提取到的金屬蛋白質純度高，無疑這是由於提取的特異性較高。
這樣回收的金屬蛋白質，即主要是如乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶這樣的結合鐵的金屬蛋白質，可以成功地用於已知的應用中，例如動物營養，以保護消化道和起到生長因子的作用;
獸醫領域，有抗腸道和乳房感染的活性;
人類飲食和營養，主要起運載鐵的作用;
製藥領域眼科學、胃腸學、牙科學、皮膚病學，婦科學等。
權利要求
1.從乳清中選擇性地提取金屬蛋白質的方法，在一種粒狀帶孔隙無機支持物上進行吸附，然後用一些溶液洗脫所吸附的金屬蛋白質，其特徵在於，所述顆粒的壁的表面包被了一層具有酸性官能團的胺化多糖。
2.權利要求1的方法，其特徵在於包被無機顆粒壁的多糖生物高分子是葡聚糖。
3.權利要求2的方法，其特徵在於葡聚糖是二乙胺乙基葡聚糖。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其特徵在於酸性基團是羧基或磺酸基。
5.權利要求4的方法，其特徵在於酸性基團是通過二價烴基結合在糖類生物高分子上。
6.權利要求5的方法，其特徵在於二價烴基是亞烷基。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其特徵在於帶孔隙無機顆粒是二氧化矽球粒，其性質如下粒度在10-1000μm之間;比表面積在1-400m2/g之間;平均孔徑在5-200nm之間。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其特徵在於，處理乳清，首先使之流經二氧化矽顆粒，顆粒壁表面包被了一層具有羧基的胺化多糖;其特徵還在於經過如此處理過的乳清，批量地流經二氧化矽顆粒，粒壁表面包被了另一層表面具有磺酸基的胺化多糖。
9.權利要求1的方法，其特徵在於乳清是新鮮乳清。
10.實施權利要求1-9中任一項的方法獲得的乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶。
全文摘要
從乳清中選擇性提取金屬蛋白質的方法，包括在顆粒狀無機支持物上進行吸附，然後用某些溶液洗脫所吸附的金屬蛋白質，其特徵在於，所述顆粒的壁在其表面包被了一層具有酸性官能團的胺化的多糖。
文檔編號A23L1/08GK1030005SQ8810362
公開日1989年1月4日 申請日期1988年6月17日 優先權日1987年6月19日
發明者雅克·法蘭金內, 安德烈·佩羅澤, 弗朗索瓦·斯普林 申請人:昂特勒芒股份有限公司, 埃爾夫阿奎坦國家石油公司