沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩選方法

2023-05-12 04:49:26 1

專利名稱：沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種生化技術領域的血清的篩選方法，具體是一種沙門氏菌血清組鑑 定靶點的篩選方法。
背景技術：
沙門氏菌(Salmonella)是食源性致病菌中一個重要屬。全世界已分離出的沙門 氏菌有2500多種血清型，我國約有300種血清型，分屬42個血清組，但與人類疾病相關的 血清型主要集中於A E血清組，其中A D組的致病沙門氏菌佔到70 %。對沙門氏菌 進行血清分型鑑定是流行性病學鑑定研究的重要內容，可以監測疾病的爆發和傳播以及控 制疾病流行有著重要作用。目前，沙門氏菌的分離、鑑定與分型，主要是採用國標的方法 (GBT4789. 4-2008)，依據沙門氏菌的生化反應，以及抗原抗體凝集反應進行分型鑑定的。盡 管以血清學為基礎的鑑定方法可以得到比較可靠的分型結果，但是免疫反應十分複雜，費 時費力，價格昂貴，對於一些粗糙型菌株和喪失抗原表達的分離株則不能鑑定。而以PCR方 法為基礎的沙門氏菌血清組鑑定方法快速、高效，可避免血清鑑定的不足。這一方法所使用 的鑑定靶點主要是來自於沙門氏菌0抗表達相關的rfb基因簇中的某些基因。自Luk J.M.， Kongmuang U.，Reeves P. R. ^Λ ((Journal of ClinicalMicrobiology)) ( I臨 學雜誌)1993年第31卷第8期第2118 2213頁發表的題為《Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)bypolymerase chain reaction for identification of Salmonella major serogroups (A, B, C2, and D)》(通過 PCR 選擇性 擴增β _脫氧巖藻糖和泊雷糖合成酶基因(rfb)鑑定沙門氏菌主要血清組(A，B，C2和D)) 之後，許多研究學者至今仍在沿用這些靶點。沙門氏菌的rfb基因簇具有很高的多態性，除 了血清組A和D基因簇的DNA序列非常相似外，其他的血清組間差異很大，即使是同一血清 組，rfb基因簇上的DNA序列也會會千差萬別，例如血清組E。因此，在選擇靶點前，需要了 解各個血清組rfb基因簇中基因的序列及排列次序，這使得選擇特定血清組的鑑定靶點困 難重重。由於目前各個血清組的靶點單一，不易設計用於PCR方法鑑定的多重引物，因此檢 測方法多數是用檢測晶片鑑定，使得鑑定成本過於高昂。經對現有技術的文獻檢索發現，尚未發現與本發明的主題「沙門氏菌血清組鑑定 靶點的篩選方法」有關的報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩 選方法。本發明的方法實施簡便、結果準確，能夠為以多重PCR技術為基礎的基因檢測方法 提供可靠的特異靶點。本發明是通過以下的技術方案實現的，本發明包括如下步驟步驟一，獲取已經測序完成的沙門氏菌的基因組DNA序列，按照沙門氏菌的血清 型進行分類，拼接每種血清型下的所有基因組DNA序列，得長序列，利用BLASTN軟體格式化成BLASTN程序文件；步驟二，從目標血清型中選擇一個代表菌株，切割其基因組DNA序列，得到小片 段，將所有小片段與該血清型對應的長序列進行比對，選擇E值趨近於0的DNA片段；之後 將得到的DNA片段與其餘血清型對應的長序列分別進行比對，選擇最終E值均> 1的DNA 片段；步驟三，以步驟二最終所得DNA片段為模板，設計引物；利用引物擴增每種血清型 下對應的所有基因組DNA，檢測擴增產物；只有屬於目標血清型的基因組DNA序列能擴增到 特異擴增條帶時，則相應DNA片段為目標血清型的特異靶點。步驟二中，所述代表菌株具體為沙門氏菌A血清組為甲型副傷寒沙門氏菌 (S. ParatypiA) ATCC 9150，沙門氏菌B血清組為鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium) LT2,沙 門氏菌Cl血清組為豬霍亂沙門氏菌(S. Choleraesuis) SC-B67，沙門氏菌C2血清組為紐波 特沙門氏菌(S. Newport) SL254，沙門氏菌D血清組為傷寒沙門氏菌(S. Typhi) CT18。步驟二中，所述切割具體為以200 IOOObp為單元進行切割，每切割完一次，向 後移動1 lOOObp，進行二次切割，依次類推，直至基因組序列被切割完畢。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果利用本發明的方法能夠大規模篩 選沙門氏菌血清組的特異靶點，結果準確；並且，本發明的方法步驟簡單，操作方便，所需基 因組數據和對比軟體均可從公共資料庫中獲得，篩選快捷，避免了盲目選擇靶點或者是所 選擇的靶點特異性不強等缺陷。


圖1篩選特異靶點的示意圖。本發明涉及的菌株公開信息如下S. Paratypi A str. ATCC 9150在如下文獻中公開(McClelland Μ, SandersonKE, Clifton SW等人在《Nature Genetics))(自然一遺傳學)2004年第36卷12期第1268 1274 Μ^fitJIS^J ((Comparison of genome degradation in Paratyphi A andTyphi, human-restricted serovars of Salmonella enterica that cause typhoid〉〉(只弓|起人 類傷寒的沙門氏菌血清型——甲型副傷寒和傷寒沙門氏菌的基因組退化的比較))；S. Typhimurium str. LT2 在如下文獻中公開(McClelland Μ, Sanderson KE, Spieth J等人在《Nature》(自然)2001年第413卷第6858期第852 856頁上發表的 題為((Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)) (鼠傷寒沙門氏菌LT的全基因組序列))；S. Choleraesuis str. SC-B67在如下文獻中公開(Chiu CH, Tang P, Chu C等人在 ((Nucleic Acids Research))(核酸研究)2005年第33卷第5期第1690 1698頁上發表的 M為〈〈The genome sequence of Salmonella enterica serovar Choleraesuis, a highly invasive and resistant zoonotic pathogen》(一種高侵染性、高抗性的人畜共患致病 菌——豬霍亂沙門氏菌的基因組序列))；S. Newport str. SL254在如下文獻中公開(Welch TJ,Fricke WF，McDermottPF等 人在《PLoS One))(公共科學圖書館·綜合)2007年第2卷第3期第309網頁上發表的題 為〈〈Multiple antimicrobial resistance in plague :an emerging publichealth risk))(多重耐藥性的瘟疫一種新興的公共健康風險))；S. Typhi str. CT18 在如下文獻中公開(Parkhill J, Dougan G，James KD 等人在 ((Nature))(自然)2001年第413卷第6858期第848 852頁上發表的題為《Completegenome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar TyphiCT18)) (傷寒沙門氏菌CT18的全基因組序列))。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例步驟一，資料庫的建立分別從NCBI (the National Center for Biotechnologylnformation), Sanger 石if 究院(the Sanger Institute),美國伊禾丨J i若斯 州大學(theUniversity of Illinois)和美國華盛頓大學基因組測序中心(the Genome SequencingCenter of Washington University)提供的基因組資料庫中下載沙門氏菌的 基因組DNA序列，共下載25株沙門氏菌的全基因組DNA序列；所有下載的基因組序列都按照沙門氏菌各自的血清組分屬的血清組進行分類，除 A、B、Cl、C2和D血清組之外的其他沙門氏菌基因組DNA歸類於一組，命名為Others，下載 菌株名稱、數據來源和分類情況都列於表1中，注*為每一血清組的代表菌株，在步驟二 中將其基因組序列切割為小的片段。將每一個血清組資料庫中所有測序沙門氏菌菌株的 基因組DNA序列拼接到一個TXT文件中，分別將6個血清組的基因組DNA序列所拼接成的 TXT 文件命名為 A-databank, txt、B-databank. txt、Cl-databank. txt、C2_databank. txt、 D-databank. txt和Others-databank, txt。這6個文件經軟體BLASTN格式化為後，每個文 件形成一組後綴名nhr、nin、nSd、nSi和nsq的文件，資料庫建立完畢。表1下載的沙門氏菌菌株全基因組序列及其分屬的資料庫地址 步驟二，特異靶點的篩選分別選 S. Paratypi A str. ATCC 9150 (McClelland Μ, Sanderson KE, Clifton SW 等人在《Nature GeneticsK 自然-遺傳學)2004 年第 36 卷 12 期第 1268 1274 頁上發表的題為((Comparison of genome degradation inParatyphi A and Typhi, human—restricted serovars of Salmonella enterica thatcause typhoid)) (只引起人類傷寒的沙門氏菌血清型——甲型副傷寒和傷寒沙門氏菌的基因組退化的比 較))、S. Typhimurium str. LT2 (McClelland Μ, Sanderson KE, SpiethJ 等人在《Nature》 (自然)2001年第413卷第6858期第852 856頁上發表的題為《Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2))(鼠傷寒沙門氏菌 LT 的 全基因組序列))、S. Choleraesuis str. SC-B67 (Chiu CH, Tang P, Chu C 等人在《NucleicAcids Research))(核酸研究)2005年第33卷第5期第1690 1698頁上發表的題為《The genome sequence of Salmonella entericaserovar Choleraesuis, a highly invasive
and resistant zoonotic pathogen》(一種高侵染性、高抗性的人畜共患致病菌-豬
霍亂沙門氏菌的基因組序列))、S. Newport str. SL254(Welch TJ, Fricke WF, McDermott PF等人在《PLoS One))(公共科學圖書館·綜合)2007年第2卷第3期第309網頁上發表 的題為((Multipleantimicrobial resistance in plague :an emerging public health risk))(多重耐藥性的瘟疫一種新興的公共健康風險))和S. Typhi str. CT18 (Parkhill J, DouganG, James KD等人在《Nature》(自然)2001年第413卷第6858期第848 852 頁上發表的題為((Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonellaenterica serovar Typhi CT18》(傷寒沙門氏菌CT18的全基因組序列))作為 A、B、C1、C2和D5個沙門氏菌血清組的代表菌株。然後，分別將這5株菌的基因組DNA序列 切割為IOOObp的DNA片段。以血清組A為例說明，通過計算機軟體讀取儲存S. ParatypiA str. ATCC 9150 的 IOOObp 片段 DNA 序列的 TXT 文件，調用 BLASTN 程序與 A-databank, txt 文件中的所有A組的基因組DNA序列進行BLASTN比對，篩選出A組的較為保守的片段。 然後這些保守片段再分別與B、Cl、C2、D和Others這5個血清組的基因組DNA分別進行 BLASTN比對，再篩選出血清組A的特異片段來，作為候選特異靶點。其他血清組的代表菌株 S. Typhimurium str. LT2、S.Choleraesuis str. SC-B67、S.Newport str.SL254 禾口 S. Typhi str. CT18的基因組DNA序列分別被分割為IOOObp的片段之後，經過同樣的方式篩選出血清 組B、Cl、C2和D的各自的候選特異靶點來，所有篩選靶點列於表2中；表2血清組A、B、Cl、C2和D的特異候選靶點 步驟三，特異靶點的鑑定分別將所有候選的特異靶點的序列輸入引物設計軟體 Primer Premier 5. 0中，按照軟體設計引物的原則設定參數，從備選的引物中選擇出評分 較優的引物。引物序列列於表3中。這些引物經合成後，以不同血清組的沙門氏菌(15株 標準菌株和30株分離菌株)的DNA為模板，分別進行PCR擴增。所選沙門氏菌菌株及PCR 擴增結果列於表4中，注+代表陽性結果，-代表陰性結果。從表4的結果中可以知道，由 候選靶點設計的引物，都能夠準確的檢測出相應血清組的沙門氏菌。本實施例中，所發掘的 靶點均是新的靶點，經PCR驗證，具有相應的血清組特異性，這表明本實施例的靶點篩選方 法是準確可靠的。表3血清組A、B、Cl、C2和D的引物及序列 表4沙門氏菌菌株及PCR擴增結果
權利要求
一種沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩選方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一，獲取已經測序完成的沙門氏菌的基因組DNA序列，按照沙門氏菌的血清型進行分類，拼接每種血清型下的所有基因組DNA序列，得長序列，利用BLASTN軟體格式化成BLASTN程序文件；步驟二，從目標血清型中選擇一個代表菌株，切割其基因組DNA序列，得到小片段，將所有小片段與該血清型對應的長序列進行比對，選擇E值趨近於0的DNA片段；之後將得到的DNA片段與其餘血清型對應的長序列分別進行比對，選擇最終E值均＞1的DNA片段；步驟三，以步驟二最終所得DNA片段為模板，設計引物；利用引物擴增每種血清型下對應的所有基因組DNA，檢測擴增產物；只有屬於目標血清型的基因組DNA序列能擴增到特異擴增條帶時，則相應DNA片段為目標血清型的特異靶點。
2.根據權利要求1所述的沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩選方法，其特徵是，步驟二中， 所述代表菌株具體為沙門氏菌A血清組為甲型副傷寒沙門氏菌ATCC 9150，沙門氏菌B血 清組為鼠傷寒沙門氏菌LT2，沙門氏菌Cl血清組為豬霍亂沙門氏菌SC-B67，沙門氏菌C2血 清組為紐波特沙門氏菌SL254，沙門氏菌D血清組為傷寒沙門氏菌CT18。
3.根據權利要求1所述的沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩選方法，其特徵是，步驟二中， 所述切割具體為以200 IOOObp為單元進行切割，每切割完一次，向後移動1 lOOObp， 進行二次切割，依次類推，直至基因組序列被切割完畢。
全文摘要
一種食品安全技術領域的沙門氏菌血清組鑑定靶點的篩選方法，包括如下步驟獲取所有沙門氏菌的基因組DNA序列，按照血清型進行分類，拼接，得長序列，格式化成BLASTN程序文件；從目標血清型中選擇一個代表菌株，切割其基因組DNA序列，得到小片段，將所有小片段與該血清型對應的長序列進行比對，選擇E值趨近於0的DNA片段；之後將得到的DNA片段與其餘血清型對應的長序列分別進行比對，選擇最終E值均＞1的DNA片段；以步驟二最終所得DNA片段為模板，設計引物，擴增所有基因組DNA，檢測擴增產物；只有屬於目標血清型的基因組DNA序列能擴增到特異擴增條帶時，則相應DNA片段為目標血清型的特異靶點。本發明的方法實施簡便、結果準確，能夠提供可靠的特異靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101928772SQ20101011890
公開日2010年12月29日 申請日期2010年3月8日 優先權日2010年3月8日
發明者劉斌, 史賢明, 張利達, 施春雷, 朱東升 申請人:上海交通大學