喹唑啉衍生物、其製備方法及其作為抗有絲分裂劑的用途以及包含所述衍生物的藥物組合物的製作方法

2023-05-12 03:05:01

專利名稱：喹唑啉衍生物、其製備方法及其作為抗有絲分裂劑的用途以及包含所述衍生物的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及喹唑啉衍生物、其製備方法、包含所述的喹唑啉衍生物的藥物組合物以及所述的喹唑啉衍生物作為抗有絲分裂劑從而用於治療疾病諸如癌症的用途。
幹擾有絲分裂的抗癌藥例如長春花屬生物鹼類、紫杉醇和埃坡黴素在惡性疾病的治療中起著主要作用。它們的主要缺點之一是它們均針對相同的蛋白質——微管蛋白，它是形成有絲分裂紡錘體的微管的亞單位。然而，微管還參與許多其它細胞過程諸如維持細胞器、細胞形狀、細胞活力、突觸泡和細胞內的轉運現象。幹擾它們的形成或解聚經常導致劑量限制性的毒性副作用。
蛋白質的新種類、有絲分裂驅動蛋白的發現提供了一種治療癌症的新方法。這些蛋白質專門涉及有絲分裂紡錘體的形成和功能，其中的一些蛋白質僅僅在增殖的細胞中表達。對它們的抑制作用導致細胞周期停止並最終導致細胞凋亡，但不會干擾其它的微管依賴型過程。
有絲分裂驅動蛋白Eg5(人驅動紡錘體蛋白(KSP)的南非有爪蟾蜍類似物)在有絲分裂的早期階段起著重要作用。它介導中心體的分離和兩極有絲分裂紡錘體的形成。對Eg5的抑制作用導致細胞周期在有絲分裂過程中停止，並且產生具有單極紡錘體的細胞，即所謂的monoasters。在1999年，通過對大量合成化合物的文庫進行篩選，發現了第一種小分子的Eg5抑制劑monastrol，即4-(3-羥基苯基)-5-乙氧基羰基-6-甲基-3，4-二氫嘧啶-2(1H)(Mayer，T.U.，Kapoor，T.M.，Haggarty，S.J.，King，R.W.，Schreiber，S.L.和Mitchison，T.J.(1999)。Small Molecule Inhibitor of Mitotic SpindleBipolarity Identified in a Phenotype-Based Screen.Science 289，971-974)。Monastrol是有絲分裂驅動蛋白Eg5的變構抑制劑(Maliga，Z.，Kapoor，T.M.和Mitchison，T.J.(2002)。「Monastrol是有絲分裂驅動蛋白Eg5的變構抑制劑的證據」。ChemistryBiology 9，989-996)，它的結合位點與蛋白質的核苷酸結合位點相距約12。在結合過程中，monastrol引起了整個運動結構域的局部以及遠端的結構改變(Yan，Y.，Sardana，V.，Xu，B.，Homnick，C.，Halczenko，W.，Buser，C.A.，Schaber，M.，Hartman，G.D.，Huber，H.E.和Lawrence，C.K.(2004)。Inhibition of a Mitotic MotorProteinWhere，How and Conformational Consequences.J.Mol.Biol.335，547-554)。同時還公布了Eg5的四種其它抑制劑Terpendole E、S-三苯甲基-L-半胱氨酸、HR22C16和CK0106023，以及其它喹唑啉-4-酮衍生物(Nakazawa，J.，Yajima，J.，Usui，T.，Ueli，M.，Takatsuki，A.，Imoto，M.，Toyoshima，Y.Y.和Osada，H.(2003)。「Terpendole E對有絲分裂驅動蛋白Eg5的運動活性的新作用」。Chem.Biol.10，131-137；DeBonis，S.，Skoufias，D.A.，Lebeau，L.，Lopez，R.，Robin，G.，Margolis，R.L.，Wade，R.H.和Kozielski，F.(2004)。「具有抗有絲分裂和抗腫瘤活性的人有絲分裂驅動蛋白Eg5抑制劑的體外篩選」。Mol.Cancer.Ther.3，1079-1090)；Hotha，S.，Yarrow，J.C.，Yang，J.G.，Garrett，S.，Renduchintala，K.V.，Mayer，T.U.和Kapoor，T.M.(2003)。「HR22C16細胞分裂動力學的有效的小分子探針」。Angew.Chem.115，2481-2484；Sakowicz，R.，Finer，J.T.，Beraud，C.，Crompton，A.，Lewis，E.，Fritsch，A.，Lee，Y.，Mak，J.，Moody，R.，Turincio，R.，Chabala，J.C.，Gonzales，P.，Roth，S.，Weitman，S.和Wood，K.W.(2004)。「驅動蛋白抑制劑的抗腫瘤活性」。Cancer Res.64，3276-3280；WO-A 01/98278)。WO-A 02/078639描述了其它在結構上與Monastrol類似的Eg5抑制劑。
US 6,177,432 B1描述了抑制法尼基轉移酶的喹唑啉酮化合物，據說它可用於抑制腫瘤生長。在其6-位上，所述的喹唑啉酮具有可進一步被苯基和咪唑基取代的甲基。
EP 0564397A1描述了作為製備5H-噻唑並[2，3-b]喹唑啉或喹唑啉的硫代烷基化衍生物的合成中間體的喹唑啉類化合物。
DD 251974A1描述了製備喹唑啉衍生物的方法。在其4-位上，這些喹唑啉化合物或者是未取代的，或者具有氯取代基。
Sabitha等人(Tetrahedron Letters 44(2003)6497-6499)提出了用於製備二氫嘧啶-(2H)-酮的氯化釩(III)催化劑的Biginelli縮合。
Moustafa等人(CA資料庫[在線]Chemical Abstracts Service，Columbus，Ohio，US；資料庫收錄號1995782507)描述了烯酮的雜環化。其中提到了3，4，5，6，7，8-六氫-4-(3-羥基苯基)-2(1H)-喹唑啉酮。
Mayer等人(CA資料庫[在線]Chemical Abstracts Service，Columbus，Ohio，US；資料庫收錄號1998454206)描述了4-芳基-4，6，7，8-四氫-1H，3H-喹唑啉-2，5-二酮的電子碰撞誘導的裂解。其中提到了4-(2-氟苯基)-4，6，7，8-四氫-2，5(1H，3H)-喹唑啉二酮。
Daqiang Xu等人(Tetrahedron Asymmetrie，Vol，7，pp.747-754，1996)描述了(R)-3-甲基-5-苯基-5H-噻唑並[2，3-b]喹唑啉的合成。3，4-二氫-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮被用作合成中間體。
本發明的目的是提供另外的可用作抗有絲分裂劑的化合物。
令人驚奇的是，現已發現某些喹唑啉衍生物是用於體外抑制Eg5以及用於使培養的細胞停止有絲分裂的有效的化合物。
因此，本發明涉及式(I)的喹唑啉衍生物或其可藥用鹽 其中R1表示苯基或6元雜芳基，它們任選地被1-5個相同或不同的選自下列的取代基所取代滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基；X 表示S或O；
A 與它們所連接的碳原子一起形成5-、6-或7-元的、部分不飽和的或芳香族的同素環或雜環，它們可帶有最多10個相同或不同的選自下列的取代基滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代(thio)、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基和二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基。
按照一個具體的實施方案，以下化合物不包括在式(I)的喹唑啉衍生物中3，4-二氫-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-氯-3，4-二氫-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-甲基-3，4-二氫-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；7-甲基-3，4-二氫-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-氯-3，4-二氫-4-(2-氯苯基)-2(1H)-喹唑啉硫酮；3，4-二氫-4-(4-氯苯基)-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-溴-3，4-二氫-4-(2-氟苯基)-2(1H)-喹唑啉硫酮；7-氯-3，4-二氫-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；3，4，5，6，7，8-六氫-4-(3-羥基苯基)-2(1H)-喹唑啉酮；4，6，7，8-四氫-4-(2-氟苯基)-2，5(1H，3H)-喹唑啉二酮。
按照另一個具體的實施方案，以下化合物也不包括在式(I)的喹唑啉衍生物中7，7-二甲基-4-苯基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(2-硝基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(4-氟苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮；
7，7-二甲基-4-(4-羥基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(3-苯氧基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮。
按照另一個具體的實施方案，以下化合物也不包括在式(I)的喹唑啉衍生物中可通過氯化釩(III)催化的5，5-二甲基環己-1，3-二酮(二甲基環己二酮)與脲或硫脲和下列醛之一的Biginelli縮合得到的喹唑啉衍生物苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、4-氯苯甲醛、2-硝基苯甲醛、噻吩-2-醛、4-氟苯甲醛、4-羥基苯甲醛、3-苯氧基苯甲醛(參見Sabitha等人，(2003)，上文)。
在以上式(I)給出的符號定義中，使用通常表示以下取代基的集合術語滷素氟、氯、溴或碘；C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基、二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基的烷基部分含有1-6個碳原子、特別是1-4個碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基，諸如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基或戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二-甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基；C1-C6-滷代烷基和C1-C6-滷代烷氧基的滷代烷基部分含有1-6個碳原子、特別是1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基(如上所述)，其中這些基團中的氫原子可部分地或完全被如上所述的滷素原子所代替，例如C1-C2-滷代烷基、諸如氯甲基、溴甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯氟甲基、二氯氟甲基、氯二氟甲基、1-氯乙基、1-溴乙基、1-氟乙基、2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2，2-二氟乙基、2，2-二氯-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基和五氟乙基；5-、6-或7-元的同素環單-或二環烴環；其是不飽和的、包括部分不飽和，例如單不飽和和芳香族的；所述的同素環尤其包括6-元芳環(芳基)，諸如苯(苯基)；5-元碳環(碳環基)、諸如環戊烯(基)、環戊-1，3-二烯(基)；6-元碳環(碳環基)、諸如環己烯(基)、環己-1，3-二烯(基)和環己-1，4-二烯(基)；7-元碳環(碳環基)、諸如環庚烯(基)、環庚-1，3-二烯(基)、環庚-1，4-二烯(基)、環庚-1，5-二烯(基)和環庚-1，3，5-三烯(基)；5-、6-或7-元雜環含有1-4個選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子的單-或二環烴環；其是不飽和的、包括部分不飽和，例如單不飽和和芳香族的；所述的雜環尤其包括5-元芳香族雜環(雜芳基)，其含有1-4個氮原子或1-3個氮原子和1個硫或氧原子除了碳原子之外，5-元雜芳基還含有1-4個氮原子或1-3個氮原子和1個硫或氧原子作為環的成員，例如，呋喃(-2-基)、呋喃(-3-基)、噻吩(-2-基)、噻吩(-3-基)、吡咯(-2-基)、吡咯(-3-基)、異唑(-3-基)、異唑(-4-基)、異唑(-5-基)、異噻唑(-3-基)、異噻唑(-4-基)、異噻唑(-5-基)、吡唑(-3-基)、吡唑(-4-基)、吡唑(-5-基)、唑(-2-基)、唑(-4-基)、唑(-5-基)、噻唑(-2-基)、噻唑(-4-基)、噻唑(-5-基)、咪唑(-2-基)、咪唑(-4-基)、1，2，4-二唑(-3-基)、1，2，4-二唑(-5-基)、1，2，4-噻二唑(-3-基)、1，2，4-噻二唑(-5-基)、1，2，3-三唑(-2-基)、1，2，4-三唑(-3-基)、四唑(基)、1，3，4-二唑(-2-基)、1，3，4-噻二唑(-2-基)和1，3，4-三唑(-2-基)；6-元芳香族雜環(雜芳基)，其含有1-4個氮原子除了碳原子之外，6-元雜芳基還含有1-3個或1-4個氮原子作為環的成員，例如、吡啶(-2-基)、吡啶(-3-基)、吡啶(-4-基)、噠嗪(-3-基)、噠嗪(-4-基)、嘧啶(-2-基)、嘧啶(-4-基)、嘧啶(-5-基)、吡嗪(-2-基)、1，2，3-三嗪(基)、1，3，5-三嗪(-2-基)和1，2，4-三嗪(-3-基)；5-和6-元雜環(雜環基)，其含有1-4個氮原子或1-3個氮原子和1個硫或氧原子例如、吡唑烷(-3-基)、吡唑烷(-4-基)、吡唑烷(-5-基)、2-吡咯烷(-2-基)、2-吡咯烷(-3-基)、3-吡咯烷(-2-基)、3-吡咯烷(-3-基)、哌啶(-1-基)、哌啶(-2-基)、哌啶(-3-基)、哌啶(-4-基)、吡啶(1，2-二氫)-2-酮(-1-基)、哌嗪(-2-基)、嗎啉(-4-基)、硫代嗎啉(-4-基)。
在式(I)化合物中，R1代表任選取代的苯基或任選取代的6-元雜芳基。苯基或雜芳基可帶有最多5個、優選最多3個相同或不同的取代基。根據一個具體的實施方案，苯基或雜芳基在鄰位或間位可帶有至少一個取代基。特別優選單取代的苯基或雜芳基。
苯基或雜芳基上的取代基選自滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基。尤其優選選自下列的取代基滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、甲基、甲氧基、甲硫基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、乙醯基、甲氧基羰基和甲氧基羰基氧基。甚至更優選的取代基選自滷素、尤其是氟或硝基和羥基。
根據一個具體的實施方案，本發明涉及式(I)的喹唑啉衍生物，其中R1代表取代的苯基。因此，R1在式(I)中表示式(II)的基團 其中L1至L5獨立地表示滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基，並且#表示與喹唑啉核連接的鍵，其中L1至L5中的至少一個不是氫。
尤其優選以下定義的化合物其中在式(II)中L1和L2中的至少一個不是氫。特別優選的是其中在式(I)中R1表示式(IIa)的基團的化合物 其中L2如以上所定義(但不是氫)。
根據優選的實施方案，本發明涉及式(I)的喹唑啉衍生物，其中R1是3-羥基苯基。
在式(I)化合物中，X可以是硫原子或氧原子。因此，本發明涉及3，4-二氫嘧啶-2(1H)-酮或3，4-二氫嘧啶-2(1H)-硫酮衍生物，尤其涉及喹唑啉-2(1H)-硫酮(X＝S)或喹唑啉-2(1H)-酮(X＝O)衍生物。尤其優選硫酮衍生物。
在式(I)化合物中，A形成與3，4-二氫嘧啶-2(1H)-酮或3，4-二氫嘧啶-2(1H)-硫酮部分稠合的環。所述的稠環可以是5-、6-或7-元環，但尤其優選其中的稠環是6-元(喹唑啉)的式(I)化合物。按照一個具體的實施方案，本發明涉及式(Ia)的喹唑啉衍生物 其中R1和X如以上所定義，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基，或者R3與R5一起、R5與R7一起和/或R7與R9一起形成鍵，或者R2與R3一起、R4與R5一起、R6與R7一起和/或R8與R9一起形成氧代或硫代基基團。
由於3，4-二氫嘧啶部分的雙鍵，所以該稠環是不飽和的。這包括部分不飽和、尤其是單不飽和的和芳香族的環。
根據一個具體的實施方案，本發明涉及式(Ia)化合物，其中R8與R9一起形成氧代基團，即，下式(Ib)的5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫-喹唑啉-2(1H)-硫酮或5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫-喹唑啉-2(1H)-酮衍生物 其中R1和X如以上所定義，R2、R3、R4、R5、R6、R7獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基，或者R3與R5一起或R5與R7一起形成鍵，或者R2與R3一起、R4與R5一起和/或R6與R7一起形成氧代或硫代基團。
根據另一個具體的實施方案，本發明涉及式(Ia)化合物，其中R8是氫且R9是羥基，即下式(Ic)的5-羥基-3，4，5，6，7，8-六氫-喹唑啉-2(1H)-硫酮或5-羥基-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮衍生物
其中R1和X如以上所定義，R2、R3、R4、R5、R6、R7獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基，或者R3與R5一起或R5與R7一起形成鍵，或者R2與R3一起、R4與R5一起和/或R6與R7一起形成氧代或硫代基團。
根據另一個具體的實施方案，本發明涉及式(Ia)化合物，其中R3與R5一起以及R7與R9一起形成鍵，即，下式(Id)的3，4-二氫-喹唑啉-2(1H)-硫酮或3，4-二氫-喹唑啉-2(1H)-酮衍生物 其中R1和X如以上所定義，R2、R4、R6、R8獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基。
除了以上所述的其中A形成同素環的式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)化合物之外，本發明還涉及其中A與它們所連接的碳原子一起形成雜環的式(I)的喹唑啉衍生物。這包括例如下式(Ie)的化合物
其中Q是O或NH，R1、R2、R3、R4、R5和X如以上所定義。
在式(I)化合物中，稠環可帶有最多10個相同或不同的取代基。尤其優選其中的烷基部分具有1-3個碳原子的上述取代基。尤其是所述的取代基選自滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、甲基、甲氧基、甲硫基、甲基氨基、二甲基氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、氨基甲醯基、乙醯基、甲氧基羰基、甲基羰基氧基、甲基氨基羰基、二甲基氨基羰基、甲基亞磺醯基、甲基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、甲基氨基磺醯基和二甲基氨基磺醯基。甚至更優選的是選自滷素、尤其是氟、氯或溴、甲基和甲氧基的取代基。
根據一個具體的實施方案，本發明涉及式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Ie)的化合物，其中R2、R3、R4和R5中的至少一個不是氫。尤其優選其中的R2和R3是氫且R4和R5都是甲基的式(Ib)、(Ic)或(Ie)的化合物。
根據另一個具體的實施方案，本發明涉及式(Id)化合物，其中R2、R4和R6中的至少一個不是氫。尤其優選以下所定義的式(Id)化合物，其中R2是氫、甲基或甲氧基，R4是氫或滷素、尤其是氟或氯且R6是氫或滷素、尤其是氯或溴。
最優選的是下表1所包括的化合物
表1式(Ia)化合物
本發明化合物的鹽包括優選與可藥用酸或鹼所形成的酸加成鹽和鹼加成鹽。尤其優選與無機或有機酸諸如鹽酸、氫溴酸和氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸、對甲苯磺酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、苯甲酸、馬來酸和通常用於形成可藥用酸加成鹽的其它酸所形成的鹽。鹼加成鹽包括本發明化合物與無機鹼諸如鹼金屬和鹼土金屬氫氧化物或碳酸鹽或與有機鹼例如胺諸如一-、二-或三乙醇胺所形成的鹽。
如果本發明化合物具有非對稱中心，則包括混合物或純淨形式(對映體、非對映體)的外消旋物和旋光異構體。
本發明的喹唑啉衍生物可以互變異構形式存在。該形式(儘管未明確表示在本文所提出的化學式中)也已經被公開並包括在本發明的範圍內。例如，本領域技術人員將很容易地意識到3，4-二氫嘧啶-2(1H)-酮或3，4-二氫嘧啶-2(1H)-硫酮部分可產生以下所示的互變異構體。
本發明化合物可按照本領域已知的方式來得到。
根據一個具體的實施方案，式(Ia)化合物(其中R8與R9一起形成氧代基團)、尤其是式(Ib)化合物可通過Biginelli反應通過將適當的醛(IV)、脲或硫脲(V)和適當的1，3-二羰基化合物(III)以及聚磷酸酯(PPE)一起照射、例如在微波爐中照射來得到(Ranu，B.C.，Hajra，A.和Dey，S.S.(2002)。「無需任何溶劑或催化劑的合成二氫嘧啶酮的實用和綠色的途徑」。Org.Process Res.Dev.6，817-818；Cava，M.P.，Lakshmikantham，M.V.和Mitchell，M.J.(1969)。「Caseadine甲基醚的合成」。Org.Chem.34，2665-2667；Kappe，C.O.和Falsone，S.F.(1998)。「聚磷酸酯介導的二氫嘧啶的合成。Biginelli反應的改進的條件」。Synlett，718-720；Kappe，C.O.，Kumar，D.和Varma，R.S.(1999)。「利用無溶劑的Biginelli縮合法藉助微波高速平行合成4-芳基-3，4-二氫嘧啶-2(1H)-酮的方法」。Synthesis，1799-1803；Kappe，C.O.，Shishkin，O.V.，Uray，G和Verdino，P.(2000)。「有絲分裂驅動蛋白Eg5抑制劑Monastrol的X射線結構、構象分析、對映體分離和絕對構型的確定」。Tetrahedron 56，1859-1862；Sabitha(2003)，同上)。將該合成方法概述在以下方案1中 在所述的方案以及下面的方案中，殘基R1*、R2*、R3*、R4*、R5*、R6*、R7*、R8*、X*可以具有關於殘基R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、X所示的含義。但是，所述的殘基還可具有其它含義，尤其是可以表示通過已知的化學反應諸如保護、脫保護等可轉化成基團R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、X的基團。
因此本發明涉及製備式(Ib)的喹唑啉衍生物的方法，該方法包括(i)將式(III′)化合物 其中R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6)烷基氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基，或R3a與R5a一起或R5a與R7a一起形成鍵，或者R2a與R3a一起、R4a與R5a一起和/或R6a與R7a一起形成氧代或硫代基團，其中R2a、R3a、R4a、R5a、R6a和/或R7a可用適當的保護基進行保護，與式(IV′)化合物反應 其中R1a表示苯基或6元雜芳基，它們任選地被1-5個相同或不同的選自下列的取代基所取代滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基，其中R1a可用適當的保護基進行保護，然後與式(V)化合物在聚磷酸酯的存在下進行反應 其中X表示S或O；(ii)按照本領域已知的方式例如除去保護基將形成的式(Ib′)化合物 其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a和X如以上所定義，任選地轉化成所需的式(Ib)的喹唑啉衍生物；然後(iii)回收所需的喹唑啉衍生物。
此外，式(Ib)化合物還可通過還原、例如通過選擇性Luche還原5-羰基官能團而轉化成相應的式(Ic)的醇(Gemal，A.L.和Luche，J.-L.(1981)。「有機合成中的鑭系元素。6.用硼氫化鈉在氯化鑭的存在下還原α-烯酮合成和機械方面」。J.Am.Chem.Soc.103，5454-5459)。將該轉化方法概述在以下方案2中 因此，本發明涉及製備式(Ic)的喹唑啉衍生物的方法，該方法包括(i)將式(Ib′)化合物例如用硼氫化鈉在溶劑諸如甲醇中還原 其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a和X如以上所定義，(ii)按照本領域已知的方式例如除去保護基將形成的式(Ic′)化合物 其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a和X如以上所定義，任選地轉化成所需的式(Ic)的喹唑啉衍生物；然後(iii)回收所需的喹唑啉衍生物。
此外，其中R3與R5一起且R7與R9一起形成鍵的式(Ia)化合物、尤其是式(Id)化合物可按照以下方案3所述的方法來得到
因此，本發明涉及製備式(Id)的喹唑啉衍生物的方法，該方法包括(i)將式(VI′)化合物 其中R2a、R4a、R6a、R8a獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基，其中R2a、R4a、R6a和/或R8a可用適當的保護基進行保護，與三氯甲基氯甲酸酯(ClCO2CCl3)在溶劑諸如1，4-二烷中反應；(ii)將形成的式(VII′)化合物 其中R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定義，與N，O-二甲基羥基胺(NH(OCH3)CH3)在溶劑諸如乙醇中反應；(iii)將形成的式(VIII′)化合物 其中R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定義，與下式化合物R1a-Br其中R1a表示苯基或六元雜芳基，它們任選地被1至5個相同或不同的選自下列的取代基所取代滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基，其中R1a可用適當的保護基進行保護，在鹼諸如正丁基鋰的存在下在溶劑諸如四氫呋喃中反應；(iv)將形成的式(IX′)化合物
其中R1a、R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定義，與還原劑諸如NaBH4反應，隨後與硫氰酸鹽諸如NH4SCN或者與氰酸鹽諸如NH4OCN在酸諸如HCl的存在下反應；(v)按照本領域已知的方式將形成的式(Id′)化合物 其中X、R1a、R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定義，任選地轉化成所需的式(Id)的喹唑啉衍生物；然後(vi)回收所需的喹唑啉衍生物。
本發明化合物可用作有絲分裂驅動蛋白Eg5的調節劑、尤其是抑制劑。術語「有絲分裂驅動蛋白Eg5」包括但不限於人的蛋白(也被稱作KSP)、南非有爪蟾蜍同源物、來自其它物種的其它同源物以及等位變體和功能相關的蛋白。因此本發明還涉及用作Eg5調節劑、尤其是抑制劑的所述化合物。因此，本發明化合物可用於各種應用中，尤其包括治療上的應用。因此，本發明涉及用於治療的化合物。
按照一個具體的實施方案，本發明的化合物可用於調節有絲分裂紡錘體的形成，由此引起有絲分裂中延長的細胞周期停止。術語「調節」是指改變有絲分裂紡錘體的形成，包括增加和減少紡錘體的形成。術語「有絲分裂紡錘體的形成」是指微管通過有絲分裂驅動蛋白形成兩極結構。因此，本發明化合物可用作抗有絲分裂劑，即，可用作預防或幹擾有絲分裂的藥物。尤其是，所述的化合物可用作M期的特異性抑制劑，即，它們可用於抑制M期的進展。
本發明化合物尤其可用於治療細胞增殖性疾病。這些疾病包括但不限於癌症、自身免疫疾病、關節炎、移植排斥、炎性腸疾病和醫學處置、包括但不限於手術和血管成形術後引起的增殖。
本發明化合物尤其可用於治療癌症，包括實體腫瘤諸如癌症。
本發明化合物可以單獨的治療活性化合物的形式或者以與其它治療活性化合物的混合物的形式給藥於需要所述治療的個體它們可以以自身的形式給藥，但它們通常以藥物組合物的形式給藥，即，以活性化合物與可藥用賦形劑、尤其是載體或稀釋劑和/或添加劑的混合物形式給藥。該化合物或組合物可腸內給藥例如口服或直腸給藥，或非腸道給藥例如皮下、靜脈內和肌肉內給藥。
藥物組合物和藥用載體或稀釋劑的性質取決於所需的給藥方式。口服組合物可以以例如片劑或膠囊的形式存在，並且含有常規賦形劑，諸如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、西黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(例如乳糖、糖、玉米澱粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇或二氧化矽)、崩解劑(例如澱粉)或潤溼劑(例如月桂基硫酸鈉)。口服液體製劑可以水性或油性混懸液、溶液、乳液、糖漿、酏劑或噴霧劑等的形式存在，或者以用水或另一種適宜的載體重構的乾燥粉末的形式存在。該類型的液體製劑可含有常規添加劑例如助懸劑、矯味劑、稀釋劑或乳化劑。對於非腸道給藥，可使用含有常規藥用載體的溶液劑或混懸劑。
以下實施例用於解釋說明本發明而沒有限制本發明。
實驗方法化學合成該化合物的一般方法。
所有反應均利用可購買的試劑進行，它們不經進一步純化即可使用。將溶劑通過標準方法乾燥並儲存在分子篩上。所有反應均通過薄層色譜(TLC)監測，所述薄層色譜在Merck矽膠60 F254鋁板上進行並用UV光觀察。快速色譜在Merck矽膠60上進行。示出了用於快速色譜的溶劑混合物以及所有合成的化合物的分析數據。熔點在開口毛細管中利用BüchiMelting Point B-540裝置確定，並且沒有校正。1H和13C NMR波譜在Varian VXR-200，Varian VXR-300和Bruker DRX-600 NMR波譜儀上於室溫下記錄。將所述的溶劑用作內標。用7T APEX II質譜儀得到高分辯(HR)質譜。
一般方法A4-(雜)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮或4-(雜)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮(式(Ib)化合物)的合成。
該合成按照以下方案4所述的方法進行 簡單地講，將五氧化磷(150g)加入到無水二乙醚(300ml)和無醇氯仿(150ml)的溶液中。將反應混合物在氬氣氛下回流4天。然後將該溶液從少量殘餘物中潷出，並將該澄清溶液減壓濃縮成無色糖漿。通過將該糖漿在40℃下真空加熱72小時以除去殘餘的痕量溶劑，得到所需的聚磷酸酯(PPE)。
將適當的式(III)的β-二酮(6.6mmol)、式(IV)的醛(6.0mmol)、脲或硫脲(18.0mmol)和PPE(900mg)置於50ml玻璃燒杯中並充分混合。然後將該玻璃燒杯置於填充有中性氧化鋁(250g)的結晶皿(11.5cm直徑)中。將該裝置在家用微波爐(Proline SM20S，2450MHz，800 W)的轉盤上以滿功率(800W)照射15次，每次5-7秒，在每一次的照射循環之間有1-2分鐘的冷卻時間。然後將乙醇(10ml)和水(5ml)加入到反應混合物中並使固體在超聲浴中重新溶解。隨後將形成的溶液倒入200ml攪拌著的冰冷的水中，濾出沉澱出的粗產物。將粗產物真空乾燥後，將其通過快速色譜純化。
一般方法B4-(雜)芳基-5-羥基-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮或4-(雜)芳基-5-羥基-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮(式(Ic)化合物)的合成。
該合成按照以下方案5所述的方法進行 簡單地講，向適當的4-(雜)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮或4-(雜)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-酮(式(Ib)化合物；0.36mmol)和CeCl3·7H2O(0.36mmol)的乾燥甲醇(3.6ml)懸浮液中於氬氣氛下在室溫下一次性加入硼氫化鈉(0.36mmol)。然後將該反應混合物在該溫度下攪拌30分鐘。然後加入水(3ml)並將形成的懸浮液蒸發至幹。將粗產物進行快速色譜(CHCl3/CH3OH 20∶1)得到產物。
一般方法C3，4-二氫-4-(雜)芳基-喹唑啉-2(1H)-硫酮的合成a)式(VII)的衣託酸酐式(VII)的衣託酸酐按照M.H.Norman，G.C.Rigdon，W.R.Hall，F.Navas，J.Med.Chem.1996，39，1172-1188所述的方法合成，並且不經分離即可用於下一步驟。該合成概括在以下方案6中
簡單地講，將適當的2-氨基-苯甲酸(式(VI)化合物；6.25mmol)、無水1，4-二惡烷(20mL)和三氯甲基氯甲酸酯(5.0g，25.2mmol，4.0當量)加入到100mL圓底燒瓶中。將該反應混合物加熱回流11小時。將反應混合物冷卻並在室溫下攪拌過夜。用旋轉蒸發器除去溶劑得到粗產物。該產物不經進一步純化即可使用。
b)式(VIII)N-甲氧基-N-甲基醯胺式(VIII)的N-甲氧基-N-甲基醯胺從相應的衣託酸酐按照S.V.Frye，M.C.Johnson，N.L.Valvano，J.Org.Chem.1991，56，3750-3752所述的方法製得。該合成概括在以下方案7中 簡單地講，向N，O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(5.12g，0.053mol)的90％含水乙醇(20mL)溶液中加入三乙基胺(5.3g，0.053mol)，在25℃下攪拌10分鐘後，分批加入適當的衣託酸酐(式(VII)化合物；0.035mol)。將該反應液加熱回流1.5小時，然後倒在等體積的冰和飽和碳酸氫鈉上。然後通過旋轉蒸發除去乙醇，將形成的含水混合物用乙酸乙酯萃取(3×20mL)，用硫酸鎂和活性炭乾燥並濃縮。如果得到油狀物，則將其進行矽膠色譜(例如1∶1二乙醚/己烷，然後是丙酮)得到產物。
c)式(IX)的2-氨基二苯甲酮式(IX)的2-氨基二苯甲酮從相應的N-甲氧基-N-甲基醯胺按照S.V.Frye，M.C.Johnson，N.L.Valvano，J.Org.Chem.1991，56，3750-3752所述的方法合成。該合成法概述在以下方案8中 簡單地講，在劇烈攪拌下，向適當的N-甲氧基-N-甲基醯胺(式(VIII)化合物，11.1mmol)和適當的(雜)芳基溴(式R1a-Br化合物；11.1mmol)在無水四氫呋喃(65mL)中的混合物中於-78℃及氮氣下以0.6mL/min加入n-BuLi的己烷溶液(13.8mL，1.6M，22.2mmol)。20分鐘後，加入鹽酸水溶液(1N，20mL)，將該混合物用乙酸乙酯(150mL)萃取，將乙酸乙酯用水和鹽水洗滌，用硫酸鎂乾燥並濃縮。如果得到油狀物，則將其進行矽膠色譜(己烷/乙酸乙酯，1∶1)得到產物。
d)式(Id)的3，4-二氫-4-(雜)芳基-喹唑啉-2(1H)-硫酮。
式(Id)的3，4-二氫-4-(雜)芳基-喹唑啉-2(1H)-硫酮按照D.Xu，P.G.Kucerovy，K.Prasad，O.Repic，Tetrahedron Asymmetry 1996，7，747-754所述的方法合成。該合成法概述在以下方案9中 簡單地講，將適當的2-氨基二苯甲酮(式(IX)化合物，1.0mmol)的10ml95％乙醇溶液在氮氣氛下加熱至65℃。向該混合物中在5分鐘內分批加入38mg(1.0mmol)NaBH4並將混合物在65-70℃下攪拌1.5小時。將形成的米白色懸浮液用5ml水稀釋，然後滴加92mg(1.2mol)硫氰酸銨(NH4XCN，X＝S)的1ml水溶液。在整個加入過程中將溫度保持在65℃。然後將反應混合物用2ml濃鹽酸的1ml水溶液處理並在65-70℃下攪拌2小時。將混合物冷卻至45℃並過濾。將固體用2ml熱水洗滌，然後乾燥得到產物。
參考實施例12-氨基-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺方法一般方法C b)起始化合物衣託酸酐該化合物的物理和光譜數據與已經公開於S.V.Frye，M.C.Johnson，N.L.Valvano，J.Org.Chem.1991，56，3750-3752中的數據相同。
參考實施例22-氨基-4-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺方法一般方法C b)起始化合物4-氯衣託酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.30(3H，s)，3.53(3H，s)，4.78(2H，brs)，6.61(1H，dd，J＝1.9，8.2Hz)，6.67(1H，d，J＝1.9Hz)，7.30(1H，d，J＝8.2Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-34.2，61.4，115.3，116.4，117.0，130.9，137.4，148.6，169.5；ESI-HRMS m/zC9H11ClN2O2Na(MNa+)的計算值237.04013，實測值237.03956；油狀物。
參考實施例32-氨基-N-甲氧基-N，3-二甲基苯甲醯胺方法一般方法C b)起始化合物3-甲基衣託酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝2.1(3H，s)，3.32(3H，s)，3.57(3H，s)，4.60(2H，brs)，6.60(1H，t，J＝7.1Hz)，7.06(1H，d，J＝7.1Hz)，7.2(1H，d，J＝7.1Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-17.8，34.9，61.3，116.6，117.1，123.4，127.2，132.6，145.1，170.8；ESI-HRMS m/zC10H14N2O2Na(MNa+)的計算值217.09475，實測值217.09468；油狀物。
參考實施例42-氨基-5-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺方法一般方法C b)起始化合物5-氯衣託酸酐1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.33(3H，s)，3.57(3H，s)，4.56(2H，brs)，6.63(1H，d，J＝8.6 Hz)，7.12(1H，dd，J＝2.5，8.6Hz)，7.35(1H，d，J＝2.5Hz)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-35.9，63.3，119.9，120.2，123.4，130.7，133.3，147.4，170.6；ESI-HRMS m/zC9H12ClN2O2(MH+)的計算值215.05818，實測值215.05835。
m.p.＝69-72℃。
參考實施例52-氨基-N，3-二甲氧基-N-甲基苯甲醯胺方法一般方法C b)起始化合物3-甲氧基衣託酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.30(3H，s)，3.57(3H，s)，3.82(3H，s)，4.77(2H，brs)，6.61(1H，t，J＝7.9Hz)，6.77(1H，d，J＝7.7Hz)，6.96(1H，d，J＝7.9Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-34.5，55.7，61.1，111.4，115.9，117.0，120.9，137.4，147.5，170.0；ESI-HRMS m/zC10H15N2O3(MH+)的計算值211.10772，實測值211.10776；油狀物。
參考實施例62-氨基-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺.
方法一般方法C b)起始化合物4-氟衣託酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.32(3H，s)，3.55(3H，s)，4.71(2H，brs)，6.32-6.38(2H，m)，7.37-7.41(1 H，m)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-34.2，61.2，102.9(d，J＝24，6Hz)，104.0(d，J＝22.3Hz)，112.8(d，J＝2.3Hz)，131.8(d，J＝10.9Hz)，149.7(d，J＝11.5Hz)，164.7(d，J＝148.5Hz)，169.4；ESI-HRMS m/zC9H11FN2O2Na(MNa+)的計算值221.06968，實測值221.06982；油狀物。
參考實施例72-氨基-5-溴-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺.
方法一般方法C b)起始化合物5-溴衣託酸酐1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.33(3H，s)，3.58(3H，s)，4.68(2H，brs)，6.61(1H，d，J＝8.8Hz)，7.25(1H，dd，J＝2.6，8.8Hz)，7.49(1H，d，J＝2.6Hz)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝34.0，61.4，108.3，118.7，118.3，131.7，134.2，146.0，168.6ESI-HRMS m/zC9H11BrN2NaO2(MNa+)的計算值280.98961，實測值280.98980；m.p.＝72-74℃。
參考實施例8(2-氨基苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺(參考實施例1)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.22(6H，s)，0.99(9H，s)，6.11(2H，brs)，6.57-6.65(1H，m)，6.74(1H，d，J＝8.4)，7.01(1H，m)，7.10(1H，m)，7.19-7.36(3H，m)，7.47(1H，dd，J＝1.5，8.1Hz)13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.2，18.4，25.8，115.6，117.1，118.3，120.7，122.3，123.0，129.3，134.4，134.8，141.6，151.1，155.5，198.9；ESI-HRMS m/zC19H26NO2Si(MH+)的計算值328.17273，實測值328.17280；油狀物。
參考實施例9(2-氨基-4-氯苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-4-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺(參考實施例2)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.21(6H，s)，0.99(9H，s)，6.20(2H，brs)，6.56(1H，dd，J＝1.9，8.7Hz)，6.73(1H，d，J＝1.9Hz)，6.99-7.07(2H，m)，7.18(1H，d，J＝7.7Hz)，7.26-7.34(1H，m)，7.40(1H，d，J＝8.8Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.1，18.5，25.9，116.2，116.5，116.8，120.7，122.3，123.3，129.6，136.2，140.6，141.4，152.0，155.7，198.2ESI-HRMS m/zC19H25ClNO2Si(MH+)的計算值362.13376，實測值362.13355；油狀物。
參考實施例10(2-氨基-3-甲基苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-N-甲氧基-N，3-二甲基苯甲醯胺(參考實施例3)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.22(6H，s)，1.00(9H，s)，2.22(3H，s)，6.21(2H，brs)，6.55(1H，t，J＝7.7Hz)，6.99-7.02(1H，m)，7.11(1H，m)，7.21-7.33(3H，m)，7.38(1H，d，J＝7.4Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.1，18.5，17.6，26.0，115.1，117.8，120.9，122.5，123.0，123.5，129.4，133.1，135.4，142.1，149.7，155.6，199.5；ESI-HRMS m/zC20H27NO2SiNa(MNa+)的計算值364.17033，實測值364.17020；油狀物。
參考實施例11(2-氨基-5-氯苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-5-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺(參考實施例4)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.23(6H，s)，0.99(9H，s)，6.04(2H，brs)，6.67(1H，d，J＝8.8Hz)，7.01-7.04(1H，m)，7.07-7.09(1H，m)，7.19-7.26(2H，m)，7.33(1H，t，J＝7.7Hz)，7.44(1H，d，J＝2.5Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.1，18.5，25.9，118.7，119.0，120.2，120.8，122.4，123.7，129.7，133.5，134.5，140.9，149.6，155.8，197.9；ESI-HRMS m/zC19H25ClNO2Si(MH+)的計算值362.13376，實測值362.13381；油狀物。
參考實施例12(2-氨基-3-甲氧基苯基)(3′-叔丁基二甲基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-N，3-二甲氧基-N-甲基苯甲醯胺(參考實施例5)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.23(6H，s)，1.00(9H，s)，3.90(3H，s)，6.37(2H，brs)，6.50-6.62(2H，m)，6.82-6.90(1H，t，J＝8.1Hz)，6.98-7.02(1H，m)，7.09-7.12(1H，m)，7.20-7.41(2H，m)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.3，18.3，25.8，55.9，113.8，114.0，117.5，120.6，122.2，122.7，122.8，126.1，129.1，141.8，147.4，155.4，198.7；ESI-HRMS m/zC20H27NO3Si(MH+)的計算值358.18330，實測值358.18324；油狀物。
參考實施例13(2-氨基-4-氟苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺(參考實施例6)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.21(6H，s)，0.98(9H，s)，6.26-6.40(3H，m)，6.36(1H，d，J＝2.5，10.9Hz)，6.98-7.05(2H，m)，7.17(1H，d，J＝7.4Hz)，7.26-7.33(1H，m)，7.47(1H，dd，J＝6.6，8.8Hz)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.27，18.33，25.8，102.5(d，J＝24.1Hz)，103.8(d，J＝22.9Hz)，115.1，120.5，122.1，123.0，129.4，137.7(d，J＝11.5Hz)，141.6，153.5(d，J＝13.2Hz)，155.6，166.1(d，J＝253.7)，197.8ESI-HRMS m/zC19H25FNO2Si(MH+)的計算值346.16331，實測值346.16336；油狀物。
參考實施例14(2-氨基-5-溴苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-5-溴-N-甲氧基-N-甲基苯甲醯胺(參考實施例7)反應物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基矽烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.24(6H，s)，0.99(9H，s)，6.10(2H，brs)，6.63(1H，d，J＝8.5Hz)，7.01-7.07(2H，m)，7.19-7.36(3H，m)，7.57(1H，brd)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.3，18.2，25.7，106.5，118.8，119.3，120.5，122.1，123.4，129.4，136.2，136.8，140.5，149.7，155.5，197.5；ESI-HRMS m/zC19H25BrNO2Si(MH+)的計算值406.08324，實測值406.08343；油狀物。
實施例14-(3-羥基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法A起始化合物環己-1，3-二酮反應物3-羥基苯甲醛/硫脲黃色固體；m.p.283℃(分解)；快速色譜CH2Cl2/CH3OH 20∶1；Rf＝0.34(CH2Cl2/CH3OH 15∶1)；1H NMR(200MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝1.71-2.02(m，2H，CH2)，2.21-2.25(m，2H，CH2)，2.41-2.57(m，2H，CH2)，5.08(d，3J＝3.2Hz，1H，CH)，6.59-6.65(m，3H，3x CH芳族)，7.04-7.11(m，1H，CH芳族)，9.35(s，1H，OH)，9.58(br，1H，NH)，10.52(br，1H，NH)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝20.5(CH2)，25.3(CH2)，36.3(CH2)，51.6(CH)，109.1(C-COCH2)，113.2(CH芳族)，114.3(CH芳族)，116.9(CH芳族)，129.3(CH芳族)，144.6(C芳族)，150.5(C-CH2)，157.3(C-OH)，174.4(C＝S)，193.8(C＝O)；HRESIMS C14H14N2O2S [M+H]+的計算值275.0849，實測值275.0851。
實施例27，7-二甲基-4-(3-羥基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法A起始化合物5，5-二甲基環己-1，3-二酮反應物3-羥基苯甲醛/硫脲黃色固體；m.p.220℃(分解)；快速色譜CH2Cl2/CH3OH 20∶1；Rf＝0.31(CH2Cl2/CH3OH 15∶1)；1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝0.92(s，3H，CH3)，1.05(s，3H，CH3)，2.06-2.53(m，4H，2x CH2)，5.10(d，3J＝3.3Hz，1H，CH)，6.64-6.68(m，3H，3x CH芳族)，7.10-7.15(m，1H，CH芳族)，9.46(s，1H，OH)，9.66(br，1H，NH)，10.57(br，1H，NH)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝32.2(CH3)，34.3(CH3)，37.7(CH2)，44.0(C(CH3)2)，55.3(CH2)，57.5(CH)，113.6(C-COCH2)，118.8(CH芳族)，119.9(CH芳族)，122.4(CH芳族)，134.9(CH芳族)，150.2(C芳族)，154.0(C-CH2)，162.9(C-OH)，180.0(C＝S)，199.1(C＝O)；HRESIMS C16H18N2O2S [M+H]+計算值303.1162，實測值303.1164。
實施例34-(3-羥基苯基)-5-羥基-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法B起始化合物4-(3-羥基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氫喹唑啉-2(1H)-硫酮(實施例1)黃色固體；m.p.130℃；Rf＝0.34(CH2Cl2/CH3OH 10∶1)；非對映體混合物比率3∶1；主要的非對映體(芳環和羥基在不同側)1H NMR(600MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝1.40-1.49(m，2H，CH2)，1.52-1.60(m，2H，CH2)，1.96-2.04(m，2H，CH2)，3.63-3.66(m，1H，CHOH)，4.73(d，3J＝6.5Hz，1H，CHOH)，4.93(s，1H，CH)，6.63-6.69(m，3H，3x CH芳族)，7.10-7.14(m，1H，CH芳族)，8.80(s，1H，NH)，9.42(s，1H，OH)，9.47(s，1H，NH)；13C NMR(150MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝17.7(CH2)，25.0(CH2)，31.8(CH2)，54.7(CH)，62.1(CH-OH)，110.0(C-CH(OH))，113.6(CH芳族)，114.4(CH芳族)，117.4(CH芳族)，129.3(CH芳族)，129.7(C-CH2)，144.7(C芳族)，157.5(C-OH)，173.2(C＝S)。
次要的非對映體(芳環和羥基在同側)1H NMR(600MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝1.65-1.71(m，2H，CH2)，1.73-1.79(m，2H，CH2)，2.11-2.16(m，2H，CH2)，3.70-3.73(m，1H，CHOH)，4.57(d，3J＝3.1Hz，1H，CH)，4.93-4.95(m，1H，CHOH)，6.63-6.69(m，3H，3xCH芳族)，7.10-7.14(m，1H，CH芳族)，8.91(s，1H，NH)，9.44(s，1H，OH)，9.56(s，1H，NH)；13C NMR(150MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝17.6(CH2)，27.0(CH2)，31.9(CH2)，54.7(CH)，63.8(CH-OH)，110.0(C-CH(OH))，113.6(CH芳族)，114.4(CH芳族)，117.6(CH芳族)，129.3(CH芳族)，133.6(C-CH2)，144.2(C芳族)，157.6(C-OH)，173.2(C＝S)；HRESIMS C14H16N2O2S[M+H]+計算值277.1011，實測值277.1012。
實施例43，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)-甲酮(參考實施例8)反應物硫氰酸銨1H NMR(200MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.52(1H，d，J＝3.0Hz)，6.64-6.75(3H，m)，6.97-7.00(2H，m)，7.03-7.20(3H，m)，9.19(1H，brs)，9.50(1H，s)，10.65(1H，brs)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.6，113.1，114.2，114.5，116.8，121.2，123.0，126.9，128.1，129.5，134.1，145.7，157.5，174.4；ESI-HRMS m/zC14H13N2OS(MH+)的計算值257.07431，實測值257.07419；m.p.＝217-219℃。
實施例57-氯-3，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-4-氯苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮(參考實施例9)反應物硫氰酸銨1H NMR(200MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.5(1H，d，J＝2.6Hz)，6.61-6.70(3H，m)，6.96-7.14(4H，m)，9.30(1H，brs)，9.47(1H，s)，10.70(1H，brs)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.2，113.1，113.6，114.7，116.8，120.2，122.7，128.8，129.7，132.4，135.5，145.3，157.7，174.6；
ESI-HRMS m/zC14H11ClN2OSNa(MNa+)的計算值313.01724，實測值313.01700；m.p.＝93-95℃。
實施例63，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)-8-甲基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-3-甲基苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮(參考實施例10)反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝2.31(3H，s)，5.49(1H，d，J＝3.3Hz)，6.66-6.68(2H，m)，6.74(1H，d，J＝7.7Hz)，6.93(1H，t，J＝7.4Hz)，7.03-7.16(3H，m)，9.33(1H，brs)，9.49(1H，s)，9.52(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝17.8，57.4，113.9，115.2，117.5，122.6，123.4，123.8，125.5，130.2，130.6，133.1，146.1，158.2，176.0；ESI-HRMS m/zC15H14N2OS(M+)的計算值270.08268，實測值270.08101；m.p.＝255-256℃。
實施例76-氯-3，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-氯苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮(參考實施例11)反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.55(1H，d，J＝3.3Hz)，6.68-6.69(2H，m)，6.75(1H，d，J＝7.5Hz)，7.04(1H，d，J＝9.0Hz)，7.14-7.19(1H，m)，7.26-7.29(2H，m)，9.30(1H，brs)，9.56(1H，s)，10.79(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.1，113.0，114.7，115.9，116.7，123.3，126.4，126.5，128.1，129.7，133.1，145.2，157.6，174.5；
ESI-HRMS m/zC14H12ClN2OS(MH+)的計算值291.03534，實測值291.03518；m.p.＝108-110℃。
實施例83，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)-8-甲氧基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-3-甲氧基苯基)(3′-叔丁基二甲基氧基苯基)甲酮(參考實施例12)反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.52(1H，d，J＝3.03Hz)，6.67-6.78(4H，m)，6.93-7.02(2H，m)，7.11-7.16(1H，m)，8.83(1H，brs)，9.38(1H，brs)，9.51(1H，s)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.6，55.9，110.1，113.1，114.5，116.8，118.6，121.8，123.0，123.5，129.5，144.7，145.1，157.5，174.2；ESI-HRMS m/zC15H14N2O2SNa(MNa+)的計算值309.06682，實測值309.06711；m.p.＝254-256℃。
實施例97-氟-3，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-4-氟苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮(參考實施例13)反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.53(1H，d，J＝3.0Hz)，6.66-6.84(5H，m)，7.12-7.20(2H，m)，9.34(1H，brs)，9.51(1H，s)，10.74(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.2，100.9(d，J＝26.3)，109.6(d，J＝21.8)，113.1，114.6，116.8，117.1(d，J＝2.5Hz)，128.9(d，J＝9.7)，129.7，135.6(d，J＝11.5Hz)，145.5，157.6，161.6(d，J＝242.2Hz)，174.5；ESI-HRMS m/zC14H11FN2OSK(MK+)的計算值313.02077，實測值313.02087；m.p.＝85-87℃。
實施例106-溴-3，4-二氫-4-(3′-羥基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-溴苯基)(3′-叔丁基二甲基甲矽烷基氧基苯基)甲酮(參考實施例14)反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)5.55(1H，d，J＝3.0Hz)，6.67-6.69(2H，m)，6.74(1H，d，J＝7.7Hz)，6.98(1H，d，J＝8.5Hz)，7.13-7.16(1H，m)，7.37-7.41(2H，m)，9.31(1H，brs)，9.55(1H，s)，10.78(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.7，113.7，115.0，115.5，117.0，117.5，124.4，130.1，130.5，131.7，134.2，146.0，158.4，175.3；ESI-HRMS m/zC14H12BrN2OS(MH+)的計算值334.98482，實測值334.98416；m.p.＝115-117℃。
實施例116-氯-3，4-二氫-4-苯基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-氯苯基)(苯基)甲酮反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.66(1H，d，J＝3.3)，7.05(1H，d，J＝8.4Hz)，7.26-7.41(6H，m)，9.36(1H，s)，10.8(1H，s)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.9，116.7，124.0，126.9，127.3，128.5，129.0，129.5，133.9，144.5，175.4；
ESI-HRMS m/zC14H12ClN2S(MH+)的計算值275.04042，實測值275.04086；m.p.＝225-227℃。
實施例126-氯-4-(2′-氟苯基)-3，4-二氫喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-溴苯基)(2′-氟苯基)甲酮反應物硫氰酸銨1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.92(1H，J＝2.8Hz)，7.03-7.07(2H，m)，7.22-7.43(5H，m)，9.23(1H，brs)，10.88(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝51.5，115.9，116.1(d，J＝5.7Hz)，121.8，124.9(d，J＝3.4Hz)，126.2，126.5，128.5，128.7(d，J＝4.0Hz)，130.2(d，J＝8.0Hz)，130.5(d，J＝13.1Hz)，133.2，159.0(d，J＝246.8)，174.5；ESI-HRMS m/zC14H11ClFN2OS(MH+)的計算值293.03100，實測值293.03101；m.p.＝279-281℃。
實施例133，4-二氫-4-苯基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物2-氨基二苯甲酮反應物硫氰酸銨該化合物的物理和光譜數據與已經公開於D.Xu，P.G.Kucerovy，K.Prasad，O.Repic，Tetrahedron Asymmetry 1996，7，747-754的數據相同。試驗和藥理學數據Eg5487H的表達和純化將對應於胺基酸1-487的南非有爪蟾蜍Eg5的序列通過聚合酶鏈反應(PCR)從Eg5的全長克隆來擴增，然後克隆到引入C-末端的(Gly)5(His)6tag的pQE70(SphI/BgIII)內。將該蛋白質在大腸桿菌M15(pREP4)中在18℃下在含有1mM異丙硫基-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)、100μg/ml氨比西林、25μg/ml卡那黴素和2％(v/v)乙醇的LB中表達5小時。將收穫的細胞溶解在含有5mM巰基乙醇(ME)的緩衝液A(50mM KPi、100mM NaCl、0.1mMMgATP蛋白酶抑制劑(Roche)，pH 7.0)中。將澄清的溶解產物負載到HIS-Select Cobalt Affi Gel柱(Sigma)上，用補充有10mM咪唑、2mM ME、10％(w/v)甘油的緩衝液A洗滌，然後用150mM咪唑、50mM KCl、10％(w/v)甘油、10mM ME，pH 7.3洗脫。將緩衝液通過透析轉變成50mM3-(N-嗎啉代)丙磺酸/KOH、50mM KCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、10mM ME、20％(w/v)甘油，pH 7.0。將蛋白質的濃度調節至2mg/ml(通過Bradford試驗利用牛血清白蛋白(BSA)作為標準測定)。將Eg5487H在液體乙烷中冷凍並儲存在液氮中。
體外微管聚合作用將50μl純化的豬腦微管蛋白、50μl BRB80(80mM PIPES pH 6.8，1mM MgCl2和1mM EGTA)、42.5mg甘油和1.25μl 100mM GTP的混合物在37℃下保溫30分鐘。然後將聚合後的微管通過加入1μl 10mM紫杉醇(Sigma)的DMSO溶液進行穩定，然後在37℃下繼續保溫20分鐘。將該懸浮液以70000rpm的轉速於30℃下在TLA100轉子(Beckman)中離心分離30分鐘。將形成的微管顆粒在37℃下重新懸浮在補充有20μM紫杉醇的60μl試驗緩衝液(10mM咪唑/乙酸鹽、5mM乙酸鉀、2mM EGTA和4mM乙酸鎂，pH 6.8)中。將該微管懸浮液保存在室溫下。通過Bradford法進行測定並用BSA作為標準，測得聚合的微管蛋白的終濃度為80μM。IC50的測定為了確定可抑制Eg5的微管刺激的ATP酶活性達50％的化合物濃度(IC50)，使用EnzChekPhosphate Assay(Molecular Probes)。終濃度為40nM Eg5487H、4μM微管(微管蛋白二聚體的濃度，通過Bradford法利用BSA作為標準測定)和1mM MgATP。通過在室溫下測定2小時內在365nm處吸光度的增加來測定ATP酶的活性。在實驗開始時以不同的濃度加入1％(v/v)抑制劑的DMSO溶液(或1％(v/v)DMSO作為對照)。在每種條件下均進行至少4次測定，然後將結果平均。Eg5487H的微管-刺激活性通過從含有Eg5487H和微管的測定值中減去背景活性(在不存在Eg5487H的條件下用微管測得)來得到。IC50通過假設的非競爭性酶抑制作用並將酶活性對抑制劑濃度的理論上預期的依賴性擬合為實驗性的微管刺激的ATP酶活性來確定。用於擬合的等式是v＝Vmax*IC50/([抑制劑]+IC50)+vres，v是測定的相對ATP酶速率，vmax是最大的ATP酶速率，vres是在高抑制濃度下的殘餘活性。
測定了實施例1至3的化合物的IC50值。實施例1和3的化合物的IC50為2μM，即，與monastrol(其IC50為30μM)相比，它們作為Eg5抑制劑的效力要強10倍以上。實施例2化合物的IC50為0.2μM，因此比monastrol的效力強100倍以上。所有這三種化合物在遠大於IC50的濃度下均可完全抑制Eg5活性。在對照實驗中，未觀察到這三種化合物對常規驅動蛋白、蟾蜍驅動蛋白樣蛋白1(Xklp1)或蟾蜍Kid(XKid)的抑制作用，顯示對Eg5的抑制作用是特異性的。
細胞培養和FACS分析然後測試所述化合物對於呈指數生長的人組織培養細胞的作用效果。
將Hela細胞在補充有10％(v/v)FCS的DMEM培養基中培養至60％匯合。然後將培養基更換為含有不同抑制劑或DMSO的新鮮培養基，並且將細胞在37℃下在5％CO2中放置18小時。溶於DMSO的抑制劑在培養基中的終體積通常等於或小於0.1％(v/v)。對於洗除實驗，將細胞按照以上所述的方法進行處理。18小時後，將該細胞用磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)洗滌，用新鮮培養基覆蓋，然後在37℃下在5％CO2中繼續培養24小時。
在用抑制劑處理前後以及在化合物洗除之後，通過表面螢光(配備有CCD照相機的Zeiss Axioscope 2)或通過共焦顯微鏡方法(Zeiss LSM 510)觀測細胞。對於表面螢光顯微鏡法，將細胞在-20℃下用甲醇固定，然後進行免疫螢光。將微管蛋白用一級小鼠單克隆抗-α微管蛋白抗體DM1A(Sigma)和次級兔多克隆Alexa 488-結合的抗小鼠抗體(Molecular Probes)進行染色。將DNA用Hoechst 33342染色。對於共焦的顯微鏡方法，將細胞與XX％的戊二醛混合併進行免疫螢光處理。將DNA依次用一級多克隆兔抗磷酸組蛋白H3抗體(Upstate Biotechnology)和二級多克隆Alexa 546結合的抗兔抗體染色。將微管按照以上所述的方法染色。
將HeLa細胞在補充有各種濃度的三種化合物之一、monastrol或DMSO的培養基中保溫18小時。然後將細胞固定並通過FACS和免疫螢光法分析。
對於FACS分析，在抑制劑處理之後或洗除之後將細胞從培養板上剝離，並通過在Heraeus Megafuge 1.0R中以1200rpm離心分離5分鐘來收集。將細胞顆粒用5ml PBS洗滌1次，然後重新懸浮在0.5ml PBS中。將細胞通過加入4ml 70％(v/v)乙醇進行固定並在-20℃下保溫過夜。將固定的細胞在1200rpm下離心分離5分鐘，用5ml PBS洗滌並重新懸浮在1ml PI溶液(10μg/ml碘丙錠、100μg/ml RNAse A、0.05％Triton X100的PBS溶液)中。在37℃下在黑暗中30分鐘後，將細胞通過螢光活化的細胞分類法(FACS)進行分析。
FACS分析表明，monastrol在100μM下可以有效地將細胞封閉在G2/M(74％)。較低的濃度(10μM)僅促進非常弱的G2/M細胞的增加(31％，在對照中為23％)。這與前面的報告相一致。三種待測化合物也可以將細胞封閉在G2/M，但起作用的濃度卻遠小於monastrol。事實上，10μM實施例1或實施例3的化合物的效果與100μM monastrol的效果相同，促進了77％G2/M細胞的累積。驚人地是，僅1μM的實施例2的化合物就足以累積75％的G2/M細胞。在用0.1μM實施例2的化合物處理過的細胞中未觀察到細胞周期分布的異常。因此，研究了該化合物的中間濃度的效果，並且發現0.5μM所述的化合物導致47％G2/M細胞的累積。有絲分裂停止所需的濃度類似於體外抑制Eg5活性所需的濃度。這意味著細胞周期停止的機理是通過Eg5抑制作用特異性地介導的。
Monastrol的一個有用的特性是當短暫應用時對細胞是無毒的；一旦洗除，細胞便重新開始有絲分裂。因此，測試這三種新化合物是否也具有這些性質。將HeLa細胞與各種濃度的不同化合物一起保溫，如前面的實驗所述的那樣。18小時後，將化合物洗除，並將該細胞在新鮮培養基中保溫24小時，然後分析。在所有的試驗條件下，細胞均重新進入細胞周期，表明這三種新化合物與monastrol一樣也可以從細胞中洗除並且是無毒的。
然後，我們通過免疫螢光用抗微管蛋白抗體和Hoechst研究用不同化合物處理的細胞的形態學。對於monastrol和這三種化合物發現了相同的表型細胞停止了有絲分裂並且微管和染色體徑向排列。
蟾蜍卵提取物最後，測試實施例1-3的化合物在蟾蜍卵提取物中是否會產生與在人組織培養細胞中相同的效果。
按照文獻中描述的方法製備用細胞抑制因子(CSF)-停止的南非有爪蟾蜍卵提取物。按照描述用精核和四甲基羅丹明標記的微管蛋白在周期提取物中進行紡錘體組裝實驗。在紡錘體組裝前，將溶於DMSO的1％(v/v)(或更少)抑制劑加入到提取物中。作為對照，將1％DMSO加入到提取物中。將紡錘體固定並離心到蓋玻片上。將DNA用DAPI染色。然後通過表面螢光顯微法(配備有Roper CoolSnap HQ照相機的Zeiss Axiovert 135)觀察結構。然後對紡錘體和異常微管結構進行計數。
將100μM monastrol、10μM實施例1或3的化合物或1μM實施例2的化合物加入到蟾蜍卵提取物中。監測其中的紡錘體組裝，結果發現所有化合物均抑制兩極紡錘體的形成並促進通過微管和染色體的徑向排列所形成的周期圖的形成，就象以前關於monastrol所描述的以及在組織培養細胞中所觀察到的那樣。
權利要求
1.式(I)的喹唑啉衍生物或其可藥用鹽 其中R1表示苯基或6元雜芳基，它們任選地被1-5個相同或不同的選自下列的取代基所取代滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基；X表示S或O；A與它們所連接的碳原子一起形成5-、6-或7-元的、部分不飽和的或芳香族的同素環或雜環，它們可帶有最多10個相同或不同的選自下列的取代基滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基和二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基。
2.權利要求1所述的喹唑啉衍生物或其鹽，其中在式(I)中，R1表示式(II)的基團 其中L1至L5獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基，並且#表示與喹唑啉核連接的鍵，其中L1至L5中至少有一個不是氫。
3.權利要求1或2所述的喹唑啉衍生物或其鹽，其中在式(I)中，R1是3-羥基苯基。
4.權利要求1至3中的任何一項所述的喹唑啉衍生物或其鹽，其中在式(I)中，X是S。
5.權利要求1至4中的任何一項所述的喹唑啉衍生物或其鹽，其中在式(I)中，A與它們所連接的碳原子一起形成6-元的、部分不飽和的或芳香族的同素環，它可以具有最多8個相同或不同的選自權利要求(1)所定義的基團的取代基。
6.權利要求5所述的喹唑啉衍生物或其鹽，它是式(Ia)的喹唑啉衍生物或其鹽 其中R1和X如權利要求1至5中的任何一項所定義，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、氧代、巰基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基，或者R3與R5一起、R5與R7一起和/或R7與R9一起形成鍵，或R2與R3一起、R4與R5一起、R6與R7一起和/或R8與R9一起形成氧代或硫代基團。
7.權利要求6所述的喹唑啉衍生物或其鹽，其中在式(Ia)中，R8和R9與它們所連接的碳原子一起形成羰基，並且R2、R3、R4、R5、R6、R7如權利要求6所定義。
8.權利要求6所述的喹唑啉衍生物或其鹽，其中在式(Ia)中，R8是氫、R9是羥基，R2、R3、R4、R5、R6、R7如權利要求6所定義。
9.權利要求5所述的喹唑啉衍生物或其鹽，它是式(Id)的喹唑啉衍生物或其鹽 其中R1和X如權利要求1至5中的任何一項所定義，R2、R4、R6、R8獨立地表示氫、滷素、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-滷代烷基、C1-C6-滷代烷氧基、羧基、氨基甲醯基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亞磺醯基、C1-C6-烷基磺醯基、羥基磺醯基、氨基磺醯基、C1-C6-烷基氨基磺醯基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺醯基。
10.權利要求1所述的喹唑啉衍生物或其鹽，它是以下化合物或其鹽
11.用於治療的權利要求1至10中的任何一項所述的喹唑啉衍生物或其鹽。
12.包含一種或一種以上權利要求1至10中的任何一項所述的喹唑啉衍生物或其鹽和任選的一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。
13.權利要求1至10中的任何一項所述的喹唑啉衍生物或其鹽用於治療癌症的用途。
全文摘要
本發明涉及式(I)的喹唑啉衍生物或其可藥用鹽，其中R
文檔編號A61P35/00GK101094839SQ200580045832
公開日2007年12月26日 申請日期2005年11月4日 優先權日2004年11月4日
發明者T·薩瑞, G·阿薩納修斯, I·韋爾諾斯, M·加特納, N·松德爾－普拉斯曼, S·瓦希裡基, T·邁爾, S·許默 申請人:歐洲分子生物學實驗室, 萊比錫大學, 馬克思－普朗克公司