新型免疫刺激方法

2023-12-05 09:05:56

專利名稱：新型免疫刺激方法
技術領域：
本發明涉及一種用於在受試者引起固有免疫應答的新方法，所述方法涉及包含TLR2激動劑的TLR2部分(moiety)的使用。
背景技術：
甲型流感病毒(IAV)感染每年誘發高達十億例感染和300，000-500，000人死亡，並且2009年全球爆發的豬HlNl已經凸顯了可以用來應對大流行性流感(pandemicinfluenza)的有限的抗病毒方案。雖然疫苗可以用來對抗季節性IAV流行，但是這些疫苗誘導了對抗IAV總是演化的神經氨酸酶和血凝素表面蛋白的抗體，因而需要每年的重新配製(re-formulation)和施用。此外,這些疫苗通常無法有效地對抗由新近出現的病毒引起的大流行性爆發。可供選擇的方法旨在祀向IAV的保守的(conserved)內部區域。然而，最近的豬甲型流感病毒HlNl的大流行性爆發已經引導探尋去發現對抗大流行性流感的廣譜疫苗和抗病毒方案。本發明涉及治療流感以及其他感染性疾病和癌症的新方法的開發。

發明內容
本發明的第一個方面提供了一種通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防疾病的方法，所述方法包含為受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答治療或預防的。本發明的第二個方面提供 了一種用於治療或預防由感染原(infectious agent)引發的疾病的方法，所述方法包含為有其需要的受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述TLR2部分不誘導針對所述感染原的特異的細胞或體液免疫應答。本發明的第三個方面提供了一種通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防癌症的方法，所述方法包含為受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述TLR2部分不誘導針對所述癌症的特異的細胞或體液免疫應答。本發明的第四個方面提供了一種藥物組合物，其包含有效量的溶液中的TLR2部分和藥學上可接受的載體或賦形劑，所述藥物組合物通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防疾病，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答治療或預防的。本發明的第五個方面提供了有效量的溶液中的TLR2部分在製備用於治療或預防受試者中疾病的藥物中的用途，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑，其特徵在於所述TLR2激動劑在受試者中引起固有免疫應答並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答治療或預防的。


圖1顯示了脂肽疫苗候選物的示意圖。Pam2Cys_基構建體(construct)的示意圖。(A)聚乙二醇化Pam2Cys (Pam2Cys_PEGn)由通過兩個絲氨酸偶聯至^ 聚乙二醇(undecaethyleneglycol)(聚乙二醇，PEG)的單一的 Pam2Cys 分子組成。(B)基於 Pam2Cys的脂肽疫苗候選物由通過單一的賴氨酸(K)殘基連接的靶標CD8+T細胞表位和輔助性T表位(T helper epitope)組成。Pam2Cys脂質部分通過兩個絲氨酸殘基(Ser)附加以形成支鏈的肽結構。圖2顯示了脂肽的鼻內施用拓展了肺細胞種群。採用25nmol的0T2-P2C-gB498_5M脂肽或25nmol的肽0T2_gB498_5(l5 (不具有Pam2Cys)對C57BL/6小鼠進行鼻內接種並在指定的時間點進行肺細胞種群的表徵(n=3/組/時間點)。(A)顯示了肺細胞的總數。符號代表平均細胞計數並且誤差條表示SEM，#=P〈0.01對比第0天。(B)顯示了肺細胞的組成。每個條代表平均細胞計數(n=3)並且誤差條表示SD，*=P〈0.05對比第0天的細胞種群。使用單因素ANOVA分析和事後(post-hoc)Dunnett氏多重比較檢驗進行統計分析。重複實驗得到類似結果。圖3顯示了基於Pam2Cys的脂肽提高了 IAV的清除。(A)採用生理鹽水、IAV-LP(含有IAV-衍生的表位)或非IAV-LP對小鼠進行接種並在脂肽接種後的第3天(上方圖)或第7天(下方圖)採用1045pfu的Mem71 (H3N1)流感病毒(n=3_5/組)挑戰(challenge)。在感染的第5天評估肺病毒滴度(lung virus titre)並且顯示出針對BALB/c小鼠( )、C57BL/6小鼠(□)和HHD小鼠(〇)的肺病毒滴度。符號代表從單個小鼠中獲得的滴度並且線表示該組的平均病毒滴度。(B)在脂肽組上顯示了相對於生理鹽水對照組的病毒清除百分比。在LP接種後第7天，從 採用Mem71挑戰的C57BL/6小鼠中檢測到IAV-特異性⑶8+T細胞應答。在挑戰的第5天，使用針對IFN-Y和TNF-a的細胞內染色分析法從脾臟中檢測到PA224_233_特異性⑶8+T細胞。條形圖表示每組中的平均細胞因子-特異性應答和誤差條表示SD。*=P〈0.05廣P〈0.01對比生理鹽水(單因素ANOVA分析和事後Dunnett氏多重比較檢驗。圖4顯示了基於Pam2Cys的脂肽降低了高致病性IAV感染的影響。上方圖:顯示了採用生理鹽水、IAV-LP或非IAV-LP (n=5/組)鼻內接種並在7天後採用H1N1PR8病毒挑戰的C57BL/6小鼠(左手邊)和HHD小鼠(右手邊)的存活的Kaplan-Meier曲線。下方圖:感染後的體重變化。符號表示平均值並且誤差條表示SEM。兩種小鼠品系的獨立的重複實驗中反映了這些結果。圖5顯示了 Pam2Cys對肺細胞因子的環境。為C57BL/6小鼠施用20nmol的Pan^Cys-PEG11 (P2C_PEGn)或50 的生理鹽水(1.n)並且在施用後的第3天(D3)或第7天(D7)使用BD 流式微球分析法測定支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的細胞因子濃度。條形圖表示各組(n=3)的平均應答並且誤差條表示SD，*=P〈0.05 ；**=P<0.01 ；***=p<0.001對比生理鹽水組和未處理(NaiVe)組(單因素ANOVA分析和事後Tukey氏多重比較檢驗)。圖6顯示了 Pam2Cys介導病毒清除。採用生理鹽水或20nmol的Pam2Cys_PEGn對小鼠進行接種並在之後的第I (上方圖)、3 (中部圖)或7 (下方圖)天採用IO4 5Pfu的Mem71(H3N1)病毒(n=3-5/組)挑戰。在感染的第5天評估BALB/c小鼠( )、C57BL/6小鼠(□)和HHD小鼠(〇)中的病毒滴度。符號代表從單個小鼠中獲得的滴度並且線表示該組的平均病毒滴度，*=P〈0.05對比生理鹽水(未配對學生t-檢驗)。相對於生理鹽水組的病毒清除百分比表示為Pam2Cys應答。圖7顯示了鼻內Pam2Cys施用拓展了肺中的細胞亞種群。為C57BL/6小鼠施用20nmol的聚乙二醇化？&1112078( 2(^^611)或50111的生理鹽水(1.n)並且在施用後72小時進行肺細胞種群的表徵。條形圖代表各組的平均應答(n=3)並且誤差條表示SD，*=P〈0.05 ；對比對照組(未配對學生t-檢驗)。圖8顯示了 Pam2Cys預防了劇毒性IAV感染。採用生理鹽水或20nmol的聚乙二醇化Pam2Cys (P2C_PEGn)對C57BL/6小鼠進行鼻內接種(n=5/組)並且在I天后採用200pfuHlNl PR8病毒挑戰。一組小鼠接受20nmol的P2C-PEGn並且在72小時後進行挑戰。感染後的體重變化顯示為原始重量的百分比。符號表示平均值並且誤差條表示SEM。獨立的重複實驗中反映了這些結果。圖9顯示了 Pam2Cys預防法降低了病毒載量(load)和流感的接觸傳播。採用生理鹽水(白條)或20nmol的聚乙二醇化Pam2Cys (P2C_PEGn)(灰條)對BALB/c小鼠進行接種並且在7天、5天、72小時或24小時後採用IO4 5Pfu的Udorn (H3N2)病毒進行挑戰(n=2/組)。這些小鼠被指定為傳播者(spreader)小鼠。在挑戰後的二十四小時，使傳播者小鼠與未處理的(naive)接受者(recipient)小鼠合居(co-house)。在合居24小時之後,取出傳播者小鼠並取出鼻甲、氣管和肺並測定病毒滴度(上方圖)。暴露於傳播者小鼠之後3.5天收穫來自於接受者小鼠的器官並評估病毒滴度(下方圖)。白色或灰色的箭頭表示從各個處理組到合居的接受者的成功的接觸介導的傳播。圖10顯示了 PEG_Pam2Cys在鼻內遞送時以單一劑量預防了 IAV。經鼻內(1.n)、皮下(s.C)或靜脈內(1.V)途經為小鼠預防性施用PEG-Pam2Cys (20nmol)並且在3天後採用致死劑量的PR8病毒進行挑戰。然後在PR8之後對小鼠的體重和存活進行為期8天的監測並在人道終點(humane end-point)處死。圖11顯示了幾個 Pam2Cys變體還賦予了對抗IAV挑戰的保護。通過鼻內途經為小鼠預防性施用20nmol的含有構建體的各種Pam2Cys並且在3天後採用致死劑量的PR8病毒進行挑戰。然後在PR8之後對小鼠的體重(A)和存活(B)進行為期8天的監測。當與每一個其他的處理組比較時，生理鹽水組中看到的體重降低是統計學上有顯著性的(P〈0.01)。圖12顯示了當以重複的劑量給出時，PEG-Pam2Cys是有效的。為Balb/c小鼠施用單劑量的PEG-Pam2Cys，或者施用相隔三周的兩個劑量的PEG_Pam2CyS，然後在第二劑量的3天後採用PR8進行挑戰。然後在挑戰之後對小鼠的體重和存活進行為期8天的監測並且在PR8之後第7天處死小鼠用於評估肺病毒載量。當與每一個其他的處理組比較時，生理鹽水組中看到的體重降低是統計學上有顯著性的(P〈0.01)(A)。採用PEG-Pam2Cys處理的小鼠中的病毒載量基本上低於僅接受生理鹽水的小鼠中的病毒載量(B)。圖13顯示了較低劑量的PEG_Pam2Cys也是有效的。採用2、5和IOnmol(c.f.20nmol)的較低劑量的PEG_Pam2Cys對小鼠進行預防性處理並且在3天後採用致死劑量的PR8病毒進行挑戰。在挑戰之後對小鼠的體重變化和存活進行為期18天的監測並在人道終點處死。生理鹽水組中的小鼠在PR8挑戰之後沒有存活超過8天。圖14顯示了對抗IAV挑戰的保護不依賴於IFN- y或I型幹擾素卿IFN- a)。為缺乏IFN-Y (B6.1FN-y-/-) (A)或I型幹擾素受體(IFNAR-/-) (B)的小鼠預防性施用20nmol的PEG_Pam2Cys (1.η)並且在3天後採用致死劑量的PR8病毒進行挑戰。這些小鼠預防了與PR8感染有關的重量降低和致死性。在第5天處死Β6.1FN-Y-/-群體，此時生理鹽水組達到人道終點時。圖15顯示了 PEG_Pam2Cys作為治療劑是有效的。採用IO4 5PFU的Udorn病毒對Balb/c小鼠進行1.η挑戰並在4小時後施用20nmol的PEG_Pam2Cys (1.η)。兩天後，處死
動物並測定鼻、口咽、氣管和肺中的病毒載量。圖16顯示了 PEG_Pam2Cys作為抗細菌劑是有效的。採用20nmol的PEG_Pam2Cys對C57BL/6小鼠進行預先處理(1.η)並在3天後採用IX IO6CFU的嗜肺軍團菌(L.pneumophila) (JR32 Λ fIa株)進行挑戰。在採用嗜肺軍團菌的鼻內挑戰後對小鼠進行每日監測並且在挑戰後的第1、2和3天評估小鼠肺中的細菌載量(A)。每個符號代表在每個時間點獲得的平均細 菌載量並且誤差條顯示標準偏差(SD)。統計學顯著性用*(p〈0.05)表示，其通過使用學生t-試驗比較生理鹽水組和PEG-Pam2Cys處理組獲得。每個符號上顯示了相對於生理鹽水組的細菌減少的平均百分比。為了展示PEG-Pam2Cys保護的窗口，在採用嗜肺軍團菌的挑戰之前3天(B)或7天(C)採用PEG-Pam2Cys對小鼠進行預處理。感染後第3天的細菌載量如圖B和C中所示。
具體實施例方式在整個說明書中，除非上下文另有要求，詞語「包含(comprise)」，或者如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」的變體，將被理解為暗示包含了表述的元素或整數或者元素或整數的組群，但是並不排除任何其他的元素或整數或者元素或整數的組群。本說明書中對任何先前的出版物(或由其衍生的信息)或者任何已知的物質的弓I用不是並且也不應該被視為承認或允許或者任何形式的暗示，所述先前的出版物(或由其衍生的信息)或者已知的物質形成了本說明書所涉及的領域中的公知常識的一部分。將本說明書中提到的所有出版物的全部內容通過引用的形式併入本文。必須指出的是，如本說明書中所使用的，單數形式的「一(a)」、「一(an)」和「所述(the)」包括複數方面，除非上下文另有清楚的規定。因此，例如，對「試劑(an agent)」的引用包括單一的試劑，以及兩個或多個試劑；對「所述組合物(the composition!)」的引用包括單一的組合物，以及兩個或多個組合物等等。在本說明書中，術語「TLR2」意指Toll樣受體2蛋白。TLR2是Toll樣受體(SP「TLR」)的膜受體蛋白家族，其包括 TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 和 TLR9。在人類中，TLR2由TLR2基因編碼。TLR2在某些細胞的表面上表達並在病原體識別和固有免疫的激活中起著至關重要的作用。TLR2激動劑是結合Toll樣受體2的試劑。所述TLR2激動劑可以結合TLR2作為同源二聚體或異源二聚體。本發明基於如下觀察，TLR2激動劑如S-[2，3_雙(棕櫚醯氧基)丙基]半胱氨酸(Pam2Cys)展示了引起受試者中固有免疫應答並且(特別是)以一種非抗原特異性方式引起對抗感染原如病毒(例如，甲型流感)和細菌(例如，嗜肺軍團菌)的預防性和治療性效果的能力。
因此，在本發明的第一個方面中，提供了一種通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防疾病的方法，所述方法包含為受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答治療或預防的。在一些實施方案中，所述TLR2激動劑是脂肽或者包含脂質部分。根據本發明的實施方案的示例性脂肽是脂肽「Pam2Cys」。本領域技術人員將會理解的是，術語「脂肽」意味著包含一個或多個脂質部分和結合的一個或多個胺基酸序列的物質的任何組成。「Pam2Cys」(也被稱為二棕櫚醯基_S_甘油基-半胱氨酸或S_[2，3雙(棕櫚醯氧基)丙基]半胱氨酸已被合成並且對應MALP-2的脂質部分，所述MALP-2是從發酵支原體(Mycoplasma fermentans)中分離出的激活巨曬細胞的脂肽。已知Pam2Cys是TLR2的配體。Pam2Cys 具有結構:
權利要求
1.一種通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防疾病的方法，所述方法包含為受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答來治療或預防的。
2.一種通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防癌症的方法，所述方法包含為受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述TLR2部分不誘導針對所述癌症的特異的細胞或體液免疫應答。
3.一種用於治療或預防由感染原引發的疾病的方法，所述方法包含為有其需要的受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的TLR2部分，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述TLR2部分不誘導針對所述感染原的特異的細胞或體液免疫應答。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特徵在於所述TLR2部分包含結合至增溶劑的TLR2激動劑。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特徵在於所述TLR2激動劑選自Pam2Cys>Pam3Cys>Ste2Cys>Lau2Cys 和 OctCys。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述TLR2激動劑是Pam2Cys。
7.根據權利要求4至6中任一項所述的方法，其特徵在於所述增溶劑是PEG(聚乙二醇)或極性多肽。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述極性多肽選自R4、H4、E8和HS。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述增溶劑是聚乙二醇。`
10.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述增溶劑包含PEG以及R4、H4、H8、EB8和E8中的任一種。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其特徵在於所述組合物被鼻內施用至受試者。
12.根據權利要求3至11中任一項所述的方法，其特徵在於所述感染原是病毒。
13.根據權利要求12所述的方法，其特徵在於所述病毒是甲型流感病毒(IAV)。
14.根據權利要求3至11中任一項所述的方法，其特徵在於所述感染原是結核分枝桿菌 Mycobacterium tuberculosis 或嗜月市軍團菌 Legionella pneumophila。
15.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述癌症由感染原引發。
16.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於所述癌症由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)或EB病毒(EBV)引發。
17.—種藥物組合物，其包含有效量的溶液中的TLR2部分和藥學上可接受的載體或賦形劑，所述藥物組合物通過在受試者中引起固有免疫應答來治療或預防疾病，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答來治療或預防的。
18.有效量的溶液中的TLR2部分在製備用於治療或預防受試者疾病的藥物中的用途，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑，其特徵在於所述TLR2激動劑在受試者中引起固有免疫應答並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答來治療或預防的。
19.根據權利要求1至16中任一項所述的方法或根據權利要求17所述的組合物，其特徵在於所述組合物不包含TLR9激動劑。
20.根據權利要 求18所述的用途，其特徵在於所述藥物不包含TLR9激動劑。
全文摘要
本發明涉及一種通過引起受試者固有免疫應答來治療或預防疾病的方法，所述方法包含為受試者施用有效量的包含溶液中的TLR2部分的組合物，其特徵在於所述TLR2部分包含TLR2激動劑並且其特徵在於所述疾病不是通過針對所述TLR2部分的體液或細胞免疫應答來治療或預防的。
文檔編號A61K38/10GK103189072SQ201180051461
公開日2013年7月3日 申請日期2011年9月22日 優先權日2010年9月22日
發明者D·C·傑克遜, A·譚, W·曾 申請人:墨爾本大學