一種雜合木聚糖酶atxb的製備方法
2023-05-11 17:20:56 2
專利名稱：一種雜合木聚糖酶atxb的製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域中利用基因工程或蛋白質工程技術對酶分子進行改造，獲得底物結合能力強、水解性能好的重組酶基因，生產重組木聚糖酶的方法。
背景技術：
木聚糖酶具有廣泛的エ業應用價值(Subramaniyan S et al. 2002)。木聚糖酶應用在飼料エ業中，可提高飼料(尤其是糠麩類)的營養價值，促進動物生長；在造紙和紙漿エ業中，木聚糖酶的使用可減少化學漂白劑的使用量，有利於環境保護；在食品エ業中，木聚糖酶可用於麵包製作、果汁澄清、釀造業和製備功能性低聚木糖。但是在這些實際應用中，木聚糖酶的底物並不是単一的木聚糖而是多糖複合物。如在糠麩類飼料原料中，除了可溶性木聚糖外，還有大量的不溶性木聚糖、澱粉、木質素和纖維素等其它物質(Coughlan etal., 1993)。因此如何提高木聚糖酶吸附在多糖複合體上尤其是不溶性木聚糖、澱粉、木質素和纖維素等上，高效發揮木聚糖酶水解性能使其適應エ業應用至關重要。在エ業應用上，木聚糖酶的理想特性是同時具有較寬的最適溫度和pH、良好的熱穩定性和pH穩定性，以及具備較好的底物結合、水解性能，然而此類理想型的木聚糖酶很難從自然界直接獲取，需要利用基因工程或蛋白質工程技術對酶分子進行改造，使木聚糖酶的性質更好適應相關產業的發展需要。木聚糖酶是可以將木聚糖降解成低聚木糖(xylooligosaccharides, XOs)和木糖(xylose) 一類水解酶的總稱。根據催化結構域胺基酸同源性和疏水簇分析法，木聚糖酶屬於糖苷水解酶第10和第11家族(family)。ー些F/10家族木聚糖酶和纖維素酶在水解過程中，首先通過其底物結合域(木聚糖結合域、纖維素結合域)或結合位點錨定在多糖複合體上，使其催化中心更容易靠近底物，便於發揮水解功能(Kuno et al., 2000)。F/10家族的Pseudomonas f luorescens XylA含一個催化結構域和一個木聚糖結合域，二者由一段富含絲氨酸的連接序列相連，將木聚糖結合域和連接序列分別除去後所得的截短型木聚糖酶對可溶木聚糖的水解能力無明顯變化，但它們對不溶性底物的結合、水解能力顯著降低(Kulkarni et al. ,1999)。國內外關於木聚糖結合域的研究報導多集中在F/10家族木聚糖酶上(Din etal.，2000 ;劉明啟等，2003)。F/10家族木聚糖酶的木聚糖結合域可以結合不溶性木聚糖和微晶纖維素，其功能和纖維素酶的纖維素結合域類似，但絕多數G/11家族木聚糖酶不具備木聚糖結合域，因此在水解天然底物(如麥麩、稻穀和秸杆等)時，酶分子與纖維素和木 質素之間存在空間位阻作用，妨礙酶分子的水解作用(Sunna ei a人，2000)。木聚糖酶的進化可能是通過酶蛋白分子結構域之間的隨機拼接重組而實現的(Gilkes et al.，1991 ；Kulkarni et a人，1999)，酶蛋白分子中結構域的插入，剔除和置換都有可能導致酶蛋白結構功能的顯著變化(Shen et al.，1991 ；Black et al.，1996 ；Black et al.，1997 ；Sunna etal. ,2000; Lemos et al. ,2003 ；Mangala et al. ,2003 ；Latorre-Garcia et al. ,2005)。因此，利用基因工程或蛋白質工程技術對酶分子進行改造，使木聚糖酶能優先吸附於纖維素上，就可使其與底物靠近，從而可以更有效地發揮水解作用。褐色高溫單抱菌木聚糖酶A (Thermomonospora fusca xylanase,是 G/11家族中為數不多存在木聚糖結合域和連接序列的酶分子。褐色高溫單孢菌木聚糖酶A雖然不具備水解纖維素的能力，但對其具有較高的吸附結合性能(Irwin et a人，1994)。綜上所述，利用基因工程或蛋白質工程技術對酶分子進行改造，獲得較強底物結合力和水解性能的雜合木聚糖酶是可行的。在飼料エ業中，這種人工構建的雜合木聚糖酶兼備木聚糖酶和纖維素酶活性具有特殊優勢，單胃動物日糧中纖維素酶和木聚糖酶可以協同作用提高飼料(尤其是糠麩類)消化吸收率，促進動物生長，大大降低成本，提高經濟效益。
發明內容
本發明目的是解決以上提出的問題，提供一種雜合木聚糖酶atxb的製備方法。本發明是通過以下技術方案來實現的
一種雜合木聚糖酶atxb的製備方法，包括將來源於褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端,獲得雜合木聚糖酶atxb(SED IDN0:2)。作為優選，本發明還包括以下步驟
(1)雜合木聚糖酶基因atxb的構建
以pBS-T/ atx載體(T-載體購自Promega公司)為模板，Xl和Χ2為引物擴增atx片段；以pBS-T /tfx載體(T-載體購自PiOmega公司)為模板，X3和X4為引物擴增xbd片段；以上述atx和xbd為模板，Xl和X4為引物，PCR擴增得到雜合木聚糖酶基因aid (SED IDN0:1)；
Xl :5』 - CG'AATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3』
X2 :5』 -GTTGTCACCGCCGCTGGTGCCAGAGGAAATCGTGACACTGGC-3』
X3 :5， -GGCACCAGCGGCGGTGACAACCCCG-3，
X4 :5』 -GCTGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3』 ；
(2)採用pBS-T載體體系試劑盒(購自Promega公司)將割膠回收的atxb片段與T載體連接，得到pBS-T/ atxb載體；
(3)雜合木聚糖酶基因atxb在畢赤酵母(購自Invitrogen公司)中分泌表達 pBS-T/ atxb載體經及 0ガ/、/雙酶切、割膠回收目的條帶，回收的atxb與同樣經
過雙酶切的PPIC9K連接，並轉化大腸桿菌，獲得的重組表達質粒命名為pPIC9K/atxb ;大量提取重組表達質粒，用Bgl Π限制性內切酶將重組表達質粒pPIC9K/atxb線性化，濃縮線性化重組表達質粒pPIC9K/atxb,電擊轉化畢赤酵母GSl 15感受態細胞(購自Invitrogen公司)，篩選陽性轉化子，陽性轉化子分泌表達雜合木聚糖酶atxb (SED ID N0:2)。本發明的有益效果(優點)如下
(I)採用SOE實現atx基因片段和褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結合域的連接，該方法在構建雜合基因構建過程中不額外引入胺基酸序列，這是其最大的優勢；現在絕大多數雜合酶的構建採用限制性內切酶識別位點的粘性末端連接，這樣會引入額外的喊基。(2)獲得的雜合酶對不溶性底物有較強的結合能力，且能夠水解纖維素，具備多功能酶的特徵；現發現的絕大多數野生木聚糖酶不具備結合、水解纖維素的能力。(3)該雜合酶水解樺木木聚糖所得的主要為低聚木糖，主要產物為木ニ糖和木三糖。木ニ糖和木三糖是功能性低聚木糖的主要成分，其益生作用顯著高於其他低聚木糖。(4)該雜合基因表達採用的畢赤酵母表達系統，該系統具備安全，不分泌毒性代謝產物且易培養的特點，較大腸桿菌表達系統、動物細胞表達系統具有明顯的優勢。該特點使得雜合酶atxb的發酵生產具有明顯優勢。
圖I是雜合木聚糖酶基因atxb序列及其推譯的胺基酸序列。圖2是本發明實施例的雜合木聚糖酶atx和atxb、木聚糖酶tfx分子結構示意圖。圖3是本發明實施例的是木聚糖酶基因片段atx及atxb的PCR擴增。圖4是本發明實施例的T0P10F』 /pPIC9K_atxb轉化子PCR鑑定。圖5是本發明實施例的pPIC9K_atxb雙酶切電泳圖。圖I中，方框胺基酸序列為連接序列，下畫線的胺基酸序列為木聚糖結合域，其餘胺基酸序列(303-314除外)來自atx。圖2中，⑶為催化結構域，LS為連接序列，XBD為木聚糖結合域。圖3中，M為DNA Marker, I以pBS-T/ atx載體為模板PCR擴增產物(atx)，2以pBS-T /tfx載體為模板PCR擴增產物{XBD、，3雜合木聚糖酶基因PCR擴增產物(atxb)。圖4中，M為DNA Marker, 1-3為不同轉化子的PCR擴增產物。圖5中，M為DNA Marker, I為雜合木聚糖酶基因atxb的PCR產物，2為pPIC9K-atxb 皆_EcoRI 和 Afoi / 雙酶切。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
對本發明作進ー步詳細說明
木聚糖結合域在酶分子與不溶底物結合中起至關重要的作用。在已成功構建能編碼優良性能木聚糖酶的重組基因基礎上(GenBank Accession No. AY858101 )，為了提高雜合木聚糖酶atx對纖維素類不溶性底物的結合和水解能力，將來源於褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端,並在畢赤酵母中分泌表達，獲得雜合木聚糖酶atxb，其具備結合水解纖維素的能力。本發明獲得高底物結合和水解性能的重組木聚糖酶atxb的方法，包括以下步驟 構建融合木聚糖酶結合域的雜合木聚糖酶基因；
本發明的木聚糖酶基因是來源於褐色單孢菌和枯草芽孢桿菌的重組基因atx，重組基因能較好耐受飼料制粒等的高溫，重組基因GenBank登錄號為AY858101。
在分子結構上,褐色高溫單孢菌木聚糖酶A (Genebank U01242)的顯著特徵之ー就是存在連接序列和木聚糖結合域(Ghangas et al. , 1989 ；Irwin et al. ,1994)。在已獲得的雜合木聚糖酶基因atx中引入褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列木聚糖結合域編碼序列，獲得另外一個雜合木聚糖酶基因atxb (圖1,2)。為了便於atxb在畢赤酵母中的表達，在全長基因PCR擴增的外側引物中(XI和X4)分別引入及^？/和#oi/限制性內切酶識別位點。以pBS-T/ atx載體為模板，Xl和X2為引物擴增atx片段，得到約600 bp條帶，理論長度為601 bp (圖3);以pBS-T /tfx載體為模板，X3和X4為引物擴增xbd片段，得到約300 bp條帶，理論長度為362 bp (圖3);以上述atx和XBD為模板，Xl和X4為引物，PCR擴增得到雜合木聚糖酶基因atxb，長度為942 bp，其編碼314個胺基酸(圖3)。 雜合木聚糖酶基因atxb在畢赤酵母中分泌表達。pBS-T atxb載體經/雙酶切、割膠回收目的條帶。回收的atxb與同樣經過雙酶切的PPIC9K連接，並轉化並轉化大腸桿菌，獲得的重組表達質粒命名為PPIC9K-atxb0大量提取重組表達質粒，用Bgl Π限制性內切酶將重組表達質粒pPIC9K- atxb線性化，濃縮線性化重組表達質粒PPIC9K- atxb,電擊轉化畢赤酵母GSl 15感受態細胞，篩選陽性轉化子。酵母中表達產物的木聚糖酶和纖維素酶活性測定。atxb木聚糖酶的最適溫度和最適pH分別為60°C和pH5. O ;木聚糖酶在pH4. 0-9. O範圍內穩定性較好。atxb能夠結合微晶纖維素並具有纖維素酶的活性，纖維素酶的最適溫度和最適pH分別為60°C和ρΗ6· O。以下三個實施例詳細闡明了本發明的具體實施方式
。實施例I :雜合木聚糖酶基因atxb的構建
I、材料的準備
基因材料雜合木聚糖酶基因atx和褐色高溫單孢菌木聚糖酶A基因，分別位於pBS-T /atx 載體和 pBS-T /tfx 載體中。菌種大腸桿菌T0P10F』購自Invitrogen公司。穿梭載體pPIC9K,購自Invitrogen公司，表達宿主菌畢赤酵母GS115,購自Invitrogen公司。高保真DNA聚合酶、平端DNA片段加A試劑盒購自上海Sangon公司，各種限制性內切酶和T-載體購自Promega公司。化學試劑酵母浸膏和胰蛋白腖購自OXOID公司，組織培養用試劑和樺木木聚糖購自Sigma公司。其他化學試劑均為國產分析純。引物合成上海Sangon公司或上海博亞生物技術有限公司，測序由上海博亞生物技術有限公司完成。2、雜合木聚糖酶基因atxb的構建
根據雜合木聚糖酶基因atx序列和褐色高溫單孢菌木聚糖酶A木聚糖結合域序列設計4條引物，由上海Sangon公司合成。XI、X4為外側引物，X2、X3為嵌合引物，為了後續目的基因能夠定向插入到表達載體上，在外側引物Xl和X4中分別弓I入及^ /和No11限制性內
切酶識別位點。
權利要求
1.一種雜合木聚糖酶atxb的製備方法，其特徵在於將來源於褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端，獲得雜合木聚糖酶atxb (SED ID NO:2)。
2.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)雜合木聚糖酶基因atxb的構建 以pBS-T atx載體為模板，Xl和X2為引物擴增atx片段；以pBS_T tfx載體為模板，X3和X4為引物擴增xbd片段；以上述atx和xbd為模板，Xl和X4為引物，PCR擴增得到雜合木聚糖酶基因atxb (SED ID NO: I)；Xl :5』 - CG'AATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3』X2 :5』 -GTTGTCACCGCCGCTGGTGCCAGAGGAAATCGTGACACTGGC-3』X3 :5， -GGCACCAGCGGCGGTGACAACCCCG-3，X4 :5，-GCTGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3，； (2)採用pBS-T載體體系試劑盒將割膠回收的atxb片段與T載體連接，得到pBS_Tatxb載體； (3)雜合木聚糖酶基因atxb在畢赤酵母中分泌表達 pBS-T atxb載體經EcoRI、Not I雙酶切、割膠回收目的條帶，回收的atxb與同樣經過雙酶切的PPIC9K連接，並轉化大腸桿菌，獲得的重組表達質粒命名為pPIC9K-atxb ;大量提取重組表達質粒，用Bgl II限制性內切酶將重組表達質粒pPIC9K_atxb線性化，濃縮線性化重組表達質粒pPIC9K-atxb，電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，篩選陽性轉化子，得到雜和木聚糖酶atxb (SED ID NO:2)。
全文摘要
一種雜合木聚糖酶atxb的製備方法，將來源於褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端，獲得雜合木聚糖酶atxb。該雜合酶水解樺木木聚糖所得的主要為低聚木糖，主要產物為木二糖和木三糖，木二糖和木三糖是功能性低聚木糖的主要成分，其益生作用顯著高於其他低聚木糖；另外，該雜合基因表達採用的畢赤酵母表達系統，該系統具備安全，不分泌毒性代謝產物且易培養的特點，較大腸桿菌表達系統、動物細胞表達系統具有明顯的優勢，該特點使得雜合酶atxb的發酵生產具有明顯優勢。
文檔編號C12N9/42GK102676479SQ20121018416
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月2日 優先權日2012年6月2日
發明者劉明啟, 孫建義, 翁曉燕, 詹儀花 申請人:浙江大學