蛋白質層析純化填料的清潔方法
2023-05-11 21:46:51 2
蛋白質層析純化填料的清潔方法
【專利摘要】本發明屬於蛋白質的分離純化領域，涉及蛋白質層析純化填料的清潔方法，其是用清潔有效量的質量體積比濃度為0.05%-5%的苯扎氯銨水溶液清潔所述的蛋白質層析純化填料，並優選用質量體積比濃度為0.1%-1%的苯扎氯銨水溶液清潔所述的蛋白質層析純化填料。利用該方法清潔蛋白質層析純化填料，可以在保證甚至提高清潔效果的基礎上大幅度的降低清潔過程對蛋白質層析純化填料結合能力的破壞，從而延長蛋白質層析純化填料的使用壽命。
【專利說明】蛋白質層析純化填料的清潔方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蛋白質層析純化填料的清潔方法。
【背景技術】
[0002]層析(chromatography),也稱為色譜，是分離純化蛋白質最重要的手段。根據分離純化原理的不同，蛋白質層析種類可以分為離子交換層析(ion exchangechromatography, IEC)、凝膠層析(gel filtration chromatography, GFC)或分子排阻層析(size exclusion chromatography, SEC)、疏水層析(hydrophobic interactionchromatography, HIC)與親和層析(affinity chromatography, AC)等主要類別。
[0003]由於層析過程中引入的微生物、熱原(內毒素)等物質會汙染層析獲得的蛋白質，破壞、降解蛋白質或影響蛋白質作為藥物使用時的安全性；而蛋白質本身又很容易汙染微生物、熱原(內毒素)等物質引起層析系統的汙染，進而汙染後續層析處理的蛋白質，所以在每次層析填料使用後，下次層析填料使用前都優選對層析填料進行清潔處理，而在藥用蛋白質的生產中在層析填料的每次使用後更是必須進行清潔處理。
[0004]蛋白質層析填料的清潔通常使用強酸(如0.Ι-lmol/L鹽酸或醋酸)、強鹼(如0.2-2mol/L氫氧化鈉)、高濃度鹽(如l_5mol/L NaCl)、有機溶劑(如5-50%(v/v)乙醇)等清潔劑中的一種，也可以組合使用或順序使用它們中的幾種。但一方面這種使用不一定完全清除層析填料汙染的雜質，另一方面這種使用還有可能破壞層析填料，從而影響層析填料的壽命和/或結合能力。這一點對親和層析填料的影響尤其明顯，更尤其對以蛋白質為配基的親和層析填料影響非常明顯。
[0005]當親和層析填料中的配基為蛋白質，例如抗體時，由於蛋白質遇強酸、強鹼、強有機溶劑、高濃度鹽時極容易變性，而親和層析純化的原理利用的又是親和層析填料配基與目標蛋白質之間基於各自構型與活性的高度特異性結合，所以以蛋白質為配基的親和層析填料不能用常規的強酸、強鹼、強有機溶劑、高濃度鹽處理，這也就造成了這類填料清潔處理的困難。基於這一問題，在治療用單克隆抗體類藥物的層析純化過程中，使用了修飾蛋白A (Protein A)配基的MabSelect系列填料,其可以耐受0.1-0.5mol/L氫氧化鈉短時的清潔處理。但使用該系列填料層析純化單克隆抗體卻大大增加了層析純化的成本，且層析填料耐強鹼處理的能力也只是得到了有限的提高。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種蛋白質層析純化填料的清潔方法，以在保證甚至提高清潔效果的基礎上大幅度的降低清潔過程對蛋白質層析純化填料結合能力的破壞，從而延長蛋白質層析純化填料的使用壽命。
[0007]為實現此目的，在基礎的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其是用清潔有效量的質量體積比濃度為0.05%-5%的苯扎氯銨(苯扎氯銨也稱為「潔爾滅」)水溶液清潔所述的蛋白質層析純化填料。[0008]本發明所述的蛋白質層析純化填料可以是任何類型可以用於純化蛋白質的層析填料，優選離子交換層析填料、凝膠或分子排阻層析填料、疏水層析填料和親和層析填料，更優選親和層析填料，並最優選以蛋白質為配基的親和層析填料。
[0009]本發明所述的蛋白質可以是任何天然的或重組的蛋白質；可以是結構蛋白質，也可以是功能蛋白質；可以是藥用的蛋白質，也可以是非藥用的蛋白質，但優選藥用的蛋白質。
[0010]本發明所述的蛋白質層析純化填料的清潔方法可以是在位清潔，也可以是拆卸層析純化填料後的離線清潔，但優選在位清潔。在位清潔時可以用質量體積比濃度為0.05%-5%的苯扎氯銨水溶液連續衝洗層析填料，衝洗體積優選3-200個柱體積；也可以在將清潔液充滿所述的蛋白質層析純化填料後，密閉裝填所述的蛋白質層析純化填料的蛋白質層析純化柱一段時間以達到清潔作用，密閉層析柱的時間優選在0.5-10小時之間；還可以綜合以上兩種方法，以既可減少清潔液連續衝洗所述的蛋白質層析純化填料的體積，也可縮短密閉層析柱後的清潔時間。
[0011]本發明清潔所述的蛋白質層析純化填料的苯扎氯銨的濃度可以通過測試下文所述的蛋白質層析純化填料的清潔效果，以及清潔前後蛋白質層析純化填料的結合能力的變化確定，同時還要考慮苯扎氯銨在水中的溶解性、苯扎氯銨在清潔後是否會有殘留。由此確定的苯扎氯銨的質量體積比濃度為0.05%-5%，更優選質量體積比濃度為0.1%_1%。
[0012]本發明的蛋白質層析純化填料的清潔效果可以通過多種方法確定，例如從每次清潔完成後下次平衡層析柱時收集的層析柱流出液中取樣進行無菌試驗或內毒素檢測試驗。無菌試驗或內毒素檢測試驗的方法可分別參照《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄XII A 「無菌檢查法」與附錄XII E 「細菌內毒素檢查法」。
[0013]本發明的蛋白質層析純化填料的結合能力的變化可以通過多種方法測定，例如可以分別測定蛋白質層析純化前填料中配基的密度，以及蛋白質層析純化結束並進行蛋白質層析純化填料的清潔後填料中配基的密度，由此計算得到配基密度變化的百分率，即得到蛋白質層析純化填料結合能力變化的百分率。但這種方法比較繁瑣，更簡便的方法是測定每次清潔前後蛋白質層析純化填料飽和吸附量的變化，由此計算得到蛋白質層析純化填料飽和吸附量變化的百分率，即得到蛋白質層析純化填料結合能力變化的百分率。而蛋白質層析純化填料飽和吸附量的測定方法則屬於本領域技術人員的公知常識，在此不再贅述。
[0014]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其使用質量體積比濃度0.1%-1%的苯扎氯銨水溶液清潔所述的蛋白質層析純化填料。
[0015]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其使用3-200個柱體積的苯扎氯銨水溶液清潔所述的蛋白質層析純化填料。
[0016]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其是用所述的苯扎氯銨水溶液連續衝洗所述的蛋白質層析純化填料3-200個柱體積以達到清潔作用。
[0017]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其是將所述的苯扎氯銨水溶液充滿所述的蛋白質層析純化填料後，密閉裝填所述的蛋白質層析純化填料的蛋白質層析純化柱0.5-10小時以達到清潔作用。
[0018]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其中所述的蛋白質層析純化填料是親和層析純化填料。
[0019]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料是Sepharose 4 FF。
[0020]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料上偶聯的配基為蛋白質。
[0021 ] 在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料上偶聯的配基為抗體。
[0022]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料上偶聯的配基為蛋白A (Protein A)或蛋白G (Protein G)。
[0023]在一種優選的實施方案中，本發明提供蛋白質層析純化填料的清潔方法，其中所述的蛋白質層析純化填料純化的蛋白質是幹擾素或幹擾素的抗體。
[0024]本發明中使用的術語「蛋白質層析純化」是指利用色譜或層析的原理對蛋白質進行分離純化的過程，一般是將蛋白質層析純化填料裝填到專門的層析柱中進行。一個蛋白質層析純化流程一般包括平衡、上樣、衝洗、洗脫、清潔、再生等操作。其中平衡操作是將蛋白質層析純化填料內部的環境轉換到與上樣蛋白質所處的環境一致的操作；上樣操作是讓蛋白質通過蛋白質層析純化填料，從而讓蛋白質層析純化填料對不同的蛋白質起到選擇性吸附作用的操作；衝洗操作是在蛋白質上樣後繼續用溶液處理蛋白質層析填料，直至蛋白質純化填料的流出液中不含蛋白質組分，溶液組成與平衡用溶液的組成相同的操作；洗脫操作是從蛋白質層析純化填料上分開或一次洗下各種吸附蛋白質的操作；再生操作是讓蛋白質層析填料恢復蛋白質吸附能力的操作。
[0025]本發明中使用的術語「填料」是指對蛋白質進行層析分離純化所使用的材料，也稱為膠、凝膠或介質，結構組成上包括基質(matrix)、配基(ligand)或功能基團(functionalgroup)、手臂(arm)等。
[0026]本發明中使用的術語「清潔」是指在蛋白質層析純化填料每次純化蛋白質後去除其中死結合或殘留的雜質，尤其是微生物、熱原(內毒素)類雜質的過程。
[0027]本發明中使用的術語「清潔液」是指對所述的蛋白質層析純化填料起到清潔作用的清潔劑的溶液。例如在現有技術中可以是強酸(如0.Ι-lmol/L鹽酸或醋酸)、強鹼(如0.2-2mol/L氫氧化鈉)、高濃度鹽(如l_5mol/L NaCl)、有機溶劑(如5-50%(v/v)乙醇)等，在本發明中是苯扎氯銨的水溶液。
[0028]本發明中使用的術語「清潔有效量」是指能較為徹底的清除掉蛋白質層析純化填料上死結合或殘留的雜質所需的清潔液的體積。
[0029]本發明中使用的術語「在位清潔」是指不將蛋白質層析純化填料從所在的層析柱上拆卸下來，而直接用清潔液在層析柱上清潔所述的蛋白質層析純化填料的過程。
[0030]本發明中使用的術語「柱體積」是指將蛋白質層析純化填料裝填到層析柱上後，在實際層析操作中蛋白質層析純化填料所佔有的體積。
[0031]應當指出，上述解釋的本發明中使用的一些術語的含義及上述未解釋的本發明中使用的其它術語的含義均是本領域技術人員公知的。之所以對本發明中使用的這些術語的含義作出解釋，是為了便於審查員，及本發明相關的技術人員、市場銷售人員、法律人員理解本發明，因此這些對本發明中使用的術語的含義的解釋不應當理解為對本發明的限制。【具體實施方式】
[0032]通過如下的實施例對本發明的實施作進一步說明，但本發明的實施方式並不局限於如下的實施例。
[0033]實施例1:不同清潔液對偶聯單克隆抗體配基的親和層析填料的清潔對比試驗(一)
[0034]用NHS活化的S印harose 4 FF填料(貨號17-0906-01或17-0906-02)裝填四根內徑為10_的層析柱，每根裝填Iml填料。然後根據填料製造商GE Healthcare在產品說明書中提供的偶聯條件將商品化的幹擾素α的單克隆抗體(PBL公司製造，北京市吉泰新繹生物科技有限公司代理銷售，貨號21100-2)分別偶聯到已裝填四根層析柱的NHS活化的Sepharose 4 FF 填料上。
[0035]對各層析柱分別用50mmol/L PB, 0.2mol/L NaCl，pH7.0溶液平衡，上常規實驗室環境下製備與保存，而未經無菌操作、處理與保存的濃度為lmg/ml的幹擾素α Ib樣品(按《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄IV C規定的「SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法」法測定純度大於95% ;按《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄XII A規定的「無菌檢查法」測定其中菌落數大於80000CFU/ml ;按《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄XII E規定的「細菌內毒素檢查法」測定其中內毒素含量大於10000Eu/ml，同樣的檢測項目在下文的測試中方法相同)，直至檢測器檢測到上樣流穿液中出現蛋白質時停止上樣(最直接的指標是上樣流穿液的紫外吸收值開始明顯增加)。根據上樣流速、上樣時間與上樣濃度計算幹擾素alb樣品的總上樣量。上樣結束並經與平衡溶液相同的溶液衝洗後分別用lOOmmol/L甘氨酸-鹽酸，0.2mol/L NaCl，pH3.0溶液洗脫上樣的幹擾素a lb。洗脫結束後對各層析柱分別用0.05% (m/v)苯扎氯銨水溶液連續衝洗200個柱體積，用20% (v/v)乙醇水溶液、0.2mol/L醋酸水溶液、0.2mol/L氫氧化鈉水溶液連續衝洗10個柱體積(要求這些溶液中熱原(內毒素)含量小`於0.5Eu/ml,菌落數小於lCFU/ml),然後再對各層析柱分別用除菌除熱原(內毒素)的純化水(要求其中熱原(內毒素)含量小於0.5Eu/ml，菌落數小於lCFU/ml)衝洗3個柱體積。衝洗臨結束前收集層析柱流出液樣品進行內毒素含量測定，得清潔後流出液內毒素含量；並對用苯扎氯銨清潔的層析柱收集流出液樣品進行苯扎氯銨的高效液相色譜法含量測定(測定條件為:層析柱phenomenex C18 (250mmX4.6mm, 5 μ m),流動相A為0.2mol/L庚烷磺酸鈉(含0.1%三乙胺，用磷酸調pH至3.0+0.1 )，流動相B為100%乙腈，流動相A與B的比值為35:65，流速1.0ml/min,柱溫25°C，進樣體積40 μ L，檢測波長210nm ;此方法經方法學驗證檢測限小於0.00025mg/ml)。以上平衡、上樣、衝洗、洗脫、清潔等層析操作的線性流速均為150cm/h。
[0036]重複前段所述的操作9次，按同樣的方法取樣進行測定與計算。
[0037]以下表1列出了各層析柱10次操作的情況與操作中取樣檢測、計算的結果。
[0038]表1不同清潔液對偶聯單克隆抗體配基的親和層析填料的清潔對比試驗結果(一)
[0039]
【權利要求】
1.一種蛋白質層析純化填料的清潔方法，其特徵是用清潔有效量的質量體積比濃度為0.05%-5%的苯扎氯銨水溶液清潔所述的蛋白質層析純化填料。
2.根據權利要求1所述的清潔方法，其特徵是所述的苯扎氯銨水溶液的質量體積比濃度為 0.1-1%。
3.根據權利要求1所述的清潔方法，其特徵是用所述的苯扎氯銨水溶液連續衝洗所述的蛋白質層析純化填料3-200個柱體積以達到清潔作用。
4.根據權利要求1所述的清潔方法，其特徵是在將所述的苯扎氯銨水溶液充滿所述的蛋白質層析純化填料後，密閉裝填所述的蛋白質層析純化填料的蛋白質層析純化柱0.5-10小時以達到清潔作用。
5.根據權利要求1所述的清潔方法，其特徵是所述的蛋白質層析純化填料是親和層析純化填料。
6.根據權利要求5所述的清潔方法,其特徵是所述的親和層析純化填料是Sepharose4 FF0
7.根據權利要求5所述的清潔方法，其特徵是所述的親和層析純化填料上偶聯的配基為蛋白質。
8.根據權利要求7所述的清潔方法，其特徵是所述的親和層析純化填料上偶聯的配基為抗體。
9.根據權利要求7所述的清潔方法，其特徵是所述的親和層析純化填料上偶聯的配基為蛋白A或蛋白G。
10.根據權利要求1-9之一所述`的清潔方法，其特徵是所述的蛋白質層析純化填料純化的蛋白質是幹擾素或幹擾素的抗體。
【文檔編號】C07K1/22GK103554216SQ201310547219
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】楊大軍, 餘軍陽, 韓志剛, 周敏毅, 阮乾坤, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司