用物質加減法對質譜判斷滯留層析中蛋白指紋的用途的製作方法
2023-05-11 21:36:51
專利名稱：用物質加減法對質譜判斷滯留層析中蛋白指紋的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法，具體指用於生物樣品分析的蛋白指紋法。本發明還涉及用滯留層析法捕獲蛋白質組並採用計算機可讀取的條碼格式(蛋白指紋)分析的蛋白指紋法。所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定採用了加減法，即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量的意義。蛋白指紋法確定某生物樣品在第一和第二(加入或減去某種物質)樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了其分子量在生物樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。
背景技術：
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決於細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑑定細胞內表達的蛋白質的區別，可用於診斷疾病，並最終用於藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的複雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用於分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行定性鑑定和定量分析。
如，一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內等電點聚焦先分離蛋白質，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳進行第二次分離。結果得到一張根據等電點範圍(淨電荷)和大小(質量)來區分蛋白質的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特徵—質量和等電點(pl)。其次，各維度的解析度受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區分質量差異小於5％或pl差異的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量表達的生物分子。第四，無法觀察到分子量低於約10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測出疾病的已知標記。但是，製備特異性結合標記並且能在複雜的混合物中鑑別出標記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類診斷方法的發展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多維度分析卻困難而費時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質譜的方法測定蛋白質是較新的方法。但沒有與滯留層析法聯合應用時，質譜分析方法只能對蛋白質進行定性分析，無法進行定量分析，尤其在是樣品中混合物複雜，蛋白質含量極小的情況下。
蛋白指紋技術最早源於馬鈴薯/土豆品種鑑定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。當時用電泳技術來區別分不同品種土豆。因為不同品種的土豆在電泳下有不同的蛋白指紋組合。由於人體細胞蛋白比土豆要複雜的多，故僅用電泳來鑑別疾病的蛋白指紋遠遠不能滿足臨床需要。
滯留層析法是上世紀90年代開發的一種新的生物分析方法(Singh TK，Fox PF，HealyA.J Dairy Res.62，629-640；1995 and Siegel MM，Tabei K，Bebernitz GA，Baum EZ.J Mass Spectrom.33，264-273；1998)，有人將其用於分子生物學和細胞生物學的研究中。滯留層析中先將待測樣品與選定的吸附劑結合，然後檢測滯留在吸附劑上的分析物。與常規層析不同，進行滯留層析時無需將分析物先從吸附劑上洗脫，而是直接進行檢測。滯留層析與質譜聯合應用其優點是能夠從複雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物分子量。並且能夠根據分子量大小將生物樣品組成按條碼格式排列。用滯留層析法可以將血清蛋白排出成千上萬條分子量帶。但目前人血液中只有289個蛋白分子量可以被臨床應用，未見到文獻有用滯留層析法進行蛋白指紋鑑定分析並且解讀出成千上萬條分子量帶的方法學(Anderson NL and Anderson NG，Molecular Cellular Proteomics 1845-867；2002)。
發明內容
本發明的目的是建立一種確定某生物樣品在第一和第二樣品中蛋白指紋差異存在的意義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖；B)測定生物樣品在第二樣品中(減去某種物質某種特異性單克隆抗體柱子處理過的，或加入某種物質)相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖；和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之間的差異。利用加減物質法來判斷兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了分析物在樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。
本發明採用蛋白指紋法對蛋白質組進行鑑別。
蛋白指紋法是通過鑑別檢測特定的蛋白質組用於疾病診斷。蛋白質組學(Proteomics)的定義是研究一組蛋白質在細胞終身表達的變化狀態。蛋白質組學的目的之一是鑑定和描述由於不同細胞差異表達的有機生物分子。通過比較表達情況可以鑑定細胞內表達的蛋白質的區別。鑑別出可作為某種疾病標誌的蛋白質組，可用於該疾病的診斷及治療藥物的篩選。
本發明所述的鑑別檢測蛋白質組的方法是質譜法。
本發明用滯留層析法從複雜的樣品混合物中準確地分辨出並捕獲到用於檢測的蛋白質組。滯留層析法是將樣品與用於解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測系統所無法達到的高信息分辨能力鑑定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細胞或組織液提取物中差異表達的蛋白質)。根據吸附劑/洗脫劑組合的化學特性測定包括分子量在內的理化特徵的蛋白質。詳述本方法如下I吸附劑包含陰離子，陽離子，親水，疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有捕獲生物樣品中蛋白質的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質，配位共價金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內存在組氨酸殘基)。更具體的說，可以用陰離子吸附劑捕獲生物樣品中所有帶陽離子的蛋白質，然後用質譜儀去讀出分子量(條碼帶)。
II信息處理在特定洗脫條件下檢測被吸附結合的分析物提供了有關樣品中分析物及其化學特徵的信息。吸附作用在一定程度上取決於吸附劑的結合特性。與吸附劑結合的分析物具有使得結合成為可能性的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結合。強陽離子分子只有在很強的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離和與不具有結合所需的相應化學特性的分析的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑑定出了具有特定化學特性的一類或單一分析物。採集有關分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細分辨混合物中的分析物，而且提供有關分析物的化學信息，這些信息本身就可以完成對他們的鑑定。這種數據被稱為「滯留數據」。
用可編程計算機分析滯留試驗得出的數據是最簡單的。電腦程式一般包括一個儲存編碼的可讀介質。某計算機編碼進入存儲，其中包含了基質陣列上各種徵點的位置，該處的吸附和用來洗滌吸附劑的洗脫條件。程序於是可用這些信息鑑定出陣列上確定某選擇性的一組特徵。計算機還包括這樣的編碼，它們接受來自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號強度數據。這些數據指示所測分析物的數量，可能包括所測各分析物的信號強度和測得的分子量。
計算機還具有處理數據的編碼。實施例之一中，處理方法涉及形成一個分析物識別特徵概況。例如，可將據分子量測得的特定分析物的滯留數據根據特定的結合特性(例如與陰離子吸附劑)分類。收集到的數據提供某特定分析物化學特徵的概況。滯留特性反映分析物功能，後者繼而反映結構。例如，根據不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數據所揭示的信息可以得出某蛋白質的等電點。這進而反映出該蛋白質內離子胺基酸的大致數量。所以，計算機可能包含將結合信息轉化結構信息的編碼。而且，對分析物的二次處理(例如翻譯後修飾)改變識別特徵，這可以由結合或質量差異反映出來。
得出的數據即蛋白指紋，它可以各種格式顯示。一種格式中，信號強度顯示成分子量的函數圖。另一種格式又稱「條碼格式」，其中，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示，得出外觀類似商場上所用條碼帶讀取商品名稱。
III滯留層析分離方法的組合—差異蛋白質展示實施例對該方法進行了詳細的描述。生物樣品通常包含數以百千計的蛋白質。人們可能希望準確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，陰離子吸附劑。
舉例，如用陰離子吸附劑，可以將某種pH值狀況下的血清中所有帶正點的蛋白質捕獲至吸附劑上。然後用質譜讀出各自的分子量，按分子量大小排列出條碼格式。計算機將記住這種條碼格式。第二步，將這份血清通過一個單克隆抗體柱子(如抗胰島素或抗生長激素)，胰島素或生長激素被捕獲並留在柱子上。然後，用上述同樣方法去分析，就可以產生沒有胰島素或生長激素的條碼格式。
通過分析兩種條碼格式差異，計算機能夠知道某種條碼帶(分子量)是來自於胰島素或生長激素。
本發明利用這種方法學，可無限量地解讀每種條碼帶中的肽類、蛋白質或小分子(如血清藥物)指紋的意義。
這種方法學可以比目前所有生化診斷手段(ELISA，免疫螢光法)更有優勢。
IV鑑定生物材料間差異表達的分析物的方法本發明的另一方面內容提供了鑑定在兩種以上樣品中差異表達的有機生物分子，特別是蛋白質的方法。「差異表達」指兩樣品間分析物量或質上的差異。這些差異可能緣於蛋白質表達的任一階段，該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組解析度高、可比較的分析物數量多的製備條件。
然後，比較識別圖以鑑定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達的正調控或負調控。差異滯留還包括分析物質的差異。例如，蛋白質翻譯後修飾的不同會造成識別圖的不同，檢測時表現為結合特性差異(例如，如果蛋白質被糖基化與凝集素結合將不同)或質量差異(例如翻譯後切割的不同)。這種分析也可以用可編程計算機進行。
本發明提供一種統一的作業系統，用於蛋白質功能，細胞功能和生物整體功能的發現和診斷。
更具體的說，根據分析物在至少兩種不同選擇條件下吸附固定相的能力(例如陰離子/陽離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然後，用解吸譜(例如雷射解吸質譜)根據質量在第二維度上分離分析物，進一步檢測已分離的分析物。分析物所吸附的性質提供了分析物的物理化學信息。
在實施例中，所述的方法包括I)分析物與確切位置上的第一選擇性條件(吸附劑)接觸，使得分析物被吸附劑保留。II)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物。III)檢測步驟包括用雷射解吸質譜測定分析物的質量。
洗脫條件的差異在於pH，緩衝能力，離子強度，水結構特徵，除垢劑種類，除垢劑強度，疏水性或介電常數。
本發明提供一種確定某分析物在第一和第二品中是否存在差異(例如差異表達)的方法。該方法可以用於通過差異蛋白質展示來檢測差異蛋白表達的組合方法。該方法包括A)測定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；B)測定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和C)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在的意義。
實施例之一是測定某種蛋白指紋在生物樣品中的意義。
滯留層析及蛋白指紋方法的具體操作步驟以下是用本發明提供的滯留層析及蛋白指紋方法的一個操作方案實例。
1.樣品處理將生物樣品稀釋在溶液中。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點樣在基質(包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑)一個位點上。
3.洗滌用結合溶劑洗滌。在樣品完全乾燥前將第一份2μL洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進幾次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μL洗滌液重複以上步驟。
用水徹底洗滌整個陣列。
自然乾燥吸附劑支持物。
加0.5μL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的製備的標準溶液)。
自然乾燥吸附劑支持物。
用雷射解吸/離子化飛行時間質譜儀用氮雷射儀(337nm)和80cm飛行管分析陣列分析滯留與各位點的蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。
蛋白指紋圖譜的重大意義在於定期監測人體活動或血液中蛋白指紋的動態變化狀態。
本發明提供的方法的特點為(1)準確滯留層析的一個特點是能夠從複雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。所以，滯留層析可提供有關滯留分析物化學或結構特徵的直接信息。
滯留層析與常規層析存在以下區別。首先，滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然後進行檢測。用常規層析方法常常檢測不出吸附劑上洗脫下的分析物。第二，滯留層析與解吸質譜檢測相結合提供了毫微微摩爾級的優良靈敏以及極高的解析度。第三，在一定程度上，因為允許直接檢測分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供多樣品中分析物的快速維度的描述。第四，吸附劑可以於預先確定的排列，可定址位置附著於基質上。這就能夠對在不同洗脫條件下接觸不同吸附位置(即，「親合性位置」或「位點」)的分析物進行並行處理。
蛋白質是由胺基酸組成的而胺基酸的平均質量為100Da。質譜直接分析有很強的準確性，一般誤差率只有0.01％-0.1％。例如，檢測出7030Da及7110Da被配位共價金屬螯合劑表面的基質所捕捉的蛋白，由於質譜差率只有0.01％-0.1％，蛋白7030Da及7110Da不可能是同一種蛋白質。因此，蛋白指紋法可分辨蛋白質。
(2)方便本方法將蛋白質分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析。
(3)快捷用本發明提供的蛋白指紋法進行疾病診斷時，無需對蛋白質進行測序。本發明採用了計算機「條碼格式」，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄並用分析軟體自動分析對比強弱，從而有助於臨床複雜的診斷，如可用此「蛋白指紋」或條碼格式進行醫學分析。
具體實施例方式
實施例1 生物樣品中蛋白指紋圖譜差異表達區分意義(1)實驗方法一、材料1.標本來源10例正常人血清，8例肺炎病人的血清。
2.試劑Protein A and G、人標準血清、人生長激素、胰島素(分子量5807Da)、抗胰島素抗體、抗人血清澱粉樣蛋白A抗體、乙腈、三氟乙酸、SINAPINIC酸(Sinapinicacid)、CHAPS、Urea、NaAC、Tris-HCl均購自Sigma公司或贈送。
3.質量控制A.人標準血清(Sigma)，加入人生長激素(Sigma)，調製人生長激素在標準人血清中的濃度為50ng/ml。B.質譜雷射能量調控每次測試前，用上述人標準血清，將人生長激素的峰值為50％時的雷射能量設為標準值。
二、方法1.樣品的收集全血採集後吸取血清，置於-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉/分，4℃離心2分鐘；取上清液。
2.樣品的準備A每個陰離子吸附劑支持物點需要血清3μl，將血清用2倍體積U9緩衝液(9M Urea，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀釋(例如3μl血清用6μl U9緩衝液稀釋)。將樣品充分混勻。將9μl上述變性後樣品加入111μl相應的結合緩衝液(50mM NaAC，pH4.0)，使得血清的總稀釋倍數達到約40倍。將處理好的血清樣品40μl上樣到陰離子吸附劑上。
3.樣品的準備B先將1種抗體結合至一個Protein A柱子(Column)上(一個柱子1種抗體)，然後將血清樣品樣本加載到柱子中並在室溫條件下輕微震蕩0.5小時。取上清液。每個晶片點需要血清3μl，將血清用2倍體積U9緩衝液(9M Urea，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀釋(例如3μl血清用6μl U9緩衝液稀釋)。將樣品充分混勻。將9μl上述變性後樣品加入111μl相應的結合緩衝液(50mM NaAC，pH4.0)，使得血清的總稀釋倍數達到約40倍。將處理好的血清樣品40μl上樣到陰離子吸附劑上。
4.樣品檢測上樣，在吸附劑支持物中加入40μl處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉/分，4℃震蕩1小時。甩出樣品，每孔加入200μl的結合緩衝液(50mM NaAc，pH4.0)，室溫置振蕩器400-600轉/分，震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入結合緩衝液200μl，重複操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。取出吸附劑支持物後，待幹後，樣品加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然乾燥。
5.質譜中，就會生成飛行時間質譜。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。
(2)實驗結果分析10例正常人血清中蛋白質的組成。
先用加入法在正常人血清中加入胰島素(Insulin)，我們可以看到5807分子量的物質增加(
圖1，A)。這證明胰島素的分子量5807Da，即見箭頭所示的條碼帶為胰島素。
然後用減法將上述血清通過抗胰島素的柱子(Anti-Insulin Immunoassay，圖1)，我們看到5807Da分子量的條碼帶消失了(圖1，B)這也證明5807Da條碼帶是胰島素。
分析8例肺炎病人的血清，已知該血清中血清澱粉樣蛋白A(Serum Amyloid A，SAA)增加。假設我們不知道血清澱粉樣蛋白A(SAA)已知條碼帶位置(圖2，A)。血清通過抗血清澱粉樣蛋白A(抗SAA)的柱子(Anti-SAA Immunoassay，圖2)後，我們可以發現箭頭下11.5kDa的條碼帶消失了(圖2，B)。這證明11.5kDa條碼帶是血清澱粉樣蛋白A(SAA)。
(3)結論用滯留層析法捕獲生物樣品、進行質譜分析的蛋白指紋法—可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發明提供確定某生物樣品在第一和第二樣品中差異存在的意義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖；B)測定生物樣品在第二樣品中(加入某種物質；或減去某種物質某種特異性單克隆抗體柱子處理過的)相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖；和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之間的差異。兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了分析物在樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。在理論上，當特異性抗體量無限地增加，所測定蛋白指紋條碼帶中單一蛋白指紋的意義可以相應增大。另可以將某種蛋白質從抗體柱子上還原，然後將這種蛋白質用胰蛋白酶切成多肽指紋或做N-端胺基酸序列分析以鑑定蛋白質分子序列，即最精確鑑別(金標準)。
權利要求
1.一種用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質組的蛋白質分析方法，其特徵是採用蛋白指紋法對生物樣品中蛋白質組進行鑑別檢測。
2.權利要求1所述的蛋白質分析方法，其中所述的鑑別檢測蛋白質組的方法是質譜法。分析所得數據的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)—蛋白指紋法，其質譜分析範圍為0～500kDa。每一條碼帶代表一種分子量，其顏色深淺代表蛋白質量多與少。
3.權利要求2所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定採用了加減法，即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量的意義。蛋白指紋法確定某生物樣品在第一和第二(加入或減去某種物質)樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了其分子量在生物樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。
4.權利要求1所述的蛋白質分析方法，其中所述的蛋白指紋(條碼格式或質譜分子量的函數圖)可以被編程計算機存儲和用軟體分析。
5.權利要求1所述的蛋白質分析方法，在滯留層析法中所用的吸附劑包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑。
6.權利要求1中滯留層析法所用吸附劑的支持物可以是金屬片，玻璃片，陶瓷片，陶瓷珠，磁性微粒或多聚體。
7.權利要求3所述的加減法中，減去某種物質所用的抗體吸附表面物質是任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質，如蛋白A和G(Protein A and Protein G)柱子。
8.權利要求7中抗體吸附表面物質是用於捕獲抗原標記的單克隆或多克隆抗體。可以無限量地增加抗體組來達到無限量地檢測多個或多種蛋白指紋。
9.權利要求1所述生物樣品來源於血液，體液，分泌物，細胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物。生物樣品可以來自動物與植物。
10.權利要求1所述蛋白指紋圖譜在定期監測生物樣品中蛋白指紋動態變化的用途。
全文摘要
本發明涉及一種用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質組，然後用質譜法進行分析的蛋白指紋法。分析所得蛋白質分子量的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發明提供一種確定某生物樣品中質譜條碼格式的意義。所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定採用了加減法—即加入或減去某種物質來確定其質譜分子量的意義。本發明的方法可用於正常人與病人的蛋白指紋條碼帶的鑑定。蛋白指紋圖譜的重大意義在於定期監測人體活動或血液中蛋白指紋的動態變化。本方法準確、方便且快捷。
文檔編號G01N30/86GK1661367SQ20041000443
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月23日 優先權日2004年2月23日
發明者許洋 申請人:許洋