一種抗人4-1BB單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-04-29 03:26:35

一種抗人4-1bb單克隆抗體及其應用
技術領域
1.本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種抗人4-1bb單克隆抗體及其應用。


背景技術：

2.4-1bb又名cd137，屬於腫瘤壞死因子(tnf)受體家族的成員，由腫瘤壞死因子受體超家族成員9(tnfrsf9)基因編碼，在活化後表達於多種免疫細胞上，包括t細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞。通過4-1bb信號傳導可誘導細胞因子誘導，防止活化誘導的細胞死亡，並上調細胞毒性t細胞活性；4-1bb也可能減少調節性t細胞對腫瘤的浸潤。
3.現有的4-1bb抗體還未有上市的藥物，目前多處於臨床及臨床前研究階段，在結合抗原活性、激活t細胞下遊信號等方面還有許多的不足。


技術實現要素：

4.為解決上述技術問題，本發明提供一種抗人4-1bb單克隆抗體，能夠特異性的與4-1bb分子結合併表現對免疫細胞的激活特性，可通過免疫調節作用對多種癌症的治療具有應用潛力。
5.本發明的第一個目的是提供了一種抗人4-1bb單克隆抗體，
6.(1)、所述抗人4-1bb單克隆抗體的重鏈可變區的三個cdr區：cdr1(gdsitsgy)、cdr2(ksysgst)和cdr3(arsllwlgamdy)的胺基酸序列分別如seq id no.1、2和3所示；且
7.(2)、所述抗人4-1bb單克隆抗體的輕鏈可變區的三個cdr區：cdr1(qdvgta)、cdr2(was)和cdr3(qqyssypyt)的胺基酸序列分別如seq id no.4、5和6所示。
8.進一步地，所述的抗人4-1bb單克隆抗體具有：
9.(3)、其重鏈具有如seq id no.7所示的胺基酸序列(qmqlqesgpslvkpsqtlsltcsvtgdsitsgywtwirkfpgnrleymgfksysgstyynpslksrisitrdtsknqyylqlnsvttedtatyycarsllwlgamdywgqgtsvtvss)，且
10.(4)、其輕鏈具有如seq id no.8所示的胺基酸序列(madivmtqshkfmstsvgdrvsitckasqdvgtavawyqqkpgqspklliywastrhtgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedladyfcqqyssypytfgggtklemkr)。
11.本發明的第二個目的是提供一種編碼所述的抗人4-1bb單克隆抗體的核酸分子。
12.本發明的第三個目的是提供一種表達載體，含有所述的核酸分子。
13.本發明的第四個目的是提供一種重組細胞，含有所述的核酸分子，或含有所述的表達載體。
14.進一步地，所述的重組細胞的宿主細胞為cho細胞、hek293細胞、酵母細胞或植物細胞。
15.宿主細胞用於抗體的瞬時表達和穩定細胞系的構建，實現所述抗體的科研和產業化生產。
16.本發明的第五個目的是提供所述的單克隆抗體在製備4-1bb介導的疾病的治療和
預防藥物中的應用。
17.進一步地，所述的疾病為腫瘤。
18.進一步地，所述的腫瘤為肺癌、胃癌、腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌。
19.本發明的第六個目的是提供一種藥物組合物，包含：
20.(1)所述的抗人4-1bb單克隆抗體；和，
21.(2)藥學上可接受的載體。
22.藉由上述方案，本發明至少具有以下優點：
23.本發明中利用噬菌體展示技術，相較於雜交瘤技術，噬菌體展示技術可以呈現免疫動物的整個抗體庫，省去細胞融合步驟，避免了因雜交瘤不穩定而反覆亞克隆的繁瑣程序，極大的提高庫容量，從雜交瘤的幾千個克隆升至109個。本發明篩選得到的抗人4-1bb單克隆抗體在體外細胞水平驗證中，明顯增加細胞因子ifn-γ的產生及提高til中cd8+細胞比例，具有較好的激活特性。
24.上述說明僅是本發明技術方案和部分結果的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，並可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例並配合詳細附圖說明如後。
附圖說明
25.圖1、重組4-1bb-huigg1 fc融合蛋白的sds-page檢測圖譜；
26.圖2、重組4-1bb-huigg1 fc融合蛋白的結合活性；
27.圖3、重組4-1bb-huigg1 fc融合蛋白免疫小鼠效價檢測；
28.圖4、抗體輕、重鏈可變區基因的擴增；
29.圖5、抗體scfv基因的擴增；
30.圖6、elisa檢測4-1bb抗體親和力；
31.圖7、4-1bb抗體對pbmc刺激效果中ifn-γ分泌檢測；
32.圖8、4-1bb抗體在til細胞培養中對cd8+t細胞的增殖作用。
具體實施方式
33.本發明公開了抗人4-1bb單克隆抗體及其應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
34.術語：
35.除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考current protocols in molecular biology(ausubel)。
[0036]「抗體」是指由能特異結合抗原的一種或多種多肽構成的蛋白質。抗體的一種形式構成了抗體的基本結構單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構成，每一對都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區聯合在一起共同負責結
合抗原，而恆定區則負責抗體的效應器功能。
[0037]
抗體重鏈或輕鏈的「可變區」是該鏈的n端成熟區域。目前已知的抗體類型包括κ和λ輕鏈，以及α，γ(igg1，igg2，igg3，igg4)，δ，ε和μ重鏈或它們的其它類型等價物。
[0038]「抗體」包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結合的抗體片段，包括但不限於fab，fv，scfv和fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結合部分和非抗體蛋白質的融合蛋白質。
[0039]「人源化抗體」是指一種抗體，其包含來源於非人源抗體的cdr區、並且該抗體分子的其他部分來源於一種(或幾種)人抗體。而且，為了保留結合親和力，可以修飾骨架(稱為fr)區段的一些殘基。
[0040]
所述「單克隆抗體」係指具有單一分子組成的抗體分子的製備物。單克隆抗體組合物顯示出對於特定表位的單一結合特異性和親和性。
[0041]
本文使用的「cdr區」或「cdr」是指抗體的重鏈和輕鏈的高變區。存在三個重鏈cdr和三個輕鏈cdr。根據情況，本文所用術語cdr或cdrs是為了指示這些區域之一、或者這些區域的幾個或者甚至全部，所述區域包含通過抗體對抗原或其識別表位的親和力而負責結合的大部分胺基酸殘基。
[0042]
噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的dna序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。噬菌體展示技術可以直接得到抗體基因，便於進一步構建各種基因工程抗體。
[0043]
本發明提供的抗人4-1bb單克隆抗體及其應用中，所用原料及試劑均可由市場購得。
[0044]
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0045]
實施例1：human 4-1bb 24位至186位胺基酸序列與人igg1 fc區的融合蛋白(4-1bb-huigg1 fc)的表達載體構建與真核表達
[0046]
1.human 4-1bb 24位至186位胺基酸區間的基因序列的合成及4-1bb-huigg1 fc融合蛋白的表達載體的構建
[0047]
通過化學合成的方式合成human 4-1bb的第24位至第186位區間的基因序列。通過化學合成的方式合成人igg1重鏈恆定區的第100位脯氨酸至第330位賴氨酸氨酸區間的基因序列。通過分子克隆，將human 4-1bb基因片段與人igg1 fc基因片段進行拼接。拼接產物用takara無縫克隆試劑盒克隆到pcdna3.1(thermo)中。
[0048]
2.重組4-1bb-huigg1 fc融合蛋白的表達與純化
[0049]
以此表達載體轉染293t細胞(atcc)5天後，收集培養上清，用akta explorer 100(ge)純化重組4-1bb-huigg1 fc融合蛋白。由於糖基化修飾等原因，重組4-1bb-huigg1 fc融合蛋白經還原sds-page電泳後通過考馬斯亮藍染色顯示其大小約60k道爾頓。結果如圖1所示。
[0050]
實施例2：elisa檢測重組人4-1bb(4-1bb-huigg1 fc)與biotinylated human 4-1bb ligand的結合
[0051]
利用酶聯免疫吸附測定(elisa)來檢測重組人4-1bb(4-1bb-huigg1 fc)與biotinylated human 4-1bb ligand的結合，elisa實驗具體操作如下：微孔板中加入上文
製備的4-1bb-huigg1 fc蛋白100ng/孔，4℃包被過夜。pbs清洗三遍，加入1％bsa/pbs，200ul/孔，37℃封閉1小時。100ul pbs洗板後加入起始濃度50ng/孔梯度稀釋的biotinylated human 4-1bb ligand，37℃結合1小時。pbst清洗三遍，加入100ul 1:5000稀釋的hrp-streptavidin 37℃結合1小時。pbst清洗三遍，加入100ul/孔tmb顯色液，37℃顯色10分鐘，加入100ul/孔elisa終止液，酶標儀讀取od450數值。od450數值可反映biotinylated human 4-1bb ligand與重組人4-1bb的結合情況從而確定表達的重組人4-1bb可用於小鼠免疫。實驗結果如圖2。
[0052]
實施例3：抗人4-1bb鼠源抗體的製備
[0053]
1.免疫動物
[0054]
將2mg/ml的4-1bb-huigg1 fc融合蛋白作為抗原與等體積的完全弗氏佐劑(sigma-aldrich)混合乳化，取5隻6周大雌性balb/c小鼠(進行皮下免疫，每隻100ug抗原。在初次免疫後，每十天時間進行一次加強免疫，共執行四次皮下免疫，第五次免疫時直接用4-1bb-huigg1 fc融合蛋白進行脾臟衝擊免疫。
[0055]
2.血清效價檢測
[0056]
每次加強免疫前尾靜脈取血50ul，離心去除細胞，保留血清。elisa微孔板中加入4-1bb-his(acro biosystems)50ng/孔，4℃包被過夜。pbs清洗三遍，加入1％bsa/pbs，200ul/孔，37℃封閉1小時。加入梯度稀釋的小鼠血清，37℃結合1小時。pbst清洗三遍，加入100ul 1:5000稀釋的hrp-山羊抗小鼠igg(上海翊勝)37℃結合1小時。pbst清洗三遍，加入100ul/孔tmb顯色液，37℃顯色10分鐘，加入100ul/孔elisa終止液，酶標儀讀取od450數值。圖3所示。
[0057]
3.構建免疫文庫
[0058]
3.1小鼠脾細胞總cdna獲取
[0059]
在用4-1bb-huigg1 fc融合蛋白直接進行腹腔注射方式進行衝擊免疫後四天處死小鼠，取脾臟。用70微米細胞篩網研磨整個脾臟，獲取脾臟細胞。用pbs衝洗兩遍後，500g離心5分鐘，獲取脾臟細胞。使用trizol rna提取試劑盒抽提總rna。以所述rna為模板，使用superscript
tm iv first-strand synthesis system試劑盒合成第一鏈cdna。
[0060]
3.2抗體基因擴增與輕重鏈拼接
[0061]
以所述cdna為模板，參考文獻所述的抗體擴增引物(schaefer j.v.,honegger a.,pl
ü
ckthun a.(2010)construction of scfv fragments from hybridoma or spleen cells by pcr assembly.in:kontermann r.,d
ü
bel s.(eds)antibody engineering.springer protocols handbooks.springer,berlin,heidelberg)，使用重鏈可變域上遊引物和下遊引物pcr擴增重鏈可變域基因，使用輕鏈可變域上遊引物和下遊引物引物pcr擴增卡帕鏈可變域基因。在50ul反應體系中，分別加入25ul phusion master mix(neb)，上遊引物2.5ul(25pmol)，下遊引物2.5ul(25pmol)，1.5ul dmso，0.5ul cdna和18ul ddh2o。按以下程序進行pcr反應：98℃預變性1分鐘後進入溫度循環，98℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，72℃最終延伸10分鐘。圖4所示抗體輕、重鏈可變區基因的擴增。
[0062]
使用dna膠回收試劑盒回收擴增得到的vh基因和vl基因。將等量的vh基因和vl基因混合後為模板，利用上遊引物scfv-f和下遊引物scfv-r通過重疊pcr擴增scfv基因。在
50ul反應體系中，分別加入25ul phusion master mix，上遊引物2.5ul(25pmol)，下遊引物2.5ul(25pmol)，1.5ul dmso，0.5ul cdna和18ul ddh2o。按以下程序進行pcr反應：98℃預變性1分鐘後進入溫度循環，98℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，72℃最終延伸10分鐘。使用dna膠回收試劑盒回收擴增得到的scfv基因片段。圖5抗體scfv基因的擴增所示。
[0063]
3.3構建免疫文庫
[0064]
分別使用sfii dna內切酶消化scfv基因片段和pcomb3xtt載體(美國scripps研究所)。在50ul反應體系中，分別加入sfii 2ul，10x緩衝液5ul，dna 3ug，加ddh2o至50ul。充分混勻後，50℃孵育3小時。
[0065]
使用dna膠回收試劑盒回收酶切後的scfv基因片段和pcomb3xtt載體。使用t4連接酶環化酶切後的scfv基因片段和酶切後的pcomb3xtt載體。在50ul反應體系中，分別加入t4連接酶1ul，10x緩衝液5ul，scfv基因100ng，pcomb3xtt載體500ng，加ddh2o至50ul。充分混勻後，4℃孵育16小時。取少量產物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證連接效率。
[0066]
將10ul上述連接環化產物加入自製的tg1電轉化感受態中，然後通過電轉儀進行電擊轉化。取出10ul電轉化後的細菌通過合理的稀釋並在含有氨苄青黴素的平板上劃線，以此計數並統計噬菌體抗體文庫的大小。剩餘的電轉化後的細菌加入含100ug/ml氨苄青黴素和2％葡萄糖的2xyt培養基，置於加熱培養箱培養。培養結束後在4℃以4000g離心10分鐘，在沉澱菌中補充適量甘油儲存於-80℃作為抗體菌種庫。通過多次電轉化積累獲得超過2e9庫容的scfv免疫文庫。
[0067]
4.鼠源免疫抗體噬菌體文庫的篩選與鑑定
[0068]
4.1生物淘選
[0069]
以biotinylated human 4-1bb protein,his,avitag
tm
(acrobiosystems)融合蛋白為目標蛋白應用生物淘選，對上述鼠源免疫抗體文庫進行生物淘選獲得與4-1bb結合的抗體。從抗體菌種庫中取100od細菌以起始od600＝0.1密度復甦並生長至對數期後應用m13ko7輔助噬菌體挽救抗體文庫，離心後用含有氨苄青黴素和卡那黴素的2xyt培養基重懸並在30℃過夜擴增。peg/nacl沉澱噬菌體，用甘油/pbst溶解噬菌體沉澱獲得免疫庫噬菌體懸液。將收集到的噬菌體懸液投入酪蛋白封閉的biotinylated human 4-1bb protein和酪蛋白封閉的dynabeads m-270鏈黴親合素共孵育體系中，用pbst清洗磁珠去除無法與4-1bb結合的噬菌體。在適當的洗脫條件下洗脫。留取10ul洗脫的噬菌體溶液用於測定輸出噬菌體總量，剩餘噬菌體溶液用於感染對數增長的tg1，過夜擴增後視為下一輪淘選使用的抗體文庫。生物淘選共執行三輪。
[0070]
4.2初篩克隆鑑定
[0071]
將第三輪生物淘選結束後獲得的抗體文庫進行稀釋塗布於含有氨苄青黴素的平板上獲得單克隆，挑選單克隆在深孔板中過夜培養。次日將深孔板進行反覆三次凍融，離心上清用於後續兩類elisa反應。
[0072]
檢測結合活性的elisa反應：利用100ng 4-1bb-his過夜包被，pbs清洗三遍，加入1％bsa/pbs，200ul/孔，37℃封閉1小時。pbs清洗三遍後加入100ul離心上清37℃孵育1小時，pbst清洗三遍後加入100ul 1:5000稀釋的hrp偶聯的山羊抗鼠igg(fab特異性的)(thermo)。pbst清洗三遍，加入100ul/孔tmb顯色液，37℃顯色10分鐘，加入100ul/孔elisa
終止液，酶標儀讀取od450數值。將候選克隆進行測序，獲取抗體輕鏈可變域和重鏈可變域序列命名為gt1c8。結果表1所示。
[0073]
表1
[0074]
od450123456789101112a0.13290.23280.02270.02310.03390.02130.02320.01910.02390.0280.02280.0618b0.03410.32040.02180.01430.02110.01520.02230.06070.22480.01690.01561.4981c0.04850.21990.27260.22161.03480.21360.21291.12480.0160.49810.01620.0874d0.03320.01590.01710.01980.02070.0170.01650.12480.01520.12480.01780.0902e0.20210.02020.01560.01760.02530.03960.03280.0240.01790.90180.01580.08f0.02950.01991.08371.20210.05640.04280.03490.01960.04280.01690.02710.092g0.0280.03270.08370.01870.22210.04460.01680.22510.21870.01720.01950.0348h0.04910.02620.0490.22950.02650.22950.03130.03080.03110.0260.02750.0772
[0075]
4.3表達gt1c8克隆higg1形式抗體
[0076]
分別將gt1c8的重鏈可變區序列克隆至pfusess-chig-hg1中。分別將gt1c8輕鏈可變區序列克隆至pfuse2ss-clig-hk中。分別以此雙質粒1:1比例共轉染293t細胞(atcc)5天後，收集培養上清，用akta explorer 100(ge)純化6h6抗體。gt1c8抗體經非還原sds-page電泳後通過考馬斯亮藍染色顯示其大小約150k道爾頓。
[0077]
實施例4：抗4-1bb鼠抗的初步體外評價
[0078]
1.huigg1型4-1bb抗體體外結合試驗
[0079]
利用elisa進行4-1bb抗體親和力測定，驗證gt1c8的huigg1抗體的親和力：四度過夜包被human 4-1bb/tnfrsf9 protein，his tag(acro biosystems)1ug/ml 100ul每孔，洗板拍幹後利用1％bsa in pbs 200ul/well 37℃孵育1小時進行封閉。0.1％pbst洗板3次拍幹後用加入gt1c8 huigg1型抗體室溫孵育1小時(從10ug/ml起始兩倍梯度稀釋，共15個梯度)。0.1％pbst洗板3次，加入goat anti-mouse igg f(ab')2secondary antibody,hrp(thermo)(1:10000稀釋)室溫孵育1小時。0.1％pbst洗板6次後加入tmb顯色液100ul每孔室溫孵育10分鐘，加入終止液100ul每孔後利用酶標儀進行od450讀數。對數據進行分析處理，計算得gt1c8的huigg1抗體與4-1bb結合的ec50為0.1018ug/ml，如圖6所示。
[0080]
2.體外驗證gt1c8抗體的激動活性
[0081]
將人的全血使用ficoll密度梯度離心法分離pbmc，將分好的pbmc用anti-cd3抗體(1μg/ml)活化培養三天。將4-1bb抗體用pbs稀釋至20ug/ml、10ug/ml、1ug/ml 50ul/well四度過夜包被。對照組加入等量的50ul/well的huigg1同型對照(與4-1bb抗體具有相同種屬來源、相同亞型、相同劑量免疫球蛋白igg，與4-1bb靶點不會有反應)。pbmc活化後與不同濃度的4-1bb抗體，培養過夜經elisa的方法測定ifn-γ分泌量，通過ifn-γ分泌的測定間接反應抗體對pbmc細胞的激活活性。結果如圖7所示，gt1c8對不同的供著的pbmc刺激效果中ifn-γ分泌量較同型對照均有提高，顯示出較強的激動活性。
[0082]
實施例5：4-1bb抗體在til細胞培養中對cd8+t細胞的增殖作用
[0083]
從液氮或乾冰中取出凍存的prerep donor(0614/1003)，於37℃水浴中復甦，化凍後迅速將細胞轉移至預熱的培養基中，離心500g，5min。離心後棄上清，使用1ml培養基吹吸混勻細胞，補充培養基至適當體積以便計數，取樣細胞懸液計數細胞，根據計數結果補充培養基調節細胞密度至1e6個/ml，1ml/24well分別加入cd3抗體30ng/ml溶解，il-2 3000iu/
ml，加入不同濃度4-1bb抗體及同型對照抗體，培養48h後添加pbmc feeder，均按照活化時細胞數添加feeder比例為1:200，調整feeder細胞密度為1e7/ml，培養兩周後細胞計數及流式檢測，實驗結果如圖8所示，加入4-1bb抗體後明顯細胞增值數目高於對照組，並且細胞中cd8+t細胞比例增加，且4-1bb抗體濃度10ug/ml組明顯好於1ug/ml組。
[0084]
以上僅是本發明的優選實施方式，並不用於限制本發明，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護範圍。