長春花脂質轉移蛋白的基因序列的製作方法
2023-05-11 15:56:36
專利名稱：長春花脂質轉移蛋白的基因序列的製作方法
所屬領域本發明屬於分子生物學、基因工程領域，是編碼脂質轉移蛋白的基因在長春花中的首次發現，預知有很強的抗旱功能。
背景技術：
自1970年在檢測花椰菜小花和馬鈴薯塊莖中脂質轉移活性時發現了植物脂質轉運蛋白(LTP)以來，Thoma等(1994)年通過原位雜交等方法發現它主要存在於植物氣生部分的表皮層中，進一步細胞學水平定位研究又發現它存在於植物角質、表皮細胞壁和液泡結構中。三十多年來，人們對來源不同的LTP進行了全面的研究，發現植物LTP一方面有比較專一的底物特異性，如與磷脂酞乙醇胺(PE)的結合；另一方面又與很多親脂性分子結合，對各種脂質體具有廣泛的親合作用。因此常常又被稱作非特異性脂質轉運蛋白(nsLTPs，non-specific lipid transferproteins)。
nsLTPs是一類小分子可溶性蛋白，在高等植物中佔全部可溶性蛋白的4％。其胺基酸殘基和PI在不同的植物中數值是不相同的，其中在植物nsLTPs中分子量在9～10kDa能夠被凝膠層析或SDS-PAGE電泳檢測出。從植物中分離純化到的nsLTPs分子量比較小。根據分子量的大小，植物nsLTPs可分為兩大類，即nsLTPI1和nsLTP2，分子量分別為9kDa和7kDa。通常，nsLTPI主要存在於植物的地上部分器官，而nsLTP2主要存在於根部，但兩者都存在種子裡。在各種不同的物種中nsLTPs的生化性質不盡相同，如從Nicotiana glauca中分離得到的NgLTPI基因能夠編碼一個含有117個胺基酸殘基的疏水蛋白，該蛋白含有21個胺基酸殘基的信號肽系列，成熟的NgLTPI分子量為9.2kDa，pI8.3。它具有較高的熱穩定性，能耐100℃高溫而結構不發生變化。nsLTPs具有良好的穩定性，在4℃可貯存數月之久。它在高溫下也有較好的穩定性，即使在有變性劑存在情況下也十分穩定。
第一個編碼植物LTP的cDNA是從玉米幼苗構建的基因文庫中分離得到的。目前已從好幾種植物中分離鑑定到了nsLTPs基因，這其中有擬南芥、西紅柿、玉米、辣椒、大戟、甘藍、大麥、胡蘿蔔、水稻、草莓、綠豆等。它們通常是以基因家族的形式出現，由幾個關係緊密的組分構成。
目前，在多種植物中都有關於LTP蛋白或基因的研究報導。這些基因的表達或蛋白累積與植物的脅迫抗性正相關。由於植物本身不能移動，對於不良或惡劣的自然條件，只有改變自身的代謝途徑的生長去適應環境的改變。LTP表達的提高有助於增加植物對各種不良環境的抗性。LTP在保衛細胞中的表達量最高，而在葉肉細胞和根中表達量很低甚至無法檢測到，經幹早誘導處理後保衛細胞中LTPRNA含量增加了四倍多。
經檢索未發現任何公開或報導過長春花脂質轉移基因及蛋白序列。
發明內容
本發明的第一目的是提供一種來自於長春花的脂質轉移蛋白的核苷酸序列，其特徵在於，它包括編碼乾旱脅迫條件下長春花葉片中誘導的新的抗逆境蛋白LTP(脂質轉移蛋白)的蛋白功能區序列。所述的胺基酸序列與基因庫中馬鈴薯的序列有45％的同源性，為植物品質改良基因工程提供了更加豐富的優良候選基因。
本發明的第二目的在於提供一種快速獲得脅迫相關基因全長序列的方法。
本發明的cDNA分子是通過如下的方法獲得的首先通過測定植物葉片水勢來尋找植物中度脅迫的處理條件。使植物乾旱脅迫下表達蛋白的豐度富集。
其次，採用最適處理材料進行總RNA的提取及mRNA的純化，用mRNA進行全長cDNA表達文庫的構建。構建後cDNA處於真核表達載體質粒pCMV上，可直接進行克隆cDNA的表達文庫的篩選。
最後，採用3730測序儀，對隨機挑選的克隆進行測序。EST標籤在與NCBI資料庫進行比對後，對相關克隆測通全長，得到完整的LEA基因的完全編碼序列。
本發明的重要應用價值在於該基因在抗旱過程中具有以下優點LTP表達的提高有助於增加植物對各種不良環境的抗性。實驗表明，LTP在保衛細胞中的表達量最高，而在葉肉細胞和根中表達量很低甚至無法檢測到，經幹早誘導處理後保衛細胞中LTP RNA含量增加了四倍多。植物中由於LTP的存在使植物對不良環境具有很強的抗性和適應性，以及對病原微生物有抗性，因此，LTP蛋白在提高植物對乾旱的抗性中起重要作用，具體抗旱機制尚待進一步闡明。
圖1是不同植物來源LTP蛋白的同源性比對2是長春花與馬鈴薯LTP蛋白的同源性比對圖
具體實施例方式實施例1 長春花抗旱基因晚期胚胎豐富蛋白全長基因的克隆步驟1，植物材料處理長春花幼苗播種在珍珠巖中，在光照培養箱中培養，每天澆水，取1個月苗齡的長春花植株在光培箱中自然脫水，沒隔一小時測葉片水勢及滲透勢，以達-1.0MPa為標準取材。取葉片液氮速凍，立即放入-70度的超低溫冰箱中。
步驟2，總RNA的提取及mRNA的純化1.利用Trizol(Gibco)一步法提取總RNA，根據試劑盒說明書步驟進行。對總RNA定量並進行變性電泳質量分析。
2.mRNA的純化利用Oligotex mRNA Purification Kit(Qiagen)從總RNA中純化mRNA並進行定量。
步驟3，λZAPExpresscDNA文庫的構建(Stratagene)1.cDNA第一鏈的合成(1)冰上建立如下體系5.0μL 10×buffer 3.0μLdNTP Mix，2.0μL Link-Primer 12.5μL DEPC-H2O，1.0μLRNAsin，混勻，加入mRNA 5μg，加入1.5μL反轉錄酶。
(2)輕輕混勻，42℃溫育1hr。
2.cDNA第二鏈的合成(1)在第一鏈反應體系中順序加入20μL 10×buffer，6.0μL dNTP Mix，116μLDEPC-H2O，2.0μL RNAseH(1.5U/μL)，11.0μL DNA polymerase I(9.0U/μL)(2)置16℃水浴保溫2.5hr。
3.cDNA末端補平(1)冰上加如下試劑23μL dNTP Mix，2.0μL pfu DNA pol(2.5U/μL)。
(2)72℃溫育30min。
(3)用200μL酚/氯仿抽提一次，室溫高速離心2min，轉上清於另一新管中。
(4)用等體積氯仿抽提一次，轉上清於另一新管中。
(5)加20μL 3mol/L NaAc，400μL 100％乙醇，混勻，-20℃過夜。
(6)4℃ 16000g離心60min，收集cDNA沉澱。
(7)加500μL 70％乙醇輕輕洗。
(8)全速離心2min，室溫下抽真空使沉澱乾燥。
(9)沉澱重懸於9.0μL EcoR I adapters中。4℃保溫至完全溶解。
4.EcoR I銜接子的連接(1)順序加入1.0μL 10×buffer(Ligase Buffer)。
1.0μL 10mmol/L rATP1.0μL T4DNA ligase(4U/μL)4℃連接2天。
(2)70℃水浴30min，以滅活Ligase。
5.EcoR I連接子末端的磷酸化。
(1)室溫離心2s並放置5min，加入1.0μL 10×Ligase Buffer2.0μL 10mmol/L rATP5.0μL sterile H2O2.0μL T4 Kinase(5U/μL)37℃保溫30min。
(2)70℃加熱30min滅活Kinase6.Xho I消化加入下列成分28.0μL Xho I buffer3.0μL Xho I(40U/μL)37℃保溫1.5hr。
7.載體連接7.1使用Wizard SV Gel and PCR CLEAN System kit(Promega)回收cDNA片段，對回收的cDNA進行EB定量。
7.2 cDNA與ZAP Express Vector連接在1.5ml離心管中加入2.0μL重懸cDNA0.5μL 10×ligase buffer0.5μL 10mM rATP1.0μL ZAP Express Vector0.5μL ddH2OT4 DNA ligase(4U/uL)0.5μL，4℃連接2天。
8.λ重組DNA的體外包裝(1)加入目的DNA 100ng至包裝蛋白中，混勻，離心匯於管底。
(2)22℃溫育2hr後，加入500μL SM Buffer，在加20μL氯仿，輕輕混勻。
9.λ噬菌體的轉染9.1噬菌體文庫滴度的測定(1)劃線培養XL1-blue MRF』，37℃過夜，培養基為LB(含12.5μg/ml Tet)。
(2)接種至LB broth，30℃，200rpm過夜搖(OD＜1)，1000×g離心收集菌體，加10mmol/L MgSO4重懸菌體至OD600＝0.5。
(3)在上述包裝體系中各取1.0μL做一系列稀釋，即1→10-2→10-4，各取1.0μL稀釋液於宿主菌中，吸附15min後，加3mL頂層瓊脂，迅速鋪在提前育溫至37℃的底層瓊脂，待凝固後37℃過夜倒置培養。
(3)待噬菌斑長出後，計算滴度。經檢測，初級文庫的庫容達到1×106pfu/ml。
9.3噬菌體文庫的擴增(1)宿主菌製備同前。
(2)鋪好板後37℃過夜倒置培養。噬菌斑不超過1～2mm。
(3)用4mL SM Buffer塗蓋菌板，4℃貯存過夜。
(4)吸出SM Buffer於無菌管中，在加1mL SM Buffer洗菌板一次，吸到管中加氯仿至終濃度5％，混勻置室溫培養15min，500g離心10min，移走細胞碎片。
(5)轉上清於另一管中，加氯仿至終濃度0.3％，4℃存放。
(6)測滴度。經擴增，文庫的滴度達1×108pfu/ml10噬菌體文庫的體內剪切(1)劃線培養XL1-blue MRF』和XLOLR菌於LB培養基(含12.5μg/ml Tet).挑單菌落接種至50mL LB broth，30℃，200rpm過夜培養。
(2)1000×g離心收集XL1-blue MRF』和XLOLR cells，用10mM MgSO4重懸至OD600＝1。
(3)在離心管中加入100倍於初級庫的噬菌體量。按10∶1(cells-to-lambdaphage)加入宿主菌XL1-blue在按(10∶1 helper phage-to-cells ratio)加入輔助噬菌體。
(4)37℃吸附15min，加20ml NZY broth with supplements，37℃搖培3hr，65℃熱激20min，1000×g離心10min，轉上清於另一管中。
(5)測滴度取上清1.0μL分別加到200μL XLOLR菌中，37℃吸附15min，再加200μL NZY broth 37℃搖培45min。
(6)從中取出100μL鋪LB(50μg/ml，kana)37℃過夜培養，得到菌落。
11應用PCR反應體系檢測平均插入片段的長度取載體引物，挑單克隆進行PCR驗證插入片斷，PCR反應條件為95.0℃預變性5min，然後94.0℃變性30s，50.0℃模板退火30s，72.0℃延伸2min，共30個循環，最後，72.0℃最終延伸7min，反應結束後，取PCR產物在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。經檢驗，平均插入片斷長為1.2kb。
步驟4，採用3730測序儀進行測序(ABI)
採用T7引物進行單向測序，每個反應可達800-1200bp。得到的EST序列進入NCBI進行比對後，對乾旱脅迫相關基因質粒測通，得到全長基因序列。
實施例2 長春花LTP的序列信息與同源性分析以下部分為克隆的長春花LTP蛋白的核苷酸序列ggcacgagga tttgtgagca tacaatcaaa taatggcaag atcaaagttg tttatgcaga 60agcagctact aggactagta attttgatat ggatgttggc atataatcct cggccaagtg120aagccttaac gtgtgacgat gtgaacaaca acctcatctc atgtctgagt tacgtcgcag180gcggtggaaa ggtgccgaca agctgttgca gtggggtgaa aaatctgctt agtttagcca240agactagaaa cgaccggcaa acagcatgct catgcttgaa atctcttgct gttgaagcca300ataatgatca acttaagagg gctcaaactg ttccaaagtc ttgttctttg accattcctt360ttcctatttc cagagatgtt gattgctcca aggtgaaata ataccttgac gaactctgat420gactgcatat atatatatat aaatagtgtc tcattggtaa tatatatgca gtaattttga480ttattattat atagagaaag aataaagaat aattatgtgg tcttcctcta agcaagagat540ttcaacacaa ttacaagtga aattaaatta tgttgtataa ttaacattac ttaaacttga600tgatcatata taatgttatt tcgcattgat gctttattca atggggaaaa taattaattt660cgaaataaaa atttaagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa698全編碼序列為從33位的atg到401位的taa。第680位具有polyA附加信號。其編碼的122個胺基酸序列為MARSKLFMQKQLLGLVILIWMLAYNPRPSEALTCDDVNNNLISCLSYVAGGGKVPTSCCSGVKNLLSLAKTRNDRQTACSCLKSLAVEANNDQLKRAQTVPKSCSLTIPFPISRDVDCSKVK本發明從長春花中分離該基因，即從新的物種中分離該基因，因而具有創新性；長春花屬耐乾旱、耐鹽鹼植物，因而預知該基因有更強的抗旱、耐鹽鹼功能，有更新的實用價值。
權利要求
1.一種編碼長春花脂質轉移蛋白的核苷酸序列，其特徵在於其具有如下的DNA核苷酸及相應的胺基酸序列ggcacgagga tttgtgagca tacaatcaaa taatggcaag atcaaagttg tttatgcaga 60agcagctact aggactagta attttgatat ggatgttggc atataatcct cggccaagtg120aagccttaac gtgtgacgat gtgaacaaca acctcatctc atgtctgagt tacgtcgcag180gcggtggaaa ggtgccgaca agctgttgca gtggggtgaa aaatctgctt agtttagcca240agactagaaa cgaccggcaa acagcatgct catgcttgaa atctcttgct gttgaagcca300ataatgatca acttaagagg gctcaaactg ttccaaagtc ttgttctttg accattcctt360ttcctatttc cagagatgtt gattgctcca aggtgaaata ataccttgac gaactctgat420gactgcatat atatatatat aaatagtgtc tcattggtaa tatatatgca gtaattttga480ttattattat atagagaaag aataaagaat aattatgtgg tcttcctcta agcaagagat540ttcaacacaa ttacaagtga aattaaatta tgttgtataa ttaacattac ttaaacttga600tgatcatata taatgttatt tcgcattgat gctttattca atggggaaaa taattaattt660cgaaataaaa atttaagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa698MARSKLFMQKQLLGLVILIWMLAYNPRPSEALTCDDVNNNLISCLSYVAGGGKVPTSCCSGVKNLLSLAKTRNDRQTACSCLKSLAVEANNDQLKRAQTVPKSCSLTIPFPISRDVDCSKVK
2.一種如權利要求1所述的核苷酸序列，其特徵在於33bp處具有起始密碼子ATG，401bp處具有終止密碼子TAA，在680bp處具有polyA附加信號。該序列無內含子，具有369bp完整的開放讀碼框，編碼122個胺基酸。
3.一種如權利要求1所述的長春花脂質轉移蛋白的核苷酸序列的克隆方法，其特徵在於首先使用適度的乾旱處理條件，使植物抗旱基因表達富集；然後通過構建全長的cDNA文庫，及測序，在最短的時間內得到抗旱相關的全長脅迫基因。獲得的抗旱基因直接構建在真核表達載體pCMV質粒上，可通過真核生物表達來直接進行篩選。基因可以使用t3、t7通用引物進行測序。
全文摘要
一種長春花乾旱脅迫條件下長春花葉片中誘導的新的抗旱基因及其編碼產物的胺基酸序列。它涉及一種新的基因序列。其特徵在於該基因全長698bp，在33bp處具有起始密碼子ATG，401bp處具有終止密碼子TAA，在680bp處具有polyA附加信號。該序列無內含子，具有369bp完整的開放讀碼框，編碼122個胺基酸。所述的胺基酸序列與馬鈴薯LTP序列的同源性達45％。本發明還提供了一種快速得到全長脅迫基因的方法。首先使用適度的乾旱處理條件，使植物抗旱基因表達富集；然後通過構建全長的cDNA文庫及測序，在最短的時間內得到抗乾旱脅迫相關的全長基因。獲得的抗旱基因直接構建在真核表達載體pCMV質粒上，可使用t3、t7通用引物進行測序。同時，可通過真核生物表達來直接進行篩選。本發明從植物cDNA中分離出了脂質轉移蛋白的全長基因，該基因具有較強的抗旱功能，同時，對增強植物其它逆境抗性也起到重要的作用。該基因的克隆擴大了植物抗旱研究的基因資源，為運用基因工程技術提高植物抗乾旱脅迫及品質改良提供了更加豐富的優良候選基因。
文檔編號C12N15/29GK1687416SQ20051000993
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月27日 優先權日2005年4月27日
發明者祖元剛, 聶明珠, 於景華, 唐中華, 王慧梅, 郭曉瑞, 房思梁, 王延兵 申請人:東北林業大學, 祖元剛