一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法

2023-05-12 08:26:53

一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法
【專利摘要】本發明公開一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於：所述的方法按照以下步驟進行：基礎電極的清潔處理：對電極進行拋光、浸泡和清洗處理，去除其表面雜質後，獲得表面新鮮潔淨的電極；在基礎電極上形成帶有氨基的有機膜；將帶有氨基有機膜的基礎電極與參比電極、輔助電極構成三電極系統，將基礎電極放置在pH2.0至10.0、濃度為0.1至10mg/mL的緩衝溶液中，在-800至+400mV的電位條件下處理1至60min，最終實現抗體膜在有機膜上的固定。這是一種在抗體固化的過程中無需使用交聯劑或偶聯劑，無需酶標記或螢光標記，成本低廉，簡單易行的免疫傳感器製備方法。
【專利說明】一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種免疫分析領域中傳感器的製備方法，特別是一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法。
【背景技術】
[0002]免疫分析的提出及發展是生物分析化學最偉大的成就之一。免疫分析技術結合了抗原、抗體分子間的特異性識別和電化學、光譜學、聲學等技術的靈敏、方便等特點，已廣泛應用於臨床診斷、生物化學、環境分析、食品安全及軍事醫學等領域。免疫傳感器作為一種新興免疫分析手段，具有檢測速度快，操作簡便，成本較低等特點，受到人們愈來愈廣泛的關注。
[0003]抗體的固定化是免疫傳感器製備的關鍵技術之一。常用的有包埋法、交聯法、共價鍵法及靜電吸附法等，這些固定方法通常具有以下缺點:1.固定抗體時需佔用一個免疫活性位點，造成抗體的活性損失或抗體膜不穩定，致使免疫傳感器性能減弱，如檢測靈敏度低、檢測範圍窄。2.使用的交聯或偶聯試劑昂貴，部分固定方法步驟繁瑣，不易大規模操作、實施。因此現在需要一種能夠解決上述問題的新的抗體固定方法。

【發明內容】

[0004]本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種在抗體固化的過程中無需使用交聯劑或偶聯劑，無需酶標記或螢光標記，成本低廉，簡單易行的免疫傳感器製備方法。
[0005]本發明的技術解決方案是:一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的方法按照以下步驟進行:
基礎電極的清潔處理:對電極進行拋光、浸泡和清洗處理，去除其表面雜質後，獲得表面新鮮潔淨的電極，
在基礎電極上形成帶有氨基的有機膜，
將帶有氨基有機膜的基礎電極與參比電極、輔助電極構成三電極系統，將基礎電極放置在pH2.0至10.0、濃度為0.1至10mg/mL的IgG型抗體溶液中，在-800至+400mV的電位條件下處理I至60min,最終實現抗體膜在有機膜上的固定。
[0006]所述的基礎電極選用鉬、金、銀、銅、石墨、炭糊或玻炭中的一種。
[0007]所述的帶有氨基的有機膜通過自組裝法或電聚合方法附著在以鉬、金、銀或銅為材質的基礎電極上，通過電聚合方法附著在以石墨、炭糊或玻炭為材質的基礎電極上。
[0008]所述的帶有氨基的有機膜為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物、硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
[0009]所述的抗體膜為IgG型單克隆抗體或IgG型多克隆抗體。
[0010]所述的拋光步驟為:首先將基礎電極的表面用金相砂紙打磨，然後依次用
1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的Y至氧化招眾在麂皮上拋光,之後依次用丙酮、純水淋洗乾淨； 所述的浸泡步驟為:將經拋光處理後的基礎電極浸入piranha溶液中在50°C的條件下浸泡20min，然後用蒸餾水衝洗基礎電極5次，上述的浸泡和衝洗步驟需進行2次操作。
[0011]所述的清洗步驟為:將基礎電極取出後用純水淋洗5次，並將其浸入純水中進行超聲清洗3次，每次清洗時間為5min，最後取出基礎電極並用N2吹乾。
[0012]所述的自組裝方法為:將經過清潔處理後的基礎電極浸入0.1?25mmol/L氨基有機物的溶液中浸泡24h，以在基礎電極上形成末端為氨基的單層分子膜或多層分子膜，其中氨基有機物為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物中的一種或多種。
[0013]所述的電聚合方法為:在0.01?0.05mol/L氨基有機物溶液中，將經過清潔處理後的基礎電極作為三電極系統的工作電極，以50mV/s的掃速在至500至+500mV的電位範圍內循環掃描10至50圈後，用純水淋洗基礎電極5次，以在基礎電極表面上形成帶有自由氨基或亞氨基的聚合物薄膜，其中氨基有機物為硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
[0014]本發明同現有技術相比，具有如下優點:
利用本發明所公開的方法製備的免疫傳感器，與現有的免疫傳感器相比，具有以下優點:這種免疫傳感器的構造簡單，在抗體固化的過程中無需使用交聯劑或偶聯劑，無需酶標記或螢光標記，成本低廉，簡單易行；並且該傳感器的檢測下限低、檢測範圍寬，操作簡單，能夠廣泛應用於臨床檢驗、生物醫學、環境監測、食品安全、醫藥工業及軍事、醫學等領域。因此可以說這種製備方法具備了多種優點，具備廣泛的市場前景和科研前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是利用本發明所述方法製備出的免疫傳感器的製備過程示意圖。
[0016]圖2是免疫傳感器製備過程及對抗原檢測後的循環伏安圖。
[0017]圖3是免疫傳感器製備過程及對抗原檢測後的交流阻抗譜。
[0018]圖4是免疫傳感器對抗原檢測的工作曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面將結合【專利附圖】

【附圖說明】本發明的【具體實施方式】。
[0020]圖2中的a為基礎電極，b為氨基有機膜修飾電極，c為免疫傳感器，d為傳感器對抗原檢測後的傳感器。
[0021]圖3中的a為基礎電極，b為氨基有機膜修飾電極，c為免疫傳感器，d為傳感器對抗原檢測後的傳感器，內嵌圖為曲線a和b的放大圖。
[0022]實施例一
選擇金電極作為基礎電極，硫脲為氨基化合物，以羊抗至小鼠IgG抗體製備免疫傳感器。
[0023]首先將金電極用金相砂紙打磨，依次用1.0、0.3、0.05μπι的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著依次用丙酮、純水淋洗乾淨。將拋光後的電極浸入新配製的Piranha溶液中(3 O % H202:濃H2S04=1:3，體積比)，50°C下浸泡20min，2次。取出電極用純水淋洗5次,純水中反覆超聲清洗3次，每次5min，用N2吹乾。最後，將電極浸入25mmol/L硫脲溶液中，浸泡24h，電極表面上形成硫脲自組裝單分子膜。取出電極(硫脲修飾電極)，作為工作電極浸入pH 3.0Umg/mL的抗體溶液中，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬電極為對電極，在至400mV電位下，組裝抗體lOmin，製得免疫傳感器。利用製得的免疫傳感器對抗原(小鼠IgG)進行檢測，檢測下限可達l(T2ng/mL,檢測範圍為l(T2-103ng/mL。
實施例二
選擇鉬電極作為基礎電極，對氨基苯硫酹與半胱氨酸混合物為氨基化合物，以山羊抗至兔IgG抗體製備免疫傳感器。
[0024]首先將鉬電極用金相砂紙打磨，依次用1.0,0.3,0.05 μ m的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著依次用丙酮、純水淋洗乾淨。將拋光後的電極浸入新配製的Piranha溶液中(3 O % H202:濃H2S04=1:3，體積比)，50°C下浸泡20min，2次。取出電極用純水淋洗5次，純水中反覆超聲清洗3次,每次5min,用N2吹乾。最後，將電極浸入0.lmmol/L對氨基苯硫酚與半胱氨酸混合溶液中，浸泡24h，電極表面上形成氨基有機膜。取出氨基有機膜修飾電極，作為工作電極浸入pH 2.0、10mg/mL抗體溶液中，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬電極為對電極，在+400mV電位下，組裝抗體60min，製得免疫傳感器。利用製得的免疫傳感器對抗原(兔IgG)進行檢測，檢測下限可達10_2ng/mL，檢測範圍為10_2_103ng/mL。
[0025]實施例三
選擇玻碳電極作為基礎電極，鄰苯二胺為氨基化合物，以兔抗至人IgG抗體製備免疫傳感器。
[0026]首先將玻碳電極用金相砂紙打磨，依次用1.0,0.3,0.05μπι的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著依次用丙酮、純水淋洗乾淨。接著將電極浸入新配製的Piranha溶液中(3 O %H202:濃H2S04=1:3，體積比)，50°C下浸泡20min，2次。取出電極用純水淋洗5次，純水中反覆超聲清洗3次，每次5min，用N2吹乾後，在0.05mol/L鄰苯二胺溶液中，以清潔處理好的電極為工作電極。以50mV/s的掃速在至500?500mV的電位範圍內循環掃描50圈後，用純水淋洗5次，得到修飾了氨基的電極表面。將該電極作為工作電極浸入pH 10.0、
0.lmg/mL抗體溶液中，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬電極為對電極，在_800mV電位下，組裝抗體lmin，製得免疫傳感器。利用製得的免疫傳感器對抗原(人IgG)進行檢測，檢測下限可達 l(T2ng/mL,檢測範圍為 l(T2_103ng/mL。
【權利要求】
1.一種基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的方法按照以下步驟進行: 基礎電極的清潔處理:對電極進行拋光、浸泡和清洗處理，去除其表面雜質後，獲得表面新鮮潔淨的電極， 在基礎電極上形成帶有氨基的有機膜， 將帶有氨基有機膜的基礎電極與參比電極、輔助電極構成三電極系統，將基礎電極放置在pH2.0至10.0、濃度為0.1至10mg/mL的IgG型抗體溶液中，在-800至+400mV的電位條件下處理I至60min,最終實現抗體膜在有機膜上的固定。
2.根據權利要求1所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的基礎電極選用鉬、金、銀、銅、石墨、炭糊或玻炭中的一種。
3.根據權利要求2所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的帶有氨基的有機膜通過自組裝法或電聚合方法附著在以鉬、金、銀或銅為材質的基礎電極上，通過電聚合方法附著在以石墨、炭糊或玻炭為材質的基礎電極上。
4.根據權利要求1所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的帶有氨基的有機膜為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物、硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的抗體膜為IgG型單克隆抗體或IgG型多克隆抗體。
6.根據權利要求1所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的拋光步驟為:首先將基礎電極的表面用金相砂紙打磨，然後依次用Ι.Ομπκ0.3 μ m、0.05 μ m的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，之後依次用丙酮、純水淋洗乾淨； 所述的浸泡步驟為:將經拋光處理後的基礎電極浸入piranha溶液中在50°C的條件下浸泡20min，然後用蒸餾水衝洗基礎電極5次，上述的浸泡和衝洗步驟需進行2次操作； 所述的清洗步驟為:將基礎電極取出後用純水淋洗5次，並將其浸入純水中進行超聲清洗3次，每次清洗時間為5min，最後取出基礎電極並用N2吹乾。
7.根據權利要求3所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的自組裝方法為:將經過清潔處理後的基礎電極浸入0.1?25mmol/L氨基有機物的溶液中浸泡24h，以在基礎電極上形成末端為氨基的單層分子膜或多層分子膜，其中氨基有機物為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物中的一種或多種。
8.根據權利要求3所述的基於電位控制固定抗體的免疫傳感器製備方法，其特徵在於:所述的電聚合方法為:在0.01?0.05mol/L氨基有機物溶液中，將經過清潔處理後的基礎電極作為三電極系統的工作電極，以50mV/s的掃速在至500至+500mV的電位範圍內循環掃描10至50圈後，用純水淋洗基礎電極5次，以在基礎電極表面上形成帶有自由氨基或亞氨基的聚合物薄膜，其中氨基有機物為硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
【文檔編號】G01N33/553GK103513028SQ201310411853
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】馮春梁, 孫越, 李楊 申請人:遼寧師範大學