測定菸草中p-香豆酸含量的方法
2023-05-11 20:34:11 5
專利名稱：測定菸草中p-香豆酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及菸草的種植與栽培，具體來說，涉及測定菸草中P-香豆酸含量的方法。
背景技術：
p_香豆酸,又稱對輕基肉桂酸，即3-(4-輕基苯基)-2丙烯酸(口-辦￡//'<0^<^/7/7<3 /<^acid-,p-Coumaric acid),是植物次生代謝物質，多以束縛形式存在，一般以酯鍵、醚鍵和其他化合物連接在一起，它與對逆境的抗性以及作物的特色形成等生理活動有著密切的關係。菸草中P-香豆酸是苯丙烷代謝途徑的中間產物，也是木質素合成途徑代謝產物。因此，測定菸草中的P-香豆酸含量對於判斷菸草的質量和風格特徵有著重要的意義。經過檢索，中國專利資料庫中未發現關於菸草中P-香豆酸測定方法的專利，而現有的技術文獻也沒有相關的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供測定菸草中P-香豆酸含量的方法，以為探明菸葉特色形成提供一些理論支持。本發明提供的測定菸草中P-香豆酸含量的方法包括以下步驟:
第一步製備P-香豆酸標準品
準確稱取P-香豆酸標準品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然後吸I mL用乙腈定容至IOmL製成標準品溶液，備用；
第二步製備供試樣品溶液
(O鮮菸葉樣品製備:液氮取樣，然後將鮮煙樣放入冷凍乾燥儀中冷凍乾燥直至恆重(無水分)，再將其研磨成粉，備用；
(2)烤後菸葉樣品製備:烤後菸葉粉碎過40目篩備用。(3)提取P-香豆酸:取菸葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾後加入3mol/L的HCl調節pH至2，然後分別用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(體積比)萃取5次，合併有機相併用旋轉蒸發儀蒸乾，然後用流動相定容後過0.22 μ m的濾膜後進樣；
第三步測定P-香豆酸含量
分別取不同濃度的標準品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測菸葉色譜，根據色譜圖中峰面積計算出標準曲線，然後計算出P-香豆酸含量。上述P-香豆酸標準品購自Sigma公司，純度彡98% ;上述乙腈為天地公司生產的色譜純試劑，乙酸為Fisher公司生產的色譜純試劑，氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸鈉、乙醚、乙酸乙酯為國產分析純。上述檢測菸葉色譜的色譜條件是:色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱(4.6mmX250mm，5μπι);流動相為A (含2.5%乙酸的水)-B (乙腈)，梯度洗脫，柱溫35°C，流速1.0mL.mirT1，檢測波長310nm,進樣量2 μ L。上述各步驟所用的儀器設備是:Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，Waters2996 二極陣列管檢測器(DAD)檢測，Empower色譜工作站,萬分之一電子天平,旋轉蒸發儀，真空泵、磁力攪拌器等。本發明的測定菸草中P-香豆酸含量的方法具有靈敏度高、準確性強、重複性好、使用有機試劑少等諸多優點，可用於菸草鮮菸葉和烤後菸葉中P-香豆酸含量的測定。
圖1為標準品與菸葉樣品HPLC 圖2為標準品標準曲線 圖3為標準品色譜圖。
具體實施例方式通過以下具體實施例對本發明進一步說明，但不作為對本發明的限制。實施例1測定方法實施例
首先進行標準品溶液的製備:準確稱取P-香豆酸標準品10mg，用乙腈定容至10mL，然後吸I mL用乙臆定各至IOmL製成標準品溶液,備用；
接著製備供試樣品溶液:
(1)製備鮮菸葉樣品:液氮取樣，然後將鮮煙樣放入冷凍乾燥儀中冷凍乾燥直至恆重(無水分)，再將其研磨成粉，備用；
(2)烤後菸葉樣品製備:烤後菸葉粉碎過40目篩，備用；
(3)提取P-香豆酸:取菸葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾後加入3mol/L的HCl調節pH至2，然後分別用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(V: V)萃取5次，合併有機相併用旋轉蒸發儀蒸乾，然後用流動相定容後過0.22μ m的濾膜後進樣；
最後進行P-香豆酸含量的測定:分別取標準品溶液配成濃度分別為0.5、1、2、3、5、10、20,30,50 μ m/mL的溶液取2 μ L注入超高效液相色譜儀，根據色譜圖中峰面積計算出標準曲線，然後計算出P-香豆酸含量；
其中，所述色譜條件為:色譜柱Waters C18色譜柱(4.6_X 250mm, 5 μ m);流動相A(含
2.5%乙酸的水)-B (乙腈)，柱溫350C，流速1.0mL.min—1，檢測波長310nm,進樣量2 μ L。梯度條件:0-40min5%B — 30%B ;40_50min 30%B — 5%B。實施例2線性關係考察
分別取上述標準品溶液0.5、1、2、3、5、10、20、30、50 μ L，按實施例1中色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積。以各標準品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標計算，得出P-香豆酸的回歸方程為 y=l.48 X IO4X-L 45X 103，R2=0.9993，線性範圍為 0.647 52.230μ g/mL。精密度試驗:精密吸取供試樣品溶液按上述色譜條件連續進樣10次，進樣量2 μ L，記錄色譜圖，測得P-香豆酸峰面積的RSD為0.16%，結果表明儀器精密度良好。重複性試驗:取同一批樣品，按供試品製備方法平行6次樣品，連續進樣，進樣量2 μ L，記錄色譜圖，計算P-香豆酸含量的的RSD為4.76%，結果表明該實驗重複性良好。穩定性試驗:取同一份供試樣品溶液，在0，4，12，24h進樣，在上述色譜條件下測定，P-香豆酸峰面積的RSD為0.31%,結果表明樣品在24h內穩定性良好。加標回收試驗:稱取已知量的菸草樣品0.3g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾後加入3moI/L的HCl調節pH至2，分別加入對照品，加入的對照品分另Ij為樣品中P-香豆酸含量的0.8、1.0和1.2倍)，然後分別用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(體積比)萃取5次，合併有機相併用旋轉蒸發儀蒸乾，然後用流動相定容後過0.22 μ m的濾膜後，在上述色譜條件下測定，計算回收率，結果P-香豆酸平均回收率為99.2%。實施例3 檢測波長的選擇
在對供試樣品溶液進行色譜條件摸索時，在19(T400nm進行全波長掃描，其中在233和324nm處有最大吸收,但是在320nm處基線噪音影響較大,其中在310nm處分離度可以到達到指紋圖譜要求的標準，因此選310nm為最大檢測波長。實施例4流動相選擇
本試驗比較了乙腈-水、乙腈-0.05%乙酸水溶液和乙腈-2.5%乙酸水溶液3中不同的梯度洗脫溶劑系統，以乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脫溶劑系統所得圖譜的峰形較好、分離度大，所以選用乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脫溶劑系統為本試驗的流動相系統。
權利要求
1.測定菸草中P-香豆酸含量的方法，其特徵包括: 第一步製備P-香豆酸標準品 準確稱取P-香豆酸標準品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然後吸I mL用乙腈定容至IOmL製成標準品溶液，備用； 第二步製備供試樣品溶液 (1)製備鮮菸葉樣品:液氮取樣，然後將鮮煙樣放入冷凍乾燥儀中冷凍乾燥直至恆重即無水分時，再將其研磨成粉，備用； (2)製備烤後菸葉樣品:烤後菸葉粉碎過40目篩備用； (3)提取P-香豆酸:取菸葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾後加入3mol/L的HCl調節pH至2，然後分別用20mL體積比為1:1的乙醚/乙酸乙酯萃取5次，合併有機相併用旋轉蒸發儀蒸乾，然後用流動相定容後過0.22 μ m的濾膜後進樣； 第三步測定P-香豆酸含量 分別取不同濃度的標準品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測菸葉色譜，根據色譜圖中峰面積計算出標準曲線，然後計算出P-香豆酸含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述P-香豆酸標準品的純度>99%。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述檢測菸葉色譜的色譜條件是:色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱，規格為4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流動相A為含2.5%乙酸的水-B為乙腈，梯度洗脫，柱溫35°C，流速1.0mL.min—1，檢測波長310nm，進樣量2 μ L。
全文摘要
本發明公開了測定菸葉中p-香豆酸含量的方法，該方法包括第一步，製備p-香豆酸標準品準確稱取p-香豆酸標準品10mg，用乙腈定容至10mL，然後吸1mL用乙腈定容至10mL製成標準品溶液，備用；第二步，製備供試樣品溶液，包括製備鮮菸葉樣品、製備烤後菸葉樣品和提取p-香豆酸；第三步，測定p-香豆酸含量分別取不同濃度的標準品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測菸葉色譜，根據色譜圖中峰面積計算出標準曲線，然後計算出p-香豆酸含量。本發明的方法具有操作簡便、靈敏度高、準確性強、重複性好、測定快速等諸多優點，適用於菸草鮮菸葉和烤後菸葉中p-香豆酸含量的測定。
文檔編號G01N30/02GK103149281SQ20121025638
公開日2013年6月12日 申請日期2012年7月24日 優先權日2012年7月24日
發明者趙會納, 雷波, 張捷, 任竹, 丁福章, 羅寶昌 申請人:貴州省菸草科學研究所