編碼雞α幹擾素的優化基因及其在製備雞α幹擾素中的應用的製作方法
2023-05-11 22:09:46 1
專利名稱：編碼雞α幹擾素的優化基因及其在製備雞α幹擾素中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種編碼雞α幹擾素的優化基因及其在製備雞α幹擾素中的應用。
背景技術：
幹擾素(Interferon，IFN)最初於1957年由英國科學家Isaacs研究禽流感病毒 的幹擾現象時被發現，是一種具有廣譜抗病毒活性的糖蛋白，由病毒及其它種類的幹擾素 誘導劑刺激內皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及體細胞所產生，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節 及誘導分化等活性。幹擾素作用的發揮並不是直接作用於病毒，而是刺激細胞產生多種廣 譜抗病毒蛋白，可通過直接或間接途徑發揮抗病毒作用。根據結構及受體的不同，可將IFN分為兩類1型IFN和II型IFN。哺乳動物I型 IFN主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN- τ，對酸和熱穩定，具有高效抗病毒活性，其中 IFN-α主要由白細胞產生，IFN-β主要由成纖維細胞產生；II型IFN包括IFN-γ，由T細 胞和NK細胞產生，對酸和熱不穩定，主要是免疫調節作用，是哺乳動物主要的巨噬細胞活 化因子。雞及其它禽類IFN與哺乳動物IFN類似，也分為I型IFN和II型IFN，現已發現雞 I型IFN包括IFN- α、IFN- β ,11型包括IFN- γ，目前在禽類中尚未發現IFN- ω和IFN- τ。雞IFN基因最初於1994年由Sekellick從老化的雞胚細胞cDNA文庫中成功克 隆，其與哺乳動物IFN的序列相似性較低(與哺乳動物I型IFN的胺基酸同源性約為20%， 與II型IFN僅為3%左右)，但其半胱氨酸的位置及可由病毒誘導產生的特性相對保守，與 哺乳動物I型IFN類似，因此推測其為雞I型IFN。隨後1995年，Schultz等人發現此種 雞IFN具有抗濾泡性口炎病毒的活性，且缺少哺乳動物IFN-Y相關的生物活性，從而證實 了這一觀點。1996年，Christine Sick等人對上文的cDNA文庫進行Southern雜交分析 和λ-噬菌體篩選，發現雞的基因組至少含有10種IFN基因。其中一個基因家族的3個基 因編碼雞IFN- α (ChIFN- α，又稱ChIFN α )，另一單獨基因的產物為雞IFN- β (ChIFN- β )。 ChIFN-α由193個胺基酸殘基組成，其成熟肽大小為162aa，N_端31個胺基酸為信號肽。盡 管ChIFN-α與哺乳動物IFN-α的胺基酸同源性僅為24%，但高度保守區的胺基酸同源性 高達80%，兩者二級結構中α -螺旋的位置也類似，且兩者均可由咪喹莫特衍生物S-28463 誘導產生，因此將其命名為ChIFN-α。ChIFN-β由203個胺基酸殘基組成，其成熟肽大小 為176aa。1999年，Plachy等人用重組ChIFN-α處理雞胚成纖維細胞(CEF)後再用勞斯 肉瘤病毒(RSV)攻毒，發現高劑量的幹擾素有抗腫瘤的作用。同時，Marcus等人發現給1 日齡雛雞投餵高劑量ChIFN-α，可以顯著降低新城疫病毒的發病率。2001年，Mo C W等人 發現ChIFN-α可抑制傳染性法氏囊病病毒(IBDV)形成空斑，並可提高感染IBDV雞的成活 率。Ellen等人發現ChIFN-α可抑制傳染性支氣管炎病毒(IBV)的複製，從而延遲疾病的 發作，減弱臨床病症，表明ChIFN-α可能是潛在的免疫增強劑。2001年，Jarosinski等人 發現用ChIFN- α處理雞後可顯著降低NK細胞的細胞毒作用，用ChIFN- α處理CKC後可抑 制馬立克病毒(MDV)的複製，使MDV噬斑形成減少50%。
2003年，夏春等人克隆鑑定了我國三種品系雞的IFN-α基因SH_雞、WJ-雞和 AA-雞。對三種雞的IFN-α進行同源性分析，進而將ChIFN-α分為兩個亞類SH_ChIFN-a 和WJ-ChIFN- a。並發現兩者均具有抗VSV活性，高劑量的SH-ChIFN- α能夠抑制40 %的 雞胚感染H9N2，100%抑制1日齡到5日齡雛雞感染。2009年，陶勝利等人發現混飲低劑量 ChIFN-α可提高肉雞外周血白細胞總數，可提高肉雞的免疫功能，對健康肉雞的生長無顯 著影響。
發明內容
本發明的目的是提供一種編碼雞α幹擾素的優化基因及其在製備雞α幹擾素中 的應用。本發明提供的編碼雞α幹擾素的優化基因為序列表中序列2所示的DNA。含有序列表中序列2所示的DNA的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系均屬 於本發明的保護範圍。所述重組載體可為將序列表中序列2所示的DNA插入pET28b⑴的多克隆位點得 到的重組質粒。所述重組載體具體可為將序列表的序列2所示的DNA插入pET28b (+)的 NdeI和EcoRI酶切位點間得到的重組質粒。所述重組菌可為將序列表中序列2所示的DNA導入大腸桿菌BL21得到的重組菌； 所述重組菌具體可為將權利要求3所述重組載體導入大腸桿菌BL21得到的重組菌。所述 重組菌優選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b_ChIFN α，已於2010年08月 23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市 朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 4112。本發明還保護一種製備雞α幹擾素的方法，包括如下步驟將所述重組菌進行 IPTG誘導表達後破碎菌體，收集包涵體、洗滌包涵體、溶解包涵體並將其復性，得到含有雞 α幹擾素的溶液。所述誘導表達具體可為在所述重組菌的菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (ΙΡΤ6)誘導劑，使其終濃度為lmmol/L，然後37°C培養4h。所述方法還可包括將所述含有雞α幹擾素的溶液進行蛋白純化的步驟。所述純化的方法具體如下將所述含有雞α幹擾素的溶液用Superdex 75 10/300GL分子篩層析柱純化；純化所用的洗脫液ρΗ = 8. 0，由Tri s、NaCl和水組成， Tris的濃度為20mM，NaCl的濃度為150mM ；洗脫液的流速為0. 3ml/min ；收集洗脫體積為 12. 8ml-15. Iml的洗脫液，即為雞α幹擾素溶液。所述方法製備得到的雞α幹擾素也屬於本發明的保護範圍。所述DNA、重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系均可用於製備雞α幹擾素。本發明發現了一種優化的ChIFNa基因，所述基因的表達能力遠高於現有基因， 將該基因插入pET28b(+)的多克隆位點得到了重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌BL21， 得到了重組菌。該重組菌通過簡單的誘導培養就可以製備出大量ChIFNa蛋白。本發明提 供的基因、重組質粒和重組菌對於雞α幹擾素的生產極具經濟價值，對於肉雞養殖業也具 有重大價值。
圖1為ChIFNa-I基因和ChIFNa -2基因的比對。圖 2 為 ChIFNa-I 基因 PCR 擴增圖；M :marker ；1,2 =ChIFNa-I 基因。圖3為ChIFN a -1的SDS-PAGE檢測結果；C 未誘導對照；I 誘導後對照；S 誘導 後上清；P 誘導後沉澱；箭頭所指為誘導表達的目的蛋白，約20kD，與實際大小(21. 2kD) 相符。圖4為ChIFNa-I的western blot檢測結果；C 未誘導對照；S 誘導後上清；P 誘導後沉澱。圖5為ChIFN a -2的SDS-PAGE檢測結果；1 :marker ；2 未誘導對照；3 誘導後沉澱。圖6為蛋白溶液甲和蛋白溶液乙的ChIFNa蛋白含量比較；2 蛋白溶液乙；3 蛋 白溶液甲。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。pET28b (+)購自Novagen公司產品，貨號為69865-3。大腸 桿菌DH5ci 購自北京康為世紀生物科技有限公司，貨號為CW0808。大腸桿菌BL21 購自北 京康為世紀生物科技有限公司，貨號為CW0809。DF-I細胞(雞成纖維細胞)購自北京中 原公司(ATCC細胞系編號為CRL-12203)。VSV病毒(水泡性口炎病毒)購自中國獸醫藥 品監察所。所有引物合成及測序工作均由上海生工公司完成。以下實施例中的定量試驗， 均設置三次重複實驗，結果取平均值。實施例1、雞ChIFNa-I基因的發現1、雞總RNA的提取根據invitrogen公司的DNA提取試劑盒，從雞(品種為青腳麻雞，購自中國農業 科學院北京畜牧獸醫研究所昌平動物實驗基地)全血中提取雞的基因組DNA。2、特異引物對的設計參照現有雞幹擾素α基因序列，設計引物對如下上遊引物5，-GGAATTCCATATGTGCAACCACCTTCGCC-3，(下劃線標註Nde I 酶切位
佔). /、、、 / 下遊引物5，-CCGGAATTCCTAAGTGCGCGTGTTGC-3，(下劃線標註EcoRI 酶切位點)。3、ChIFNa基因的擴增以步驟1的基因組DNA為模板，用步驟2設計的特異引物對進行PCR擴增，得到 PCR擴增產物。將PCR擴增產物進行測序，測序結果如序列表的序列2所示。已公開的雞ChIFNa基因如序列表的序列3所示(GENBANK ACCESSION NO. DQ226094)。序列2所示基因和序列3所示基因的比對見圖1，兩者存在5個不同核苷 酸，均編碼序列表的序列1所示的ChIFNa蛋白。將序列表的序列2所示的DNA命名為 ChIFNa-I基因，將序列表的序列3所示的DNA命名為ChIFNa -2基因(現有基因)。
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實施例2、ChIFNa-I基因和ChIFNa -2基因的表達一、ChIFN a -1基因和ChIFNa -2基因的製備1、ChIFNa-1 基因的製備製備序列表的序列2所示的DNA，將其作為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物 (ChIFNa-I 基因)。PCR擴增弓丨物對如下上遊引物5，-GGAATTCCATATGTGCAACCACCTTCGCC-3，(下劃線標註 Nde I 酶切位 佔).
y \\\ / 下遊引物5，-CCGGAATTCCTAAGTGCGCGTGTTGC-3，(下劃線標註EcoRI 酶切位點)。PCR 條件為95°C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72V 50s, 30 個循環；72°C IOmin0將步驟2的PCR擴增產物進行電泳，電泳結果見圖2。圖2中，箭頭所指為目的基 因，約500bp，與實際大小(492bp)相符。2、ChIFN a-2 基因的製備製備序列表的序列3所示的DNA，將其作為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物 (ChIFN a -2基因)。PCR擴增引物對和PCR條件同步驟1，將PCR擴增產物進行電泳。二、重組質粒的構建1、重組質粒 pET28b_ChIFN a -1 的構建①切膠回收步驟一的ChIFNa-I基因，用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切後， 回收酶切產物。②用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切pET28b⑴，回收載體骨架。③用T4DNA連接酶將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接，得到連接產 物。④將步驟③的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，挑單克隆進行PCR鑑 定，陽性克隆提質粒進行測序鑑定，測序結果表明，得到了重組質粒pET28b-ChIFNa-l。 pET28b-ChIFNa -1中，在pET28b(+)的NdeI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列2 所示的ChIFNa-I基因。2、重組質粒 pET28b_ChIFN a -2 的構建①切膠回收步驟一的ChIFNa -2基因，用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切後， 回收酶切產物。②用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切pET28b⑴，回收載體骨架。③用T4DNA連接酶將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接，得到連接產 物。④將步驟③的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，挑單克隆進行PCR鑑 定，陽性克隆提質粒進行測序鑑定，測序結果表明，得到了重組質粒pET28b-ChIFNa-2。 pET28b-ChIFNa -2中，在pET28b(+)的NdeI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列3 所示的ChIFNa -2基因。三、重組菌的製備將pET28b_ChIFN a -1轉化大腸桿菌BL-21 (表達菌)，在含卡那黴素的LB瓊 脂平板上挑取含重組質粒的單個重組菌菌落，將其中一個重組菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b_ChIFNα，已於 2010 年 08 月 23 日保藏於中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3 號)，保藏號為CGMCC No. 4112。採用相同的方法將pET28b_ChIFN α -2轉化大腸桿菌BL-21，得到對照菌。四、ChIFN α -1基因和ChIFNa -2基因的表達1、ChIFN a-1 基因的表達①將重組菌E. coli BL21/pET28b-ChIFN α接種於3ml含卡那黴素的LB液體培養 基中，37°C培養過夜活化。②按1 100的體積比將活化菌接種於5ml含卡那黴素的LB培養基中，37°C培養 約2h至對數生長期(D6tltlnm值達0. 5 0. 8)，取出少量作未誘導對照，剩餘部分加入IPTG誘 導劑(終濃度為lmmol/L)，37°C誘導表達4h。③用500 μ 1 PBS (8g NaCl、0. 2g KC1、1. 38g Na2HP04、0. 2g KH2PO4 溶於 11 ddH20, 調PH至7. 4)重懸細菌，小號探頭超聲裂解(超聲2s，停4s，20次)，取出少量作為誘導後對 照；然後 12，OOOrpm 離心 IOmin ；取上清(誘導後上清)，用 500 μ 1 PBS (8gNaCl、0. 2g KCl、 1. 38g Na2HP04、0. 2g KH2PO4 溶於 IL ddH20，調 pH 至 7. 4)重懸沉澱(誘導後沉澱)。分別將未誘導對照、誘導後對照、誘導後上清和誘導後沉澱進行12% SDS-PAGE， 結果見圖3。因為重組蛋白上帶有His標籤，用Anti-His的抗體進行Western Blot驗證，結果 見圖4。圖4表明，所表達的確實是目的蛋白，以包涵體的形式表達。2、ChIFN α-2 基因的表達將對照菌代替重組菌Ε. coli BL21/pET28b-ChIFNa，其它完全同步驟1。分別將未誘導對照和誘導後沉澱進行12% SDS-PAGE,結果見圖5。因為重組蛋白上帶有His標籤，用Anti-His的抗體進行Western Blot驗證，結果 表明，所表達的確實是目的蛋白，以包涵體的形式表達。五、蛋白的純化分別將步驟四的1的②的菌液和步驟四的2的②的菌液提取純化蛋白，步驟如 下①取2L誘導後的菌液，離心收集菌體，超聲破碎(超聲6s，間隔12s，99次，300W)， 離心收集沉澱(包涵體)。②依次用 washing buffer (0. 5% -100, 50mM Tris pH = 8. 0,300mM NaCl, IOmM EDTA, IOmM DTT)、resuspension buffer (50mM Tris pH = 8. 0, IOOmM NaCl, 1 OmMEDTA, IOmM DTT)洗滌包涵體，離心收集沉澱。③用dissolution buffer (6M Gua-HCl，10 % 甘油，50mM Tris pH = 8. 0, IOOmM NaCiaOmM EDTA, IOmM DTT)完全溶解包涵體，離心棄沉澱。④稀釋法進行復性上清加入5mL注射器內，緩慢滴入refolding buffer (IOOmMTris pH = 8. 0,400mM L-Arg HCl,2mM EDTA, 5mM GSH,0. 5mM GSSG)，4°C低速 攪拌 12-24h。⑤將步驟④的溶液用濃縮杯於4°C進行濃縮，濃縮至20ml左右時加分子篩緩衝液 (20mM Tris pH = 8. 0，150mM NaCl)至100ml繼續濃縮，重複2次再次濃縮至20ml左右時移至濃縮管濃縮至4ml。⑥取Iml上述濃縮液12000rpm，IOmin離心，用Superdex 7510/300GL分子篩層析 柱純化(柱體積為24ml ；填充物為葡聚糖凝膠；洗脫液20mM Tris pH = 8. 0，150mMNaCl ； 流速0. 3ml/min)，收集洗脫體積為12. 8ml_15. Iml的洗脫液，即為目的蛋白溶液。用步驟四的1的②的菌液純化得到的蛋白溶液作為蛋白溶液甲(批次2009001)。 用步驟四的2的②的菌液純化得到的蛋白溶液作為蛋白溶液乙(批次2009001)。六、蛋白溶液甲和蛋白溶液乙的ChIFNa蛋白含量比較分別將步驟五得到的蛋白溶液甲和蛋白溶液乙進行Western Blot，一抗為 Anti-His抗體(購自Santa Cruz公司，貨號為SC_8036)，結果見圖6。結果表明，蛋白溶 液甲中ChIFNa蛋白的含量遠高於蛋白溶液乙中ChIFNa蛋白的含量。實施例3、ChIFNa-I基因和chiIFNa -2基因的表達一、重組菌和對照菌的製備將實施例2的步驟二製備的pET28b_ChIFNa -1轉化大腸桿菌BL-21，得到重組菌。 將實施例2的步驟二製備的pET28b-ChIFNa -2轉化大腸桿菌BL-21，得到對照菌。二、ChIFN a -1基因和ChIFNa -2基因的表達1、ChIFN a-1 基因的表達①將重組菌接種於3ml含卡那黴素的LB液體培養基中，37°C培養過夜活化。②按1 100的體積比將活化菌接種於5ml含卡那黴素的LB培養基中，37°C培養 約2h至對數生長期(D6tltlnm值達0. 5 0. 8)，取出少量作未誘導對照，剩餘部分加入IPTG誘 導劑(終濃度為lmmol/L)，37°C誘導表達4h。2、ChIFN a-2 基因的表達①將對照菌接種於3ml含卡那黴素的LB液體培養基中，37°C培養過夜活化。②按1 100的體積比將活化菌接種於5ml含卡那黴素的LB培養基中，37°C培養 約2h至對數生長期(D6tltlnm值達0. 5 0. 8)，取出少量作未誘導對照，剩餘部分加入IPTG誘 導劑(終濃度為lmmol/L)，37°C誘導表達4h。三、蛋白的純化1、蛋白溶液甲的製備將步驟二的1的②得到的菌液進行純化，方法同實施例2的步驟五，得到蛋白溶液 甲(批次 2009002)。將步驟二的2的②得到的菌液進行純化，方法同實施例2的步驟五，得到蛋白溶液 乙(批次 2009002)。實施例4、ChIFNa-I基因和ChIFNa -2基因的表達一、重組菌和對照菌的製備將實施例2的步驟二製備的pET28b_ChIFNa -1轉化大腸桿菌BL-21，得到重組菌。 將實施例2的步驟二製備的pET28b-ChIFNa -2轉化大腸桿菌BL-21，得到對照菌。二、ChIFN a -1基因和ChIFNa -2基因的表達1、ChIFN a-1 基因的表達①將重組菌接種於3ml含卡那黴素的LB液體培養基中，37°C培養過夜活化。②按1 100的體積比將活化菌接種於5ml含卡那黴素的LB培養基中，37°C培養
8約2h至對數生長期(D6tltlnm值達0. 5 0. 8)，取出少量作未誘導對照，剩餘部分加入IPTG誘 導劑(終濃度為lmmol/L)，37°C誘導表達4h。2、ChIFN α-2 基因的表達①將對照菌接種於3ml含卡那黴素的LB液體培養基中，37°C培養過夜活化。②按1 100的體積比將活化菌接種於5ml含卡那黴素的LB培養基中，37°C培養 約2h至對數生長期(D6tltlnm值達0. 5 0. 8)，取出少量作未誘導對照，剩餘部分加入IPTG誘 導劑(終濃度為lmmol/L)，37°C誘導表達4h。三、蛋白的純化1、蛋白溶液甲的製備將步驟二的1的②得到的菌液進行純化，方法同實施例2的步驟五，得到蛋白溶液 甲(批次 2009003)。將步驟二的2的②得到的菌液進行純化，方法同實施例2的步驟五，得到蛋白溶液 乙(批次 2009003)。實施例5、ChIFNa-I基因和ChIFNa -2基因的表達能力比較比較實施例2至實施例4製備的三個批次的蛋白溶液甲和蛋白溶液乙中的蛋白量 差異，以比較ChIFNa-I基因和ChIFNa -2基因的表達能力，方法如下按50 1的體積比取BCA蛋白定量試劑盒(購自北京康為世紀生物科技有限公 司，貨號CW0014)中的溶液A和溶液B混合成工作液，並將BSA標準品梯度稀釋至500mg/ ml，400mg/ml，300mg/ml，200mg/ml，100mg/ml，50mg/ml，25mg/ml，取各個濃度的標準品或待 測蛋白樣品20μ 1，加200 μ 1的工作液混合，用保鮮膜封好37°C孵育30min，恢復至室溫後 用酶標儀讀OD565吸光值。根據標準品濃度和吸光值繪製標準曲線，再根據標準曲線計算待 測蛋白樣品中的蛋白濃度。蛋白溶液甲(批次2009001)的蛋白濃度為3. 6mg/ml，蛋白溶液乙(批次2009001) 的蛋白濃度為2.3mg/ml。蛋白溶液甲(批次2009002)的蛋白濃度為3. 7mg/ml，蛋白溶液 乙(批次2009002)的蛋白濃度為2.2mg/ml。蛋白溶液甲(批次2009003)的蛋白濃度為 3. 55mg/ml，蛋白溶液乙(批次2009003)的蛋白濃度為2. 35mg/ml。結果表明，雖然只相差5個核苷酸，但本發明提供的ChIFN a -1基因的表達能力遠 遠高於現有的ChIFNa -2基因。實施例6、用本發明的方法製備的ChIFNa-I蛋白的幹擾素活性將實施例2至實施例4製備的三個批次的蛋白溶液甲分別分成兩組第一組 4°C-8°C保存，分別於6個月、12個月、18個月和24個月取樣檢測幹擾素活性；第二組25°C 保存，分別於1個月、3個月和6個月取樣檢測幹擾素活性。幹擾素活性檢測方法如下1、細胞製備取生長良好的DF-I細胞，消化後用含10% FBS的DMEM製備細胞懸液；對細胞進 行計數，調整細胞濃度為5 X IO5個/mL的懸液，然後加入到96孔細胞培養板上(100 μ 1/ 孔)，37°C,5% CO2培養8-lOh使其成為單層細胞。2、加入幹擾素處理細胞將蛋白溶液甲用含10% FBS的DMEM預稀釋至終濃度為0. 001mg/ml，作為母液，再
9將母液進行4倍梯度稀釋，稀釋6個梯度，得到各種稀釋液。3、步驟1的細胞培養板每孔中的培養液吸出；細胞培養板中的6個孔(3個陽性 對照孔，3個陰性對照孔)加入100 μ 1/孔的細胞培養液，其餘孔分別加入步驟2的稀釋液 (100 μ 1/孔，每個梯度三個重複)；37°C>5% CO2培養12-15h。4、病毒感染取VSV病毒，用無血清DMEM稀釋成終濃度為1000TCID5(1/ml的病毒稀釋液；陽性對 照孔每孔加入100 μ 1病毒稀釋液，陰性對照孔每孔加入100 μ 1無血清DMEM培養液，其餘 各孔每孔加入100 μ 1病毒稀釋液；培養24h。5、結晶紫染色棄細胞培養液，於每孔中加入結晶紫染色液100 μ 1，室溫放置30min。6、脫色棄染料，並用自來水或雙蒸水衝洗未著色染料，然後在每孔中加入脫色液100 μ 1， 室溫放置IOmin。7、利用酶標儀測定OD57tl值並記錄。8、數據處理以能抑制50%細胞病變的幹擾素含量定義為一個活性單位，運用Reed-Muench法 計算幹擾素效價，即能抑制50%細胞病變的稀釋倍數，結果見表1。表1運用Reed-Muench法計算幹擾素效價
權利要求
序列表的序列2所示的DNA。
2.含有序列表的序列2所示的DNA的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將序列表的序列2所 示的DNA插入pET28b(+)的多克隆位點得到的重組質粒；所述重組載體優選為將序列表的 序列2所示的DNA插入pET28b (+)的NdeI和EcoRI位點間得到的重組質粒。
4.如權利要求2所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌是將序列表的序列2所示的 DNA導入大腸桿菌BL21得到的重組菌；所述重組菌優選為將權利要求3所述重組載體導入 大腸桿菌BL21得到的重組菌；重組菌最優選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/ pET28b-ChIFNa，CGMCC No. 4112。
5.一種製備雞α幹擾素的方法，包括如下步驟將權利要求2或4所述重組菌進行 IPTG誘導表達後破碎菌體，收集包涵體、洗滌包涵體、溶解包涵體並將其復性，得到得到含 有雞α幹擾素的溶液。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述誘導表達是在所述重組菌的菌液中加 入異丙基_ β -D-硫代半乳糖苷，使其終濃度為lmmol/L，然後37°C培養4h。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述方法還包括將所述含有雞α幹擾 素的溶液進行蛋白純化的步驟。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述純化的方法如下將所述含有雞α幹 擾素的溶液用Superdex 7510/300GL分子篩層析柱純化；純化所用的洗脫液pH為8. 0，由 Tris, NaCl和水組成，Tris的濃度為20mM，NaCl的濃度為150mM ；洗脫液的流速為0. 3ml/ min ；收集洗脫體積為12. 8ml-15. Iml的洗脫液，即為雞α幹擾素溶液。
9.權利要求5至8中任一所述方法製備得到的雞α幹擾素。
10.權利要求1所述DNA或權利要求2至4中任一所述的重組載體、重組菌、表達盒或 轉基因細胞系在製備雞α幹擾素中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種編碼雞α幹擾素的優化基因及其在製備雞α幹擾素中的應用。本發明提供的優化基因是序列表的序列2所示的DNA。所述基因的表達能力遠高於現有基因，將該基因插入pET28b(+)的多克隆位點得到了重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌BL21，得到了重組菌。該重組菌通過簡單的誘導培養就可以製備出大量ChIFNα蛋白。本發明提供的基因、重組質粒和重組菌對於雞α幹擾素的生產極具經濟價值，對於肉雞養殖業也具有重大價值。
文檔編號C12N15/21GK101948845SQ20101027055
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者劉文軍, 李晶, 楊利敏, 瞿洪仁, 賈曉娟 申請人:中國科學院微生物研究所