小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80及其應用的製作方法

2023-05-04 11:26:41

專利名稱：小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，涉及小麥耐鹽、抗旱WRKY轉錄因子基因TaWRKY80的克隆及其應用。
背景技術：
近年來土壤鹽潰化及水資源短缺是制約農業生產的ー個全球性問題。鹽害與乾旱不僅嚴重影響植物的生長發育，造成作物減產，而且使生態環境日益惡化(Saibo et al.，Annals of Botany, 2009, 103 (4) : 609-623)0因此，提高作物的抗旱和/或耐鹽能力已經成為現代作物育種工作急需解決的關鍵問題之一。分離克隆耐鹽基因，培育耐鹽新品種已成為全世界的研究熱點之一。小麥是重要的農作物，克隆耐鹽、抗旱基因，培育耐鹽、抗旱小麥新品種已成為當前ー個十分迫切的任務。
目前利用基因工程技術開展植物耐鹽、抗旱方面的研究已取得了較大的的進展。一些實驗表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽相關的基因轉入植物中，可以使轉基因植物的抗鹽能力提高(Chinnusamy et al. , Crop science, 2005, 45:437-448·)。轉錄因子在基因表達和環境脅迫響應中起著關鍵的調控作用。目前，已發現了一些能顯著提高植物耐鹽能力的轉錄因子。研究表明，將這些基因轉化到植物中，可以明顯提高植物的耐鹽能力(Nakashima K. , Plant Physiology, 2009, 149: 88 - 95·)。WRKY是ー個轉錄因子家族，其成員廣泛參與植物的正常生長發育和對各種環境脅迫的響應過程。轉基因研究實驗表明過表達ー些WRKY轉錄因子基因可提高轉基因植株的耐鹽和耐旱性。例過表達大 的GmWRKY54基因可使轉基因擬南介的耐鹽和耐旱性提聞 (Zhou et al. , Plant Biotechnology Journal, 2008，6，486-503.)。將大麥的//FfSXTJS轉入牧草可提高轉基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al. , Molecular Breeding,2010, 25: 419 - 432.)。AtWMY25、AtWRKY33過表達擬南芥也增加了對鹽脅迫的耐受性。目前有關小麥WRKY轉錄因子在耐鹽方面的研究還非常有限，Niu et al研究表明過表達
和可提高轉基因擬南芥的耐鹽和耐旱性(Niu et al.，Plant cell andenvironment, 2012)。進ー步克隆小麥耐鹽、旱相關基因，通過基因工程培育小麥耐鹽、耐旱新品種非常重要。

發明內容
本發明的目的在於，提供了首次從小麥中分離出ー個耐鹽、抗旱的WRKY轉錄因子基因，命名為7 / ァ洲。將該基因連接到過表達載體pCAMBIA super 1300上，利用農桿菌浸染法轉化擬南芥，獲得的轉基因擬南芥植株的生物量、耐鹽性、抗旱能力均比未轉基因對照植株提尚。本發明的技術方案為一個耐鹽、抗旱的WRKY轉錄因子基因TaWRKY80的cDNA序列如SEQ ID No. I所示,胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發明小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80的製備方法首先根據小麥的基因晶片表達譜數據選出在小麥幼苗根中受鹽脅迫顯著上調表達的WRKY轉錄因子基因(探針)，然後根據探針序列設計基因特異性引物，進ー步從小麥根的全長cDNA文庫中克隆其全長cDNA，最後轉化到擬南芥中進行功能研究。I.引物設計
根據晶片探針序列設計基因特異性的下遊引物Wrky2: 5丨-CTTAGGGAATTTTGCCACACTCTTTG-3'，與文庫的 Y 端錨定引物 NT3 :5』 -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3』進行配對，以小麥幼苗根的全長cDNA文庫為模板擴增基因的全長cDNA。2. PCR反應體系(50μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文庫 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至終體積50 μ I
94°C 預變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復性 lmin，72°C延伸 2min，循環 35 次；72°C延イ申5min。3. 1%瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測後發現在IOOObp處有一條目的條帶(圖I)。4.擴增片段的回收、與T載體的連結 對擴增條帶採用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進行。PCR產物與pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為
回收的PCR產物7μ1
10 X Τ4連接酶緩衝液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ I) μ
T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) μ於4°C冰箱連接過夜。5.回收片段的克隆與測序
用CaCl2法製備大腸桿菌DH5a (購自天為時代生物公司)感受態細胞，42°C水浴熱激法進行轉化。向轉化後培養Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混勻，用塗布器將其均勻塗到含有氨苄青黴素的平板上，37°C恆溫倒置培養過夜，待出現明顯單菌落時將平板拿出。根據所用pGEM-T載體克隆位點兩端的T7啟動子和SP6啟動子序列設計通用引物T7，SP6對重組克隆進行PCR鑑定。PCR 程序94°C 預變性 IOmin ;94°C變性 lmin，58°C復性 lmin，72°C延伸 ImirUM環35次；72°C延伸5min ；
PCR擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進行測序。測序結果見SEQ ID No. I。小麥耐鹽、抗旱基因洲在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。尤其是在普通小麥、玉米和水稻植物中的應用。
本發明的有益效果是將小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80連接到過表達載體pCAMBIA super 1300上，利用農桿菌浸染法轉化擬南芥，獲得的轉基因擬南芥植株的生物量、耐鹽性、抗旱能力均比未轉基因對照植株提高。


圖I :7 腸D撕基因全長cDNA序列的擴增結果。M :DNA分子量marker。圖2 :不同處理條件下TaWRKY80基因在小麥山融3號幼苗根和葉中的RT-PCR表達分析，TaActin為內參。圖3 :構建的植物表達載體pCAMBIA_superl300/TaWRKY80的酶切驗證結果。圖4 :轉基因擬南介株系的表型鑑定，
4-A :不同處理條件下對照及轉基因擬南芥株系的表型，
CK為正常生長條件，
4-B至4-G :不同處理條件下對照及轉基因株系植株根長統計結果，
圖5 :正常生長條件下轉基因株系與未轉基因對照株系中脯氨酸含量的測定。
具體實施例方式實施例I、TaWRKY80基因cDNA序列的克隆
I.引物設計
根據晶片探針序列設計基因特異性的下遊引物Wrky2: 5丨-CTTAGGGAATTTTGCCACACTCTTTG-3'，與文庫的 Y 端錨定引物 NT3 :5』 -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3』進行配對，以小麥幼苗根的全長cDNA文庫為模板擴增基因的全長cDNA。2. PCR反應體系(50 μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文庫 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至終體積50 μ I
94°C 預變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復性 lmin，72°C延伸 2min，循環 35 次；72°C延イ申5min。3. I %瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測後發現在IOOObp處有一條目的條帶(圖I)。4.擴增片段的回收、與T載體的連結
對擴增條帶採用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進行。PCR產物與pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為
回收的PCR產物7μ1
10 X Τ4連接酶緩衝液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ I) μ T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) μ於4°C冰箱連接過夜。5.回收片段的克隆與測序
用CaCl2法製備大腸桿菌DH5a (購自天為時代生物公司)感受態細胞，42°C水浴熱激法進行轉化。向轉化後培養Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混勻，用塗布器將其均勻塗到含有氨苄青黴素的平板上，37°C恆溫倒置培養過夜，待出現明顯單菌落時將平板拿出。根據所用pGEM-T載體克隆位點兩端的T7啟動子和SP6啟動子序列設計通用引物T7，SP6對重組克隆進行PCR鑑定。
PCR 程序94°C 預變性 IOmin ;94°C變性 lmin，58°C復性 lmin，72°C延伸 IminJM環35次；72°C延伸5min ；
擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進行測序。測序結果見SEQID No. I。實施例2、不同處理條件下TaWRKY80基因的表達分析 I.材料處理
小麥山融3號的種子室溫萌發，I周后去掉胚乳，用Hangload液體培養基繼續培養I周進行脅迫處理。鹽脅迫在Hangload液體培養基中添加NaCl至終濃度為200mM ；
ABA處理培養基中添加ABA至終濃度為100 μ M ;
不同條件下處理0、0. 5、3、12、24，48小時後分別取幼苗的葉片和根系，提取各種材料的總RNA。2.小麥總RNA提取
Trizol法提取RNA。PMgrose凝膠電泳檢測提取的RNA質量，紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度。3.第一鏈cDNA的合成
採用PrimeScript RT-PCR KU，反應步驟按操作手冊進行。4. RT-PCR反應及電泳
1.以cDNA為模板，進行PCR反應。引物如下 TaAct-S: 5' - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3/
TaAct-A: 5' - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3/
WRTl:5/ -CTGACGAGGGACCCCAGCTTCAAG-3'，
W2 5' -CTTAGGGAATTTTGCCACACTCTTTG-3'
2.PCR體系
ddH204. 7 μ I
10X buffer2 μ I
Primerl (2 μ Μ)I μ I
Primer2 (2 μ Μ)I μ I
dNTP (IOmM each)O. 2 μ I
rTaq polymerase (5U/μ I) O. I μ I 逆轉錄cDNA模板I μ ITotal Volume10 μ I
3. PCR程序
94 °C 5min ;根據基因表達量不同設置 25 30 cycles, 94 °C 20s, 57 °C 60s, 72 °C45s ；72°C 5min。4. I %瓊脂糖凝膠電泳。結 果見圖2。實施例3、TaWRKY80過表達植物表達載體的構建
植物表達載體pCAMBIA-superl300是含有35S啟動子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位點上含有限制性內切酶油al位點。根據基因TaWRKY80的cDNA序列，設計包含完整 ORF 的基因特異性引物 W20RF-1: 5』 -TCTAGAATGGATCCATGGGTCAGCAGC-3』 (xbal),W20RF-2: 5』-GAGCTCCCTACCTAACTTGATCAAACTTGC-3』 (SacI)。用該對引物擴增 7 / ァ洲的cDNA序列。然後用限制性內切酶油al ,SacI酶切載體pCAMBIA-superl300和擴增的目的基因TaWRKY80序列。完全酶切的載體和目的基因經1%瓊脂糖凝膠電泳分離後回收，連結，轉化大腸桿菌DH5a，PCR檢測陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，酶切驗證，構建獲得植物表達載體 pCAMBIA-superl300/TaWRKY80。步驟如下
(I)質粒pCAMBIA-superl300空載體和目的基因片斷油al單酶切 酶切體系如下
SacI2 μ I
Xbal2 μ I
pCAMBIA-super 1300 載體(或目的基因片段)10 μ I
IOXBuffer M2 μ I
ddH20 To40 μ I
於37°C恆溫水浴鍋酶切3小時以上。(2)酶切產物的電泳與回收
酶切完成後，以I X TAE為電泳緩衝液，將酶切產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔淨刀片切下經酶切的pCAMBIA-SUper1300載體大片段和目的基因片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。(3)連接
經酶切的pCAMBIA-SUper1300載體片段和目的基因片段以摩爾比1:4的比例進行4°C連接過夜。(4)轉化
連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，轉化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固體平板上37°C培養16小時左右。(5)重組子的鑑定
PCR檢測陽性克隆，提取陽性克隆質粒，對質粒進行油al和SacI雙酶切驗證，完成載體構建(圖3)。將構建好的載體pCAMBIA-superl300/TaWRKY80轉化農桿菌菌株GV3101，轉化擬南芥進行基因功能分析。實施例4、基因的功能分析——擬南芥轉化、篩選及表型分析 (O擬南芥的種植將野生型擬南芥種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-X100)消毒15分鐘，然後用無菌水漂洗5-6次，點播於MS平板上，於4° C春化2_3天。然後移植到營養缽中(營養土與蛭石按等比例混合)，23° C培養,16/8 h光周期,光強30-40 μ moIm-2 s_l ;待植株開花後,到去其主枝頂端,促進側枝發展。在到枝後的4_6天內，進行農桿菌轉化。(2)擬南芥轉化
把200 ml菌液倒入淺盤中。將修剪好的擬南芥倒扣並使所有花序浸入懸浮菌液中，輕輕攪動沾花30 sec-1 min0取出花盆側放於託盤中，用保鮮袋包裹以保溼。將託盤置暗處培養24 ho然後取出營養缽並直立放置，恢復光照，繼續培養植株至成熟。(3)陽性植株的篩選T0代種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-XlOO)消毒後，點播在MS選擇培養板(30 mg/L潮黴素)上。於4°C下春化 2-3天。移入培養室中培養。大約10天左右，挑選潮黴素抗性植株(長出真葉1-2對，根伸長至培養基中)並移栽到營養缽中。培養直至種子成熟。同樣方法篩選Tl代種子得到T2代植株。並在T2代植物中挑選抗性比為3:1的單拷貝插入獨立株系，並獲得純合T3代株系進行轉基因擬南芥的分子檢測和表型鑑定。(4)轉基因擬南芥的表型鑑定①擬南芥的種植
T3代單拷貝純合擬南芥株系的種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和
0.01% Triton-X 100)消毒15分鐘，然後用無菌水漂洗5_6次，點播於MS平板上，於4° C春化2-3天，然後移植到營養缽中(營養土與蛭石按等比例混合)，23° C培養，16/8 h光周期，光強 30-40 μ molm_2 s_l。②脅迫處理
將萌發5天的擬南芥幼苗(對照及轉基因株系)小心移栽到營養土中，或轉移到分別含有IOOmM NaCl、150mM甘露醇、IOmM LiCl、5yM ABA和對照MS培養基平板上，豎直培養一周觀察表型。結果表明正常培養條件下轉基因擬南芥比未轉基因對照具有較好的生長勢，生物量增加(圖4A)。在不同處理條件下，轉基因的擬南芥植株的根系明顯長於未轉基因對照株系(圖4-B至4-G)。(5)脯氨酸含量的測定 I標準曲線的繪製
(I)在分析天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內，用少量蒸餾水溶解，然後倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標準液中每ml含脯氨酸100 μ g。(2)系列脯氨酸濃度的配製取6支幹淨試管，分別加入0,0. 1,0. 25,0. 5,0. 75、
1.Oml的100ug/ml標準脯氨酸溶液然後分別加入10、9. 9,9. 75,9. 5,9. 25,9. Oml蒸餾水，混勻，即可配成O、I. 0,2. 5,5. 0,7. 5、10ug/ml系列梯度脯氨酸溶液。分別取各濃度標準脯氨酸溶液2ml，加入2ml3%磺基水楊酸、2ml冰こ酸、和4ml2. 5%茚三酮溶液，置沸水浴中反應60min,冷卻後,各加入4ml甲苯萃取紅色物質。靜置後，取甲苯相在520nm下測定吸光度值，以脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪製標準曲線。2植物組織中國脯氨酸的提取
選取不同乾旱條件下的植物功能葉片lg，用4ml3%磺基水楊酸溶液研磨成漿狀，勻漿液轉入離心管中，在沸水浴中提取lOmin。冷卻後。3000g離心lOmin，取上清液定容至5ml備用。3樣品中脯氨酸含量的測定
取2ml脯氨酸提取液，加入2ml蒸餾水，再加2ml冰こ酸和4ml2. 5%茚三酮溶液，沸水中反應60min,冷卻後各加入4ml甲苯萃取紅色物質。靜置後，取甲苯相在520nm下測定吸光度值
4結果計算根據回歸方程計算出(或從標準曲線上查出)2ml測定液中脯氨酸的含量(Xyg/2ml)，然後計算樣品中脯氨酸含量的百分數。計算公式如下脯氨酸含量(yg/g)=XXV/M
X :從標準曲線上查出的測定液中脯氨酸的含量 V:脯氨酸提取液總體積 M :植物材料質量
結果表明正常生長條件下轉基因株系中脯氨酸的含量高於未轉基因對照株系(圖5)。
序列表 SQ ID No. I 〈110〉濟南大學
〈120〉小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80及其應用
2012-5-18
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211>1053
cDNA
〈213〉小麥
〈221〉小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80基因 〈222〉 (I)…(1053)
1
I ATGGATCCAT GGGTCAGCAG CCAGCCTTCG CTGAGCCTCG ATCTGCACGT CGGCCTCCCG 61 CCGATGGGGC ACCACCAGGC GGCGCCGATG GTGGCGCTGG CCAAGCCCAA GGTCCTCGTC 121 GAGGAGAACT TCATGCAGCT CAAGAAGGAC CCTGAGGTTG CGGTTCTTGA GTCGGAGCTA 181 CAGCGTGTGA GCGAGGAGAA CCGCCGCCTG GGCGAGATGC TCAGGGAGGT GGCCTCCAAG 241 TACGAGGCCC TGCAGGGCCA GTTCACCGAC ATGGTCACGG CCGGCGCCCA CGCCGGCGGC 301 AACAACAGCC ACTACAACAA CCAGCCGTCC TCCGCGTCGG AGGGCGGGTC GGTGTCGCCG 361 TCGAGGAAGC GCAAGAGCGA GGAGAGCCTC GGCACGCCGC CGCGGCCGTC GCAGCACCAG 421 CAGCAGCACT ACGCCGGCGG CCTCGCGTAC GCGGCGGCGC CGGACCAGGC GGAGTGCACG 481 TCGGGCGAGC CGTGCAAGCG CATCCGGGAG GAGTGCAAGC CCGTCGTCTC CAAGCGCTAC 541 GTCCACGCCG ACCCCTCCGA CCTCAGCCTG GTGGTGAAGG ACGGGTACCA ATGGCGCAAG 601 TACGGGCAGA AGGTGACCAA GGACAACCCC TGCCCCCGAG CCTACTTCCG CTGCTCCTTC 661 GCCCCCGGCT GCCCCGTCAA GAAGAAAGTG CAGAGGAGCG CCGAGGACAA GACCATACTG、721 GTGGCGACGT ACGAGGGCGA GCACAACCAC ACCCAGCCCC CGCCGTCGCA GCCGCAGCAG781 CAGAACGACG GCTCCGGCGC GGGCAAGAAC GCTGGGAAGC CGCCCCAGGC GCCGACTGCC841 ACGCCTCACC ACCCGCAGCA GCAGCACAAG CAGGAAGCGG CAGCGGCCGC CGTCAGCGGC901 GAGTCGGCCG TGGCGGCGTC CGAGCTGATC CGGCGCAACC TGGCGGAGCA GATGGCCATG961 ACGCTGACGA GGGACCCCAG CTTCAAGGCG GCGCTCGTCT CCGCGCTCTC CGGCCGGATC1021 CTCGAGCTAT CGCCGACCAG GGACATCAAT TAASQ ID No. 2〈110〉濟南大學
〈120〉小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80及其應用
2012-5-18
〈160〉 I
〈210〉 I
350
AA
〈213〉小麥
〈221〉小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80基因〈222〉 (I)…(350)
1
IMDPffVSSQPS LSLDLHVGLP
21PMGHHQAAPM VALAKPKVLV
41EENFMQLKKD PEVAVLESEL
61QRVSEENRRL GEMLREVASK
81YEALQGQFTD MVTAGAHAGG 101NNSHYNNQPS SASEGGSVSP
121SRKRKSEESL GTPPRPSQHQ
141QQHYAGGLAY AAAPDQAECT
161SGEPCKRIRE ECKPVVSKRY
181VHADPSDLSL VVKDGYQffRK
201YGQKVTKDNP CPRAYFRCSF
221APGCPVKKKV QRSAEDKTIL
241VATYEGEHNH TQPPPSQPQQ
261QNDGSGAGKN AGKPPQAPTA
281TPHHPQQQHK QEAAAAAVSG
301ESAVAASELI RRNLAEQMAM
321TLTRDPSFKA ALVSALSGRI
341LELSPTRDIN *
權利要求
1.一種小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY80,其特徵在於所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No. I 所示。
2.如權利要求I所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因hrMT洲，其特徵在於所述轉錄因子基因編碼的蛋白質，其氣基酸序列為SEQ ID No. 2所不。
3.如權利要求I所述一種小麥耐鹽、抗旱基因在培育耐鹽植物中的應用。
4.如權利要求3所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因TamKY80的應用，其特徵在於所述植物是普通小麥、玉米和水稻。
全文摘要
本發明屬於基因工程技術領域，涉及小麥耐鹽、抗旱WRKY轉錄因子基因TaWRKY80的克隆及其應用。本發明公開了一種小麥耐鹽WRKY轉錄因子基因TaWRKY80及其在培育耐鹽植物中的應用。實驗證明，本發明所述轉基因植株的耐鹽能力提高。本發明的基因對培育耐鹽植物(特別是作物)具有重要作用。
文檔編號C07K14/415GK102703466SQ20121013556
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者田延臣, 秦餘香 申請人:濟南大學