副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲elisa試劑盒的製作方法

2023-05-04 11:44:21

專利名稱：副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲elisa試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫學領域，具體涉及ー種副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，雜交瘤細胞株及抗原捕獲ELISA試劑盒。
背景技術：
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)是一種嗜鹽性細菌。副溶血性弧菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的醃製食品，如鹹菜、醃肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存I個月以上，海水中可存活47天。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要症狀。本病多在夏秋季發生於沿海地區，常造成集體發病。近年來由於海鮮空運，內地城市病例也逐漸增多。目前檢測食品中致病微生物的方法主要以傳統方法為主，即分離鑑定方法，該方法所需時間長，一般情況下需要5-7天，有時達到10-15天，很難滿足快速鑑定的需要；近幾年發展起來的PCR技木，是ー種快速、靈敏、特異性好的技術，但是目前該技術還是依賴於傳統方法的前增菌步驟，增菌液中往往含有PCR抑制劑，從而影響PCR的擴增結果；以抗體為基礎的免疫學檢測已經成為食品中有毒有害物質及有害生物檢測不可或缺的重要技術手段。目前已經發展了多種特異性免疫學檢測技術，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、螢光免疫分析(FIA)、時間分辨螢光免疫分析(TrFIA)、化學發光免疫分析(CIA)、生物發光免疫分析(BIA)、免疫沉澱反應、免疫凝集反應、ELISA檢測試劑盒、免疫膠體金試紙條、免疫乳膠檢測試劑等。其中ELISA檢測試劑盒、免疫膠體金試紙條等多種以抗體為基礎的免疫學檢測技木，以其簡便、快速、靈敏、準確、實用的特點一直是國境檢驗檢疫安全偵檢技術體系中的重要組成，已經成為有害生物及有毒有害物質檢測不可或缺的重要技術手段。快速的ELISA方法檢測，作為篩選方法具有快速、靈敏的特點，是受到廣泛歡迎的篩選方法，但是所使用的試劑盒均來自國外，價格昂貴，而且需要配備其專門的儀器。因而，研究開發具有自主智慧財產權的食源性致病微生物的抗體,是開發擁有自主智慧財產權的ELISA檢測方法、膠體金檢測方法、基於免疫反應為基礎的免疫納米磁珠富集方法的基礎。鞭毛是副溶血性弧菌的ー個重要毒力因子，具有特異性的鞭毛抗原(H抗原)，常作為血清學鑑定的依據之一。細菌的鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物學和致病機制研究中具有重要的意義。例如，鞭毛蛋白被認為是一種保護性的抗原用於致病菌的疫苗研究，有研究結果表明，鞭毛蛋白可作為天然免疫應答的誘導劑，誘導產生的天然免疫應答可幫助建立針對外源抗原的獲得性免疫應答，從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的特性。在已往的副溶血性弧菌單克隆抗體的製備過程中，多使用滅活的VP菌體作為抗原，而菌體的大部分蛋白為菌屬共有蛋白，不具有種間特異性，導致收穫的單抗很難避免弧菌菌屬內的種間交叉反應。本研究選用具有種間特異性的鞭毛蛋白作為抗原，並且在陽性克隆篩選過程中排除交叉反應，製備特異性良好的VP單克隆抗體，並將其應用於製備副溶血性弧菌ELISA檢測試劑盒。

發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供ー種副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體可以用於檢測副溶血性弧菌。本發明所要解決的第二個技術問題是提供ー種副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒。
為解決上述技術問題，本發明所提供的技術方案如下本發明所提供的副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCNo. 6061的小鼠雜交瘤細胞株分泌產生。該小鼠雜交瘤細胞株已於2012年4月26日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為其保藏編號為CGMCC No. 6061。保藏編號為CGMCC No. 6061的小鼠雜交瘤細胞株也屬於本發明的保護範圍。本發明還提供了ー種副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒，該試劑盒包括已包被副溶血性弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體的固相載體和酶標記的本發明所述的單克隆抗體。所述酶優選為辣根過氧化酶。進一歩地，為了便於檢測，本發明試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，以及ELISA反應所需的酶聯免疫檢測試劑。其中，所述陽性對照為副溶血性弧菌鞭毛蛋白，所述陰性對照為未免疫副溶血性弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀釋液。所述酶聯免疫檢測試劑，均為常規的酶聯免疫檢測試劑，包括但不限於，酶的底物反應液、洗滌液和反應終止液。本發明具有以下優點和效果首先，本發明通過特異性實驗，包括30株副溶血性弧菌和28株非副溶血性弧菌標準菌株，顯示出良好的特異性和穩定性。其次，敏感性實驗結果表明本發明試劑盒的檢測敏感性為IO3/孔，明顯高於微生物傳統檢測方法，並且具有快速、高效等優點。


圖I.副溶血性弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE圖；泳道I :副溶血性弧菌鞭毛蛋白；泳道2 :蛋白Marker ；圖2.副溶血性弧菌ATCC17802菌體和鞭毛電鏡；圖3.副溶血性弧菌ATCC17802鞭毛蛋白電鏡；圖4. mAb 的 SDS-PAGE 圖；泳道 I :蛋白 Marker ;泳道 2 :mAb。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的製備I.菌體培養及鞭毛蛋白的提取副溶血性弧菌(VibrioparahemolyticusXATCC 17802,實驗室保存)接種於 TlNl培養基(購自北京陸橋技術有限責任公司，貨號CM168)，36°C活化24h;挑取單菌落接種於含2%NaCl的TSA培養基(購自北京陸橋技術有限責任公司，貨號CM417)生長18 24h ;用無菌棉籤將生長良好的菌落均勻塗布在TSA (2%NaCl)培養基上，36°C培養18±2h。次日用無菌棉籤刮下菌體懸浮於預冷的O. 15M NaCl溶液中，冰浴15 30min，IOOOrpm勻漿45sec，立即置於冰上lOmin。勻漿液4°C條件下IOOOOrpm離心IOmin ;取上清液4°C條件下16000rpm離心 2h，棄上清，沉澱重懸於 TET (IOmM Tris, 2mM EDTA, pH8. O, l%Triton X-100)緩衝液中。離心過程重複3次。操作過程保持低溫下進行。最後留取沉澱，溶於少量Tris-EDTA(O. IM Tris,O. ImM EDTA，pH7. 8) buffer 中，4°C保存備用。2. SDS-PAGE 及電鏡鑑定提取的鞭毛蛋白進行SDS-PAGE電泳。5%積層膠，10%分離膠，120V電壓，電泳至膠
底部。凝膠用考馬斯亮藍法染色，脫色後凝膠成像分析系統觀察結果。見圖I。副溶血性弧菌菌體及單生鞭毛電鏡結果如圖2所示。用無菌去離子水離心洗滌兩次菌體，懸浮，取一滴於銅網上，磷鎢酸負染，晾乾，透射電鏡觀察。鞭毛蛋白電鏡採用相同方法，見圖3。3.動物的免疫(I) BALB/c小鼠的免疫以鞭毛蛋白為抗原，免疫61周齡的BALB/c小鼠5隻，設2隻不作免疫小鼠做陰性對照。初次免疫抗原加等量福氏完全佐劑充分乳化後，皮下注射免疫小鼠，40 μ g/小鼠。以後每隔兩周用相同劑量抗原與福氏不完全佐劑充分乳化後免疫。第五次免疫:Γ5天後尾靜脈採血，檢測抗血清效價。(2)紐西蘭純種兔的免疫用副溶血性弧菌鞭毛蛋白免疫雌性紐西蘭兔O. 5mg/只。每隔兩周免疫一次，共免疫5次。五免後3-5天進行心臟大量取血，置37°C I小時，然後放冰箱4°C過夜，隔天取血清純化得副溶血性弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體，_20°C凍存備用。4.抗血清效價抗血清效價採用間接ELISA方法用PBS稀釋VP抗原濃度至I μ g/mL,加入96孔板，100 μ L/孔，4°C過夜。用PBST洗板3次。2%的牛血清白蛋白溶於PBS溶液中，200 μ L/孔，37°C封閉lh。用PBST洗板。5隻免疫鼠血清用PBS梯度稀釋加入對應孔中，100 μ L/孔，空白對照為PBS溶液，陰性對照為未免疫小鼠血清37°C包被45min後洗板。HRP標記的羊抗鼠以1:2500倍數稀釋加入，100 μ L/孔，37°C包被40min後洗板。每孔加新鮮配製的底物溶液100 μ L，37°C作用15min後每孔加入2M濃硫酸50 μ L，用酶聯檢測儀測定0D450nm值，讀數並觀察結果。選擇效價高且滿足？州值> 2.0的小鼠，一周後加強免疫，3飛天內取小鼠脾細胞進行細胞融合。5. P2/0骨髄瘤細胞的復甦和培養提前對凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0)進行復甦，將_80°C冷凍冰箱中凍存的骨髓瘤細胞快速取出後，置於38°C水浴中輕微晃動使其迅速融化，注意凍存管ロ不能碰到水，以免汙染，然後將細胞轉移到含6 IOml RPMI-1640完全培養基(含10%小牛血清的RPMI-1640培養基，小牛血清購自Hyclone，貨號SH30541. 03)的細胞培養瓶中，放入37°C，5%C02培養箱中培養4飛個小時，待細胞全部貼壁生長時，及時換液，以後每隔2 3天傳代一次，並調整細胞使其處於最適生長密度，當細胞達到一定活性，計數，準備進行融合。細胞融合前f 2天對細胞進行I比4傳代，用新鮮培養基調整每瓶細胞濃度為f2X105/ml，一般f 2天即可獲得對數生長期的細胞。6.飼養細胞的製備(I)將BALB/c小鼠拉頸處死，自來水衝洗後，完全浸泡於75%酒精中lOmin，移入超淨工作檯的平皿中，使其腹部朝上。(2)用鑷子提起小鼠胸腹部皮膚，用剪刀剪開ー小ロ，用兩把鑷子將皮膚撕開ー較大的ロ，然後重新換用新的鑷子提起小鼠腹膜，剪開，找到小鼠的胸腺，用鑷子，小剪刀小心將胸腺取出，放在一次性平皿中，細心剝去胸腺上附帶的脂肪、結締組織等，加入RPMI-1640培養基(購自Hyclone，貨號SH30809. 01) 5ml，研磨胸腺，過篩，將胸腺細胞懸液加入離心管 中，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，離心洗滌兩次。(3)用5ml HAT培養液輕輕將細胞重懸並混和均勻，計數，補加HAT培養液至細胞濃度為I 2 X105/ml。(4)將細胞懸液滴入96孔細胞培養板內，100 μ I/孔(兩滴)，放入37°C、5%C02培養箱中培養。7.免疫脾細胞懸液的製備(I)加強免疫3飛天后，選血清效價較高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集並分離血清作為抗體檢測的陰性對照。(2)斷頸處死，自來水衝洗後浸泡於75%酒精中lOmin，取出小鼠放在無菌超淨エ作臺的平皿中，使其腹部朝上。(3)用鑷子提起小鼠胸腹部皮膚，用剪刀剪開ー小ロ，再用兩把鑷子將皮膚撕開ー較大的ロ，然後重新換用新的鑷子提起小鼠腹膜，剪開，找到小鼠的脾臟，小心將脾臟取出，放在一次性平皿中，細心去除脂肪和結締組織。(4)用RPMI-1640洗液衝洗後，加入新的RPMI-1640洗液，用注射器針芯研磨，然後過篩，使脾細胞儘可能都通過網孔擠壓到溶液中，將脾細胞懸液移入離心管中，IOOOrpm離心IOmin,棄上清,離心洗漆兩次。(5)用IOml HAT培養液輕輕將脾細胞重懸，計數，備用。8SP2/0骨髓瘤細胞懸液的製備(I)取4瓶IOOml培養瓶培養好的骨髄瘤細胞(融合前一天換液，融合時細胞應處於對數生長期)，收集於50ml離心管中。(2) IOOOrpm離心5 10分鐘，棄上清。(3)沉澱中加入30ml RPMI-1640洗液，輕輕重懸，混勻，同法再離心洗滌一次。(4)用IOml HAT培養液輕輕將脾細胞重懸並混和均勻，計數，備用。9細胞融合(I)輕輕吹下培養好的骨髓瘤細胞，將其轉移到50mL離心管中，1000r/min離心7min,棄上清，IOmL培養基洗液懸浮,計數。(2)將含1X108個脾細胞的懸液和含2X107個骨髓瘤細胞的懸液混合於ー支50ml的離心管內，補加培養基洗液至30ml,充分混勻。(3) IOOOrpm離心7分鐘，棄去上清，清洗兩次，儘量去上清。(4)用手輕輕彈離心管底，使細胞團塊鬆散均勻呈糊狀。置37°C水浴，預熱5 10min,以達到融合溫度。(5)從4°C冰箱中拿出已配好的50%PEG (MW4000)、RPMI-1640洗液，放在37°C水浴中，預溫備用。(5)將離心管放進含有37 40°C水的燒杯中，轉動離心管，用Iml吸管吸取50%的PEG Iml,沿管壁逐滴、緩慢加入離心管，時間控制在60秒內，然後再用30秒的時間吸取細胞懸液，靜置30秒，再在30秒內將細胞緩緩吹入離心管內。(6)加入預溫好的RPMI-1640洗液，使PEG稀釋而失去促融作用，具體方法前兩分鐘內加2ml,第三分鐘加入3ml,最後在3min內加入20ml。(7)室溫離心融合細胞，800rpm離心7min,棄上清。(8)加入HAT培養液(50X，購自Sigma，貨號H0262)，輕輕吹吸、重懸沉澱細胞。 (9)將融合細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔培養板內，100 μ I/孔(兩滴)，然後將培養板置37°C、5%C02的培養箱中培養。10陽性克隆的篩選和克隆化培養融合後第3天開始，每天觀察各孔細胞生長情況，若有汙染，立即用疊氮鈉處理。融合後第6d、9d用HAT培養液半量換液，HAT選擇培養液維持培養兩周後，改用HT (50X，購自Sigma，貨號H0137)培養液半量換液，以後根據細胞生長情況，f 2d換一次液，兩周後改用完全培養液。待雜交瘤細胞長滿孔底面積的1/10時(約IOd左右)，吸取出現克隆的孔上清用於特異性檢測。採用I. 2. 3中的間接ELISA法。交叉反應用霍亂弧菌(VC)、創傷弧菌(VV)及溶藻弧菌(VA)的鞭毛蛋白為抗原，包被96孔板，測定VP抗血清與3種弧菌的交叉反應情況。用酶聯檢測儀測定0D450，滿足P/N值> 2. O為陽性。將VP抗原包被板檢測結果呈陽性，其他細菌抗原包被板檢測結果呈陰性的雜交瘤細胞用有限稀釋法進行克隆化培養。當細胞長滿孔底面積的1/10時再用同樣方法檢測，強陽性孔再克隆。如此反覆3 4次，直到陽性克隆率達到100%。11腹水製備與抗體鑑定對最後篩選出的陽性克隆雜交瘤細胞進行擴大培養，並且已於2012年4月26日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 6061。常規腹水體內誘生方法製備單抗腹水。mAb的特性鑑定=(I)Ig類和亞類的檢測用小鼠mAb亞類檢測試劑盒測定雜交瘤細胞培養上清中Ig的類和亞類，操作步驟按說明書上進行。(2) Western blot檢測採用常用Western blot實驗方法,測定腹水在I : 2000稀釋度下的特異性。(3)抗體純化及效價測定腹水用Protein G S印harose親和層析法純化後得到抗體，純化後的抗體經倍比稀釋後用間接ELISA法測定效價。抗體經SDS-PAGE分析純度。純化後抗體經SDS-PAGE電泳得到兩條清晰的條帶重鏈分子量50KDa，輕鏈分子量25KDa，圖4所示。抗體ELISA效價結果(見表I)可以看出，稀釋度為I : 2187000情況下仍有很強的陽性反應。表I. mAb 的 ELISA 效價。
權利要求
1.副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCNo. 6061的雜交瘤細胞株分泌產生。
2.分泌產生副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCCNo. 6061。
3.一種副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒，其特徵在於，包括已包被副溶血性弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體的固相載體和酶標記的權利要求I所述的單克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述酶為辣根過氧化酶。
5.根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述陽性對照為副溶血性弧菌鞭毛蛋白，所述陰性對照為未免疫副溶血性弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀釋液。
7.權利要求I所述的單克隆抗體在製備檢測副溶血性弧菌的試劑盒中的應用。
8.權利要求I所述的單克隆抗體在檢測副溶血性弧菌中的應用。
9.權利要求3所述的試劑盒在檢測副溶血性弧菌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲ELISA試劑盒。該副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No.6061的雜交瘤細胞株分泌產生。該副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體可用於檢測副溶血性弧菌。本發明還公開了一種副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒。
文檔編號G01N33/577GK102659942SQ20121016027
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者張蕾, 張西萌, 曾靜, 魏海燕 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心