一種定向克隆方法及載體的改造方法及t載體的製作方法

2023-05-05 04:45:41

專利名稱：一種定向克隆方法及載體的改造方法及t載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種定向克隆方法及載體的改造方法及T載體。
背景技術：
PCR是目前體外基因擴增最常用的方法，對PCR產物進行快速有效的克隆，是開展基因保存、擴增，測序以及表達的有效方法。為此，國內外許多學者探索了很多不同的克隆方法。常用的方法有非定向克隆和定向克隆，這兩種方法都建立了相應載體，不過這些現有的克隆載體雖然都能夠達到克隆的目的，但是也各有一定的不足之處。
T載體快速高效克隆PCR產物的明顯優勢顯示了其在構建各種基因文庫中的應用前景，由於載體3 』端各有一個突出的3 』 dT殘基，恰好可與PCR產物末端由於Taq DNA聚合酶非模板依賴的末端轉移酶活性而添加的dA(脫氧腺苷)互補配對，這種以粘性互補配對連接到載體上，稱為T-A克隆，具有操作簡單、快速高效、陽性克隆比例高等優點，從而大大提高PCR產物的連接效率。然而，T載體也有一定的不足之處，由於載體與PCR產物兩端均是T-A連接，因此PCR產物可能正向連接或反向連接載體，無法實現定向克隆，需經送樣測序後方可知產物與載體連接方向。目前商業化的T載體如pMD-18T，pGEM-T等均是是克隆型載體，僅能克隆擴增DNA片段，測序等功能，不能用於表達蛋白，另外還存在載體易發生自連，陽性克隆難以篩選等問題。
T載體按照功能可分為克隆型T載體與表達型T載體，目前市場上供應的T載體主要是克隆型T載體，具有克隆目的基因的功能，僅滿足擴增和測序的需要。若要表達目的基因，還需要將目的基因重組至表達載體中。表達型T載體同時滿足基因克隆和表達的需要，可直接連接目的基因進行蛋白質表達分析，操作簡便，避免過多操作步驟影響目的基因的序列。但是製備高效表達型T載體有很多難點。克隆型T 載體無需顧及目的DNA片段的連接方向，只需有複製起點、篩選標記即可，而表達型T載體除了上述要素外，還需要轉錄/翻譯的必要元件-啟動子，終止子等，另外必須顧及上下遊的表達調控元件，它們均需要嚴格的方向次序排列。由於表達型T載體與目的基因PCR片段連接兩端仍然是是同樣的 T-A連接，同樣目的基因PCR片段與載體可發生正向或反向連接的情況，不能以確定的方式連接，基因表達要求目的基因必需以正確的方向連接方可表達出目的蛋白，所以，基因PCR 片段與載體連接後必需先轉入細胞，挑取一批單克隆菌株進行培養，表達前必須送樣測序， 等待測序結果時間較長，不僅拖延實驗的進度，而且耗費大量的人力物力，需要從眾多測序結果中經過序列比對確認目的基因的連接方向，方能進行表達，這大大增加了研究開發的困難。由於上述的問題限制了表達型T載體應用範圍，目前市面上僅有少數的幾種表達型 T載在售，並且因為上述各種原因導致極少人願意採用。
因此，現有技術有待於完善和發展。發明內容
鑑於上述現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種定向克隆方法及載體的改造方法及T載體，利用可變限制性內切酶Xcm I製備出可進行高效快捷的能定向克隆T載體，旨在解決現有T載體不能進行定向克隆的問題。
為了解決上述技術問題，本發明的技術方案如下
在本發明中，提供一種定向克隆的方法，是一種T-A定向克隆方法，其具體包括以下步驟
設計併合成酶切盒所述酶切盒的兩端帶有Xcm I內切酶酶切位點，並在所述酶切盒的兩端分別添加其他酶切位點；
構建T載體將所述酶切盒構建到載體上，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的 T載體；
形成兩端帶有突出的dT的線性化的T載體採用Xcm I內切酶對所述第二表達載體進行單酶切，形成兩端帶有突出的dT的線性化的T載體；
生成目標基因PCR片段將目標基因片段用PCR擴增方法在5』或3』端加入一個與T載體的3』或5』端所對應相同的限制性內切酶位點，得到目標基因PCR片段，所述所對應相同的限制性內切酶位點在目標PCR片段中與T載體中均有且僅有一個；
構建含有目標基因的重組載體用T4連接酶把目標基因PCR片段與T載體連接起來構成含有目標基因的重組載體。
所述定向克隆的方法，還包括以下步驟
轉化和鑑定將所述含有目標基因的重組載體轉入大腸桿菌感受態細胞中，通過塗抗性平板得到單克隆菌落，挑取單克隆菌落進行擴大培養，然後提取質粒，再用限制性內切酶進行單酶切鑑定，確定目標基因的連接方向；
其中，轉化和鑑定步驟中所述的限制性內切酶為生成目標基因PCR片段步驟中所述的限制性內切酶位點所對應的限制性內切酶。
具體地，所述設計併合成酶切盒步驟中，包括以下步驟
合成標記基因，所述標記基因用於鑑定和篩選所述酶切盒是否成功地擴增出所述酶切盒；
在所述標記基因的兩端添加多個酶切位點；其中，所述標記基因的兩端均添加有一 Xcm I內切酶酶切位點；
擴增所述酶切盒片段，並進行鑑定通過PCR擴增所述酶切盒片段，並進行電泳鑑定。
所述構建T載體步驟中，包括以下步驟
將所述酶切盒片段與pMD-19T載體相連，得到帶有所述酶切盒的第一重組載體；
將所述第一重組載體轉化到感受態細胞中，培養後挑取單菌落，進行擴大培養，從菌液中提取所述第一重組載體；
對載體和所述第一重組載體分別用同樣的限制性內切酶進行雙酶切；其中，進行雙酶切所採用的限制性內切酶不是Xcm I內切酶；
回收所述第一重組載體切出的酶切盒片段和酶切後的載體；
將所述重組載體切除的酶切盒片段和酶切後的載體進行連接，形成第二重組載體；
將第二重組載體轉化至感受態細胞，培養後挑取單菌落，進行擴大培養，從菌液中提取所述第二重組載體；
對所述第二重組載體用同樣的限制性內切酶進行雙酶切酶切鑑定，經鑑定正確後，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的T載體。
其中，所述載體可以為克隆型以及表達型載體。所述載體可以原核表達載體或真核表達載體。
所述生成目標基因PCR片段步驟中，具體地為
將目標基因片段用PCR擴增方法在5』端加入一個與T載體的3』端所對應相同的限制性內切酶位點，或是，將目標基因片段用PCR擴增方法在3』端加入一個與T載體的5』 端所對應相同的限制性內切酶位點，得到目標基因PCR片段，所述所對應相同的限制性內切酶位點在目標PCR片段中與T載體中均有且僅有一個。
本發明中還提供一種載體的改造方法，其具體包括以下步驟
設計併合成酶切盒所述酶切盒的兩端帶有Xcm I內切酶酶切位點，並在所述酶切盒的兩端分別添加其他酶切位點；
構建T載體將所述酶切盒構建到載體上，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的 T載體。
所述載體的改造方法還包括以下步驟
將所述T載體用Xcm I內切酶進行單酶切，形成兩端帶有突出的dT的線性化的T 載體。
另外，本發明中還提供一種T載體，所述T載體為具有定向克隆功能的T載體，是採用上述的表達載體的改 造方法對現有表達載體進行改造得到的。其中，所述現有表達載體包括克隆型載體以及表達型載體。
本發明所提供的T-A定向克隆技術能廣泛用於PCR產物的直接定向克隆，具有很高的應用價值，有以下幾方面的積極效果1、PCR產物無需酶切、純化，連接載體後用單酶切確定連接方向，以簡單快捷的方法實現定向克隆，然後直接進行表達，節省寶貴的研究時間。而且，本發明所構建T載體無需事先進行雙酶切，純化回收等各種步驟，製備方法簡單一步到位，與傳統的定向克隆和T-A克隆方法相比具有明顯優勢。2、操作簡化，重組載體經單酶切鑑定連接方向後即可立即進行蛋白表達的等工作。3、與傳統方法相比，經單酶切鑑定後的重組載體測序的成功率提聞很多，能達到100%準確。


圖1為PCR片段3』端引入酶切位點A順式連接示意圖。
圖2為PCR片段3』端引入酶切位點A反式連接示意圖。
圖3為PCR片段5』端引入酶切位點D順式連接示意圖。
圖4為PCR片段5』端引入酶切位點D反式連接示意圖。
圖5為實施例1中pQE-T構建過程技術路線圖。
圖6為實施例1中pQE-T酶切位點示意圖。
圖7為實施例1中酶切盒片段的電泳鑑定的結果圖。其中，M TaKaRa5, OOOMarker ；1:酶切盒PCR產物。
圖8為實施例1中pT-Q質粒和雙酶切電泳圖。其中，M =TaKaRa 5000Marker ；1 pT-Q ;2 :pT-Q 雙酶切後(EcoR I/Hind III)。
圖9為實施例1中pQE-T載體設計及鑑定電泳圖。其中，M TaKaRa5, OOOMarker ；1:酶切盒 PCR 產物 T-Q ；2 pT-Q ；3 :pT_Q 雙酶切產物(EcoR I/Hind III) ；4 :pQE_TX ；5 pQE-ΤΧ 雙酶切產物(EcoR I/Hind III) ;6 :pQE_TX 單酶切產物(Xcm I)。
圖1Oa為實施例1中pQE_TX質粒5』端的DNA測序圖。
圖1Ob為實施例1中pQE-TX質粒3』端的DNA測序圖。
圖11為實施例1中pQE-T載體與hRBP連接鑑定的結果圖。其中，l:TaKaRa 5，OOOMarker ；2 hRBP讀碼框PCR產物；3 pQE-T載體與hRBP連接後的菌液質粒；4 2中質粒BamH I單酶切產物。
圖12為實施例1中重組hRBP在大腸桿菌表達的SDS-PAGE圖譜。其中，M :標準蛋白分子量Marker ；1 BL21空白對照；2_5 :1PTG誘導含pQE_hRBP重組質粒的BL21表達，誘導時間分別是0，1，3，5小時。
圖13為實施例1中RBP蛋白的western blotting檢測結果圖。其中,M:標準蛋白Marker ；1:1PTG誘導含pQE_hRBP重組質粒的BL21表達。
圖14為實施例1中RBP蛋白指紋圖譜。
圖15為實施例2中構建的T載體的技術路線圖。
圖16為實施例2中pYD-T載體結構示意圖。
圖17為實施例2中酶切盒PCR反應的引物酶切位點分布圖(序列空格處為區分酶切位點序列而設置，無其他特殊意義)。·
圖18為實施例2中重組質粒構建與鑑定電泳圖。其中，M 5000bpMarker ；1 :酶切盒PCR產物；2 pMD-YFP質粒；3 :pMD_YFP質粒NheI和Xho I雙酶切；4 pYD-T質粒；5 pYD-T質粒Nhe I和Xho I雙酶切；6 pYD-T質粒Xcm I單酶切。
圖19為實施例2中pYD-YFP載體轉化酵母在雷射共聚焦顯微鏡下的表面展示情況。其中圖19. pYD-YFP載體轉化酵母在雷射共聚焦顯微鏡下的表面展示情況。其中，A :在青色螢光激發下的酵母表面整體觀察圖(激發光波長457nm) ；B :在可見光下的酵母表面整體觀察圖；C :在青色螢光激發下的酵母表面與在可見光下的酵母表面整體觀察圖的重疊圖；D :在青色螢光激發下的酵母表面的局部放大圖；E :在可見光下的酵母表面結構圖；F 在青色螢光激發下的酵母表面結構圖與在可見光下的酵母表面結構圖的重疊圖。
圖20為實施例2中PYD-RFP質粒鑑定電泳圖。其中，M 5000bp Marker ；1 :紅色螢光蛋白質粒；2 pYD-RFP質粒；3 pYD-RFP質粒經BamH I單酶切。
圖21為實施例2中pYD-RFP在雷射共聚焦顯微鏡下的整體觀察圖。其中，A :在紫外光激發下的酵母表面結構圖(激發光波長407nm) ；B :在可見光下的酵母表面結構圖；C 在紫外光激發下的酵母表面結構圖與在可見光下的酵母表面結構圖的重疊圖。
具體實施方式
本發明提供一種定向克隆方法及載體的改造方法及T載體，為使本發明的目的、 技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
由於T載體在線性質粒DNA的3』末端均連接有一個-T殘基，因此可與以3』有-A 殘基PCR產物連接，目的基因不能以特定的方向與載體連接，可正向或反向連接，因此無法實現定向克隆。本發明利用可變限制性內切酶Xcm I製備出可進行高效快捷的能定向克隆的T載體。用本發明方法改造表達載體而成的定向克隆T載體可直接用於蛋白表達研究。 與傳統分子生物學方法相比，目的基因的PCR產物無需酶切、純化，直接通過TA克隆重組於載體，通過挑取單克隆菌落提取質粒並進行簡單的單酶切鑑定即可確定目的基因的連接方向，而無需通過傳統的測序等繁瑣步驟才能確定連接方向，以簡單快捷、準確高效的方式實現定向克隆。本技術所構建T載體無需事先進行雙酶切，純化、回收等繁瑣步驟，具有明顯優勢，該方法簡單有效無需昂貴的器材，一般條件的實驗室均可操作實行。
具體的，本發明是利用可變限制性內切酶Xcm I構建的酶切盒，5』和3』端設有多個不同的限制性酶切位點，構建到表達載體上，通過Xcm I單酶切生成兩端帶有突出的『T』 的克隆位點(T Cloning Site),目標基因片段用PCR擴增方法在5』或3』端加入一個與T 載體的3』或5』端所對應相同的限制性內切酶位點(該限制性內切酶位點務必確保在目標 PCR片段中與T載體中均有且僅有一個)，然後用T4連接酶把目標基因PCR片段與T載體連接起來構成重組載體，再轉入大腸桿菌感受態細胞中，通過塗抗性平板得到單克隆菌落，挑取數個至十多個菌落擴大培養，然後提取質粒，再用所設的限制性內切酶進行單酶切鑑定， 如果能切出與目標基因PCR片段大小相約的片段，即可鑑定為正向連接。
所述鑑定過程和原理如下
一、假設目標基因PCR片段在3』端加入一個和T載體的5』端所對應相同的限制性內切酶位點A (可選A或者B限制性內切酶位點)，用T4連接酶把目標基因PCR片段與T 載體連接起來構成重組載體會出現兩種的連接情況順式連接和反式連接。若是順式連接時如圖1所示，用限制性內切酶A進行單酶切鑑定，會出現與目標基因PCR片段大小相約的片段(約多了十多bp)。如若是反式連接就會出現如圖2所示結果，用限制性內切酶A進行單酶切鑑定，只能得到長度約為二十來個bp的片段，實際上在瓊脂糖凝膠電泳中是看不到條帶的。因此能鑑定出克隆片段是正向或反向連接。
二、假設目標基因PCR片段在5』端加入一個和T載體的3』端所對應相同的限制性內切酶位點D (可選C或者D限制 性內切酶位點)，用T4連接酶把目標基因PCR片段與T 載體連接起來構成重組載體會出現兩種的連接情況順式連接和反式連接。若是順式連接時如圖3所示，用限制性內切酶D進行單酶切鑑定，會出現與目標基因PCR片段大小相約的片段(約多了十多bp)。如若是反式連接就會出現如圖4所示結果，用限制性內切酶D進行單酶切鑑定，只能得到長度約為二十來個bp的片段，實際上在瓊脂糖凝膠電泳中是看不到條帶的。因此能鑑定出克隆片段是正向或反向連接。
在下面實施例中將通過改造原核表達載體pQE_30a和真核表達載體PYD-1來進一步詳細說明本發明的方案。
實施例1 :原核表達型T-載體的構建
通過對原核表達載體pQE_30a進行改造，設計出利用兩端帶有Xcm I內切酶酶切位點的含有卡那黴素抗性基因的酶切盒，酶切盒兩端添加其它酶切位點，然後再通過重組技術定向克隆兩端帶有Xcm I內切酶位點的含有卡那黴素抗性基因的酶切盒到pQE-30a載體上相應的酶切位點，將測序正確的重組的質粒再用Xcm I內切酶單酶切，把帶有卡那黴素抗性基因的片段切下來，從而形成兩端帶有突出的dT的線性化的T-載體。最後，利用人視黃醇結合蛋白(hRBP)來鑑定構建的T載體的表達功能，通過把hRBP基因的DNA片段PCR後用T4連接酶和線性化的T載體連接，然後導入表達菌大腸桿菌BL21中進行誘導表達，通過 Western Blotting檢測、hRBP蛋白質譜檢測所表達的目標蛋白，由此證明所構建的T載體的正確性。
1.1實驗材料
1.1.1 基因
人視黃醇結合蛋白基因(hRBP)。
1.1. 2 菌株
大腸桿菌JM107 基因型endAl, yrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl, Δ (lac-proAB)/F' [traD36, proAB+, lac Iq, IacZ Δ M15]；
大腸桿菌BL21 (DE3)基因型F』 , ompT, hsdSB (rB-mB~), gal ( λ cI857, indl, Sam7, nin5,lacUV5_T7genel), dcm(DE3)。
1.1.3 質粒
酶切盒所需材料pET-28a、pQE-30a。
1.1.4主要試劑
限制性核酸內切酶EcoRI, Hind III, Nco I，BamH I, Xcm I。
抗生素卡那黴素((Kanamycin,Kana),氨節西林(Ampicillin, Amp)
瓊脂糖,蛋白腖,酵母提取物(yeast extract),氯化鈉(NaCl),氫氧化鈉(NaOH), 30%丙烯醯胺(ACRY)，異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，Tris-HCl緩衝液(1. 5mol/ L pH8. 8 ；0. 5mol/L ρΗ6· 8)，N，N，N』，N』-四甲基二乙胺(TEMED)。其他試劑均為國產分析純。
1.1. 5主要儀器設備高壓滅菌鍋、電子天平、PCR擴增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、分光光度計、電熱恆溫培養箱、恆溫培養振蕩器、冷凍離心機等。
1.1. 6主要試劑的配製
瓊脂糖凝膠電泳緩衝液50X TAE Buffer 242g Tris鹼，57.1ml HAc, IOOml O. 5M EDTA (pH8. O)，定容至 1000ml。使用時稀釋為 IXTAE Buffer。
LB培養基IOg Trypeptone, 5g Yeast extract, IOg NaCl,加 ddH20至 1000ml，用 5M的NaOH調pH至7. 2後進行高壓滅菌。
1. 5M Tris-HCKpH 8.8) Tris 18. 17g 加 ddH20 溶解，濃鹽酸調 pH 至 8. 8，定容至 IOOml。
IM Tris-HCKpH 6.8) =Tris 12.1lg 加 ddH20 溶解，濃鹽酸調 pH 至 6. 8，定容至 IOOml。
10%SDS :電泳級SDS 10. Og加ddH20 68 °C助溶，濃鹽酸調至pH 7. 2，定容至 IOOml。
IOX 電泳緩衝液(pH 8.3) Tris 3. 02g，甘氨酸 18. 8g，10%SDS IOml 加 ddH20 溶解，定容至100ml。使用時稀釋為IX電泳緩衝液。
10% 過硫酸銨(AP) 0.1gAP 加 ddH20 至 Iml。
2 X SDS 電泳上樣緩衝液1M Tris-HCl (pH 6. 8)2. 5ml, β -巰基乙醇1. 0ml, SDSO. 6g，甘油 2. Oml, O. 1%，溴酚蘭1. 0ml, ddH20 3. 5ml。
考馬斯亮蘭染色液考馬斯亮蘭O. 25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH20 225ml。
脫色液甲醇、冰醋酸、ddH20以3 I 6配製而成。
IPTG儲液(200mg/ml):在800 μ I蒸餾水中溶解200mg IPTG後，用蒸餾水定容至 lml，用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝於1. 5ml離心管並儲於_20°C中。
氨節青黴素(Ampicillin Amp)母液將氨節青黴素粉末配成100mg/ml水溶液，-20°C保存備用。
卡那黴素((Kanamycin, Kana)母液將卡那黴素粉末配成1000mg/ml水溶液, 於-20°C保存備用。
1.1. 7培養基的配製
大腸桿菌LB 培養基(液體)IOg Trypeptone, 5g Yeast extract, IOg NaCl,加去離子水至950ml，用5M NaOH調pH至7. 2，定容至1000ml，高壓滅菌(121 °C，20min)後使用 (固體培養基需要加入1. 5%瓊脂，再進行滅菌)。
塗平板前需要加熱固體培養基至完全溶解，放到無菌操作臺內，使溫度降至60°C 以下，加入2%。的氨苄，混勻後迅速倒平板。倒好的平板晾乾後放入4°C冰箱待用。
1. 2實驗方法
1. 2.1酶切盒的設計與合成
設計克隆卡那黴素抗性基因(Kana)的引物pQE_T Pl，pQE_T P2，引物序列如表2.所示，以pET-28a質粒為模板經過PCR擴增出Kana片段(利用引入Kana抗性進行目標克隆的篩選)，再轉入PMD-19T中進行擴增卡那黴素基因表達盒片段。包含有多個酶切位點 (EcoR I，Hind III，Nco I，Xcm I，BamH I)。其中Xcm I內切酶酶切位點在卡那黴素基因表達盒的兩端，另外，在其3』端加上6個His標籤，如圖5，圖6所示。本實驗所需PCR引物如表2.所示。
表2.本實驗所需的引物
權利要求
1.一種定向克隆的方法，其特徵在於，具體包括以下步驟 設計併合成酶切盒所述酶切盒的兩端帶有Xcm I內切酶酶切位點，並在所述酶切盒的兩端分別添加其他酶切位點； 構建T載體將所述酶切盒構建到載體上，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的T載體； 形成兩端帶有突出的dT的線性化的T載體採用Xcm I內切酶對所述第二表達載體進行單酶切，形成兩端帶有突出的dT的線性化的T載體； 生成目標基因PCR片段將目標基因片段用PCR擴增方法在5』或3』端加入一個與T載體的3』或5』端所對應相同的限制性內切酶位點，得到目標基因PCR片段，所述所對應相同的限制性內切酶位點在目標PCR片段中與T載體中均有且僅有一個； 構建含有目標基因的重組載體用T4連接酶把目標基因PCR片段與T載體連接起來構成含有目標基因的重組載體。
2.根據權利要求1所述的定向克隆的方法，其特徵在於，所述定向克隆的方法還包括以下步驟 轉化和鑑定將所述含有目標基因的重組載體轉入大腸桿菌感受態細胞中，通過塗抗性平板得到單克隆菌落，挑取單克隆菌落進行擴大培養，然後提取質粒，再用限制性內切酶進行單酶切鑑定，確定目標基因的連接方向； 其中，轉化和鑑定步驟中所述的限制性內切酶為生成目標基因PCR片段步驟中所述的限制性內切酶位點所對應的限制性內切酶。
3.根據權利要求1所述的定向克隆的方法，其特徵在於，所述設計併合成酶切盒步驟，包括以下步驟 合成標記基因，所述標記基因用於鑑定和篩選所述酶切盒是否成功地擴增出所述酶切盒; 在所述標記基因的兩端添加多個酶切位點，其中，所述標記基因的兩端均添加有一 XcmI內切酶酶切位點； 通過PCR擴增所述酶切盒片段。
4.根據權利要求1所述的定向克隆的方法，其特徵在於，所述構建T載體步驟中，包括以下步驟 將所述酶切盒片段與PMD-19T載體相連，得到帶有所述酶切盒的第一重組載體； 將所述第一重組載體轉化到感受態細胞中，培養後挑取單菌落，進行擴大培養，從菌液中提取所述第一重組載體； 對載體和所述第一重組載體分別用同樣的限制性內切酶進行雙酶切； 回收所述第一重組載體切出的酶切盒片段和酶切後的載體； 將所述重組載體切出的酶切盒片段和酶切後的載體進行連接，形成第二重組載體； 將第二重組載體轉化至感受態細胞，培養後挑取單菌落，進行擴大培養，從菌液中提取所述第二重組載體； 對所述第二重組載體用上述同樣的限制性內切酶進行酶切鑑定，經鑑定正確後，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的T載體。
5.一種載體的改造方法，其特徵在於，包括以下步驟設計併合成酶切盒所述酶切盒的兩端帶有Xcm I內切酶酶切位點，並在所述酶切盒的兩端分別添加其他酶切位點； 構建T載體將所述酶切盒構建到載體上，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的T載體； 所述載體為待改造的載體，所述載體為克隆型載體或表達型載體。
6.根據權利要求5所述的載體的改造方法，其特徵在於，所述設計併合成酶切盒步驟，包括以下步驟 合成標記基因，所述標記基因用於鑑定和篩選所述酶切盒是否成功地擴增出所述酶切盒; 在所述標記基因的兩端添加多個酶切位點，其中，所述標記基因的兩端均添加有一 XcmI內切酶酶切位點； 通過PCR擴增所述酶切盒片段。
7.根據權利要求6所述的載體的改造方法，其特徵在於，所述構建T載體步驟，包括以下步驟 將所述酶切盒片段與PMD-19T載體相連，得到帶有所述酶切盒的第一重組載體； 將所述第一重組載體轉化到感受態細胞中，培養後挑取單菌落，進行擴大培養，從菌液中提取所述第一重組載體； 對載體和所述第一重組載體分別用同樣的限制性內切酶進行雙酶切； 回收所述第一重組載體切出的酶切盒片段和酶切後的載體； 將所述重組載體切出的酶切盒片段和酶切後的載體進行連接，形成第二重組載體； 將第二重組載體轉化至感受態細胞，培養後挑取單菌落，進行擴大培養，從菌液中提取所述第二重組載體； 對所述第二重組載體用上述同樣的限制性內切酶進行酶切鑑定，經鑑定正確後，得到帶有兩個Xcm I內切酶酶切位點的T載體。
8.根據權利要求7所述的載體的改造方法，其特徵在於，所述載體的改造方法還包括以下步驟 將所述T載體用Xcm I內切酶進行單酶切，形成兩端帶有突出的dT的線性化的T載體。
9.一種T載體，所述T載體為具有定向克隆功能的T載體，其特徵在於，所述T載體是採用如權利要求61任一所述的載體的改造方法對載體進行改造得到的； 所述載體為克隆型載體或表達型載體。
10.根據權利要求9所述的T載體，其特徵在於，所述載體為原核表達載體pQE-30a或真核表達載體PYD-1。
全文摘要
本發明公開了一種定向克隆方法及載體的改造方法及T載體，所述定向克隆的方法包括設計併合成酶切盒、構建T載體、形成兩端帶有突出的dT的線性化的T載體、生成目標基因PCR片段、構建含有目標基因的重組載體。本發明定向TA克隆技術可用作製備高效的定向克隆的T載體，在分子生物學實驗中廣泛應用於PCR產物的克隆和表達。由於本發明改造的是表達載體，PCR產物可直接連接該載體，經單酶切鑑定後確定目的基因的連接方向，即可轉入細胞內進行表達，而無需通過傳統的測序等繁瑣步驟才能確定連接方向，以簡單快捷的方法實現定向克隆，一步構建出工程菌，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/66GK103014046SQ20121043968
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月7日 優先權日2012年11月7日
發明者田生禮, 梁志成, 梁秀怡, 劉士德 申請人:深圳大學