一種枯草芽孢桿菌及其菌劑和應用的製作方法
2023-05-04 12:34:31
專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其菌劑和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌，還涉及利用該枯草芽孢桿菌生產的微生物菌劑、製備方法和應用。
背景技術：
玉米葉斑病包括玉米彎孢葉斑病、玉米大斑病與玉米小斑病。
玉米彎孢葉斑病又稱擬眼斑病、黑黴病，是由新月彎孢菌(Curvularia lunata)引起的一種危險性較大的玉米病害。該病主要危害葉片和葉鞘，重病地葉片上病斑密布連片，導致葉片枯焦。20世紀80年代中期，我國河南省新鄉發現該病。病害發展蔓延很快，已在遼寧、北京、河北、河南、山東、吉林、天津等北方玉米產區普遍發生，並已成為我國北方玉米上繼大斑病、小斑病、絲黑穗病之後的又一重要病害，對玉米生產構成了極大的威脅。如1994年河北省隆化、平泉在黃417上和以黃早四為親本的制種田嚴重發生此病，一般減產20％，嚴重的達60％。1996年河北省發生面積為20萬hm以上，減產20％～60％不等。由於玉米彎孢菌葉斑病是突發性病害，發生蔓延迅速，嚴重時葉部病斑密集成片，重病地塊病株率及病葉率高達100％，已成為我國玉米產區的重要病害之一。
玉米大斑病(Exserohilum turcicum)是玉米生產上的重要病害之一，廣泛發生於世界各地，每年該病可造成嚴重的產量損失。該病自70年代以來，在東北、華北北部和南方冷涼山區曾幾度流行，一般年份減產20％左右，嚴重流行年份減產可達50％以上，有時還會加重玉米根腐、莖腐等病害的發生和危害程度，嚴重影響玉米的產量和品質。近年來，由於感病品種的大面積種植及新小種的出現，病害又呈回升趨勢。
玉米小斑病(Bipolaria maydis)又稱玉米斑點病，是我國溫暖潮溼玉米產區的重要葉部病害。20世紀60年代，由於大面積推廣感病雜交種，玉米小斑病的為害日趨嚴重。70年代後，隨著抗病品種的推廣，玉米小斑病的發生和危害基本得到了控制，但由於抗病性品種的大面積單一化種植和全球的氣候變暖，玉米小斑病在我國仍時有發生，並有逐漸加重趨勢，損失嚴重。
目前，對這三種葉斑病的防治方法主要有培育抗病品種和化學藥劑防治。但是由於單一抗病品種的大面積推廣，常給生產上帶來某種葉斑病的年份流行，損失嚴重；而且玉米葉斑病病原菌生理小種多變，常常導致抗病品種抗性的喪失。
化學防治在世界農業發展史上佔有重要的地位。幾個世紀以來，化學農藥在植物病蟲、草、鼠害的防治中發揮著積極的作用，為農業的穩產、增產、挽回損失和提高品質做出了重要貢獻。但同時也因過量施用和濫用農藥導致地力衰退和環境汙染，影響非靶標生物及導致有害生物的抗藥性產生和迅速發展等嚴重問題。尤其近年來因為農產品中農藥殘留超標，造成人畜中毒事件不斷發生，嚴重威脅著人民的生活質量，也限制了我國農產品的外貿出口。化學殺菌劑的潛在汙染已成為農業安全生產中首要的關鍵問題。隨著社會文明的發展，農業可持續發展問題使人類對資源與環境的認識有了新的飛躍，對農藥提出了高效、低毒、環境友好型的要求。世界各國也在採取實際步驟減少化學合成農藥的使用，如美國EPA在20世紀90年就宣布撤消91種化學農藥的登記，荷蘭、丹麥在1990年就制定了減少一半農藥使用量的五年和十年計劃，歐盟也制定了類似的計劃。我國也已撤消十幾種化學農藥的登記。為了解決農產品提高產量和保證質量之間的矛盾，達到綜合防治蔬菜重大病蟲害、減少化學農藥使用量的目的，發展生物防治技術越來越受到各國政府、科技工作者和民眾的關注。目前生產上用於防治玉米葉斑病的化學藥劑主要是常用的殺菌劑，彎孢黴葉斑病用50％退菌特、80％炭疽福美、50％福美雙等600-800倍噴霧；大小斑病可用40％克瘟散、50％多菌靈、75％代森錳鋅等藥劑500-800倍進行葉面噴霧防治，但效果不是很理想，並且化學農藥易給人類和環境帶來很多負面影響，人們正在尋找有效的、環保的防治措施。
生物菌劑以其低毒、環境兼容性好、具有在作物幼苗根際建群的能力，持效期長，有害生物不易對其產生抗藥性等特點得到廣泛的關注和重視，目前國際上先進的農化公司大多積極參與生物菌劑的研究和市場化，特別是有益細菌在土傳、種傳病害的防治中已取得了一定進展，並有系列產品得到成功的應用，取得了顯著的經濟和生態效益。生物防治作為綜合防治的一項重要措施，在植物病蟲害綜合治理中發揮著愈來愈重要的作用。
枯草芽孢桿菌屬(Bacillius subtilis)是目前比較受到廣泛關注的一類生防細菌。以其分布廣，易分離培養，能產生抗逆性較強的芽孢，貯藏期長，使用方便等特點，成為一種理想的生防微生物，自1945年Johnson報導枯草芽孢桿菌產生抗菌物質後，半個多世紀以來各國的研究工作者對它可望成為一種生物控制因素而寄予極大關注，並在多種作物上進行了廣泛的控制病害能試驗，有許多成功應用，在生產實踐中表現出明顯的防病增產作用，也進一步證明了芽孢桿菌生防菌劑在產品中的穩定性，與化學農藥的相容性和不同植物不同年防效的一致性方面明顯優於非芽孢桿菌和真菌生防菌。國內外學者先後分別報導了具有生物控制作用的各個不同株系的枯草芽孢杆的生物學特徵、定殖條件、抗菌物質理化特性等相關研究及其在不同作物不同部位的定殖情況、潛在的誘導植物產生抗病性及促進幼苗生長等方面的研究。已有研究表明，因芽孢桿菌能產生內生芽抱，有極強的抗逆能力，相比其他類型的生防因子，更有利於菌劑的生產，劑型加工在環境中存活，定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的枯草芽孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。經過檢索，還沒有發現能用於防治玉米葉斑病的枯草芽孢桿菌。
發明內容
本發明目的之一是針對抗病品種單一容易喪失抗病性，以及化學農藥防治所帶來的成本高和汙染環境的問題，提供一種可用於生物防治的具有高效、廣譜殺菌活性的枯草芽孢桿菌菌株。
本發明第二個目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌生產的微生物菌劑及其製備方法。
本發明第三個目的是提供了本發明枯草芽孢桿菌在防治玉米葉斑病上的用途。
本發明通過以下技術方案實現一種枯草芽孢桿菌菌株Corn-1(Bacillius subtilis Corn-1)，已於2006年8月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1778。
利用上述枯草芽孢桿菌Corn-1生產的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌Corn-1菌體和它的胞外代謝產物。
上述微生物菌劑可以為液態製劑。
上述微生物菌劑的製備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液製備和發酵培養。
上述微生物菌劑的製備方法，具體包括如下步驟(1)菌種活化將低溫保存的Corn-1菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上擴繁備用；(2)種子液的製備按常規方法製作LB液體培養基，高壓溼熱滅菌後，接入步驟(1)活化的菌株Corn-1，在26～34℃下震蕩培養22～25小時，培養所得菌株Corn-1作為種子液；(3)發酵培養向發酵罐加入混合好的蔗糖豆餅粉培養基和水，初始pH值用NaOH調為6.7～7.2之間，滅菌後待溫度降到30℃以下採用負壓方法接入步驟(2)的種子液，在溫度為26～34℃、通氣量為1∶0.3～1.0、攪拌速度為150～230rpm條件下發酵培養22～36h；(4)檢測發酵液中菌體數量，待發酵液中芽孢率達到90％即可停止發酵培養；所得即為Corn-1菌株的液體製劑。
上述製備方法中所述的培養溫度優選為30～32℃，通氣量優選為0～5h通氣比1∶0.3～0.5；5-10h 9.5～11.5m3/h(通氣比1∶0.5)；10h後20～22m3/h(通氣比1∶1)，攪拌速度優選為170～220rpm，培養時問優選為22～25h。
上述製備方法所述的蔗糖豆餅粉培養基可加入植物油或者有機油作為消沫劑。
上述製備方法中所述植物油的重量百分比可為1～2％；所述有機矽油的重量百分比可為0.4～1.0％。
上述製備方法中所述的蔗糖豆餅粉培養基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2.5～3.5％，豆餅粉1.5～2.5％，NaCl 0.1～0.3％，CaCO30.1～0.3％，KH2PO40.01～0.04％和MgSO4·7H2O 0.02～0.04％，其餘為水。
上述蔗糖豆餅培養基的製備方法，按照重量百分比稱取蔗糖、豆餅粉、NaCl、CaCO3、KH2PO4和MgSO4，然後將它們混合後倒入發酵罐中，再加水至所需體積即可。
上述製備方法中所述的通氣量為每分鐘通入發酵罐的空氣體積與發酵罐中發酵液的體積比。
上述微生物菌劑，其枯草芽孢桿菌Corn-1的活菌數大於5×109cfu/g。
上述微生物菌劑在防治植物病害上的應用。
上述微生物菌劑在防治玉米葉斑病上的應用，所述的玉米葉斑病包括玉米彎孢葉斑病、玉米大斑病與玉米小斑病。
枯草芽孢桿菌菌株Corn-1對棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌、小麥全蝕病菌、小麥根腐病菌、小麥赤黴病菌、玉米紋枯病菌、玉米穗腐病菌、番茄灰黴病菌、番茄早疫病菌和黃瓜枯萎病菌等11種病原真菌的抑菌率在62.50％～94.22％之間，表現出了較廣的抑菌譜。
枯草芽孢桿菌菌株Corn-1對7種主要作物(包括單子葉和雙子葉植物)玉米、小麥、棉花、大豆、黃瓜、西紅柿、茄子沒有傷害現象，表現對作物安全。
本發明菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋，然後將稀釋後的液體菌劑於玉米葉斑病發病高峰前進行葉面噴霧，也可同時噴灑於玉米田的地表，即可達到控制防治玉米葉斑病的目的。
Corn-1菌株的篩選分離過程Corn-1菌株是河北省農林科學院植物保護研究所從其棉花黃萎病病圃土壤中分離得到的。2004年河北省農林科學院植物保護研究所從其棉花黃萎病病圃田間五點採集土樣，混勻後稱取10g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入100mL無菌水，放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液1mL加無菌水9mL，即成10mL10-2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋液，各濃度取200μL微生物懸液塗於PDA、改良PDA、LB和KB培養基平板上，每個濃度3次重複，在28℃恆溫分別培養1d、3d和5d，分別進行細菌，真菌和放線菌的分離和純化。並分別以玉米彎孢葉斑病病原菌(Curvularia lunata)、玉米大斑病病原菌(Exserohilum turcicum)和玉米小斑病病原菌(Bipolaria maydis)為靶標菌，進行拮抗菌的篩選。結果從中篩選出一個對各個供試菌具有明顯抑菌效果的菌株，定名為Corn-1。
Corn-1菌株的特徵(1)形態特徵在LB培養基上培養菌體為杆狀，培養8h後產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體，能運動，鞭毛周生。在營養瓊脂平板上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面溼潤；培養後期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面乾燥有褶皺；在營養瓊脂斜面上劃線培養，呈直線形；在液體培養基中靜止培養，表面形成白色菌膜。
(2)16SrDNA序列測定用於擴增細菌16SrDNA的引物為530F(5』-GTGCCAGCMGCCGCGG-3』)與1494R(5』-GGYTACCTTGTTACGACTT-3』)。以Corn-1的基因組DNA為模板擴增16S rDNA，並進行測序，結果Corn-1的16SrDNA序列見序列表。將所得Corn-1的16SrDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果菌株Corn-1與Bacillus subtilis的16SrDNA同源性達到98％(圖2中，Bacillus subtilis isolate BS-2序列中「-」表示與Corn-1相應的鹼基相同，「g、a、c、t」表示與Corn-1相應位點的鹼基不同)，說明Corn-1菌株屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
(3)生理生化特徵將Corn-1菌株與枯草芽孢桿菌標準菌株1504(中國菌種保藏管理委員會)在相同的實驗條件下進行生理生化性狀檢測(結果見表1)。從表1可以看出，Corn-1菌株的生理生化特徵與枯草芽孢桿菌標準菌株1504相同，說明Corn-1菌株屬於一種枯草芽孢桿菌。
表1菌株Corn-1鑑定結果
注a表示Corn-1在10％NaCl中也能生長。「+」表示陽性結果，「-」表示陰性結果。
細菌常規鑑定手冊(《一般細菌常用鑑定方法》等)顯示枯草芽孢桿菌可運動，革蘭氏陽性，芽孢橢圓形或柱狀、中生或偏中接觸酶試驗陽性，V-P試驗陽性，7％-10％氯化鈉中生長，從葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產酸，水解澱粉，利用檸檬酸鹽作為碳源，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，解酪素，卵黃反應陰性，在葡萄糖和酪氨酸瓊脂上不形成黑色素，不利用丙酸鹽，不分解酪氨酸等特點。將以上Corn-1菌株的部分生理生化性狀檢測結果與枯草芽孢桿菌標準菌株相比較，根據《一般細菌常用鑑定方法》(中國科學院微生物細菌研究細菌分類組編，科學出版社，1978年)，《芽孢桿菌屬》)(蔡妙英，戰立克等譯，業出版社，1988年)和《微生物分類學》(張繼忠，上海復旦大學出版社，1995)的檢索表進行檢索，確定菌株Corn-1生理生化性狀與枯草芽孢桿菌相應性狀吻合。同時16SrDNA序列及根據16SrDNA序列用DNAMAN Version 4.0分析獲得的進化樹結(圖1)進一步確認生化鑑定結果，鑑定Corn-1菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
本發明所具有的優點和有益效果(1)本發明提供了一種能廣譜高效防治玉米葉斑病等植物病害的枯草芽孢桿菌菌株，為防治玉米葉斑病等植物病害提供了一種生物防治的新途徑；(2)本發明抑菌效果顯著，對病原菌的抑菌效果達到60.14％～94.22％；(3)本發明抑菌譜廣，它不僅對玉米葉斑病，而且對棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌等許多病原真菌都有較好的抑制作用；(4)本發明製備方法簡單、成本低、易於推廣應用；(5)本發明無汙染，無公害，低殘留，對環境友好，對提高農產品質量和產量具有重要作用，同時能提高我國農產品的國際竟爭力。
圖1為根據16SrDNA序列用DNAMAN 5.2.2分析獲得的進化樹結果。
圖2為枯草芽孢桿菌Corn-1菌株與枯草芽孢桿菌BS-2菌株(Bacillius subtilisisolate BS-2)的16SrDNA基因序列同源性比較結果。
具體實施例方式
下面以具體實施例來進一步清楚地解釋本發明，但是不以任何方式構成對本發明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法；下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量百分含量。
實施例1Corn-1微生物菌劑的製備，按照如下步驟進行(1)菌種活化將保存於-40℃的菌株Corn-1在LB平板培養基上進行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養基上擴繁備用；(2)種子液的製備按常規方法製作LB液體培養基，在500mL三角瓶中裝入LB培養液200mL，高壓溼熱滅菌，待溫度降到室溫後，每瓶中接入步驟(1)一接種環上述活化好的Corn-1菌株，在搖床上進行振蕩培養，轉速170rpm，並在30℃下培養22h小時，所得可作為種子液；(3)蔗糖豆餅培養基的製備在500L發酵罐中，加入蔗糖10.5kg，豆餅粉7kg，NaCl 0.35kg，CaCO30.35kg，KH2PO40.07kg和MgSO4·7H2O 0.105kg，然後加水350L，攪拌混合得蔗糖豆餅培養基；在121℃對蔗糖豆餅培養基進行滅菌30分鐘，再降溫到30℃備用；(4)發酵培養向步驟(3)所得蔗糖豆餅培養基中接種步驟(2)所得種子液1.75L；在30℃恆溫培養17小時，17小時以後變成35℃恆溫培養，同時輔以轉速180rpm，罐壓0.05-0.06Mpa，通氣條件分別為0-5h 6.3m3/h；5-10h 10.5m3/h；10h後21m3/h進行發酵培養；(5)17h以後，每隔30分鐘從步驟(4)的發酵罐中取樣進行鏡檢，對視野中的芽孢和總菌體數進行計數，並計算芽孢率；芽孢率達到90％即可停止發酵培養；發酵培養22～25h得枯草芽孢桿菌Corn-1液體製劑。
實施例2本試驗在河北省農林科學院植物保護研究所的溫室內進行，分別選用玉米彎孢病病原菌遼9605、玉米大斑病病原菌1號小種和玉米小斑病病原菌2010-1為致病病原菌，三種病原菌均為黃淮海地區玉米葉斑病優勢小種，由河北省農林科學院植物保護研究所綜合防治實驗室提供；玉米小斑病和彎孢葉斑病選用感病品種9831，玉米大斑病實驗選用感病品種8112，均由由河北省農林科學院植物保護研究所綜合防治實驗室提供。在花盆內育苗，每盆10棵苗，每處理四次重複。將實施例1所得的枯草芽孢桿菌Corn-1菌劑用水進行稀釋(含菌體108cfu/mL)，用喉頭噴霧器均勻噴灑於玉米苗葉面，24h後分別接種用高粱粒培養基繁殖的病原菌(低倍鏡下大斑菌10個孢子/視野，小斑菌20-30個/視野，彎孢菌100-200個/視野)，保溼培養(大斑菌20℃，小斑菌和彎孢菌30℃左右)。待空白對照充分發病後調查病級，並計算病情指數和防效。玉米葉斑病病株級別劃分標準和防效計算方法參照《中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗準則》(二)第107部分殺菌劑防治玉米大小斑病(結果見表2)。
結果表明，在溫室內枯草芽孢桿菌Corn-1對三種葉斑病均有較好的防治效果，對玉米彎孢葉斑病、大斑病與小斑病的防效分別為100.00％、83.30％和100.00％。
表2在溫室內枯草芽孢桿菌Corn-1對玉米葉斑病的防治作用
實施例3本試驗在河北省農林科學院植物保護研究所的試驗田裡進行，每小區兩行，四次重複，隨機區組排列。採用背負式手動噴霧器接種病原菌和實施例1所製備的枯草芽孢桿菌Corn-1菌劑(用水進行稀釋，含菌體108cfu/mL)；另設對照藥劑(45％代森銨SL，市購，河北雙吉華工有限公司生產，1500倍水稀釋液噴霧處理)和空白對照(清水噴霧)；處理方法同實施例2，接種病原菌後澆足水。待空白對照充分發病後調查病級(同實施例2)，並計算病情指數和防效。試驗結果表明(見表3)，枯草芽孢桿菌Corn-1的菌劑處理後三種玉米葉斑病的病情指數顯著低於空白對照，其防效達到43.56％～52.04％。枯草芽孢桿菌菌株Corn-1對三種葉斑病均表現了較好的防治效果，防效分別達到了52.04％(玉米彎孢葉斑病，顯著高於藥劑對照)、43.56％(玉米大斑病菌，相當於藥劑對照)和48.16％(玉米小斑病菌，顯著高於藥劑對照)。
表3在田間枯草芽孢桿菌Corn-1對玉米葉斑病的作用效果
實施例4本試驗在河北省農林科學院植物保護研究所的溫室內進行。處理分為菌體懸浮液和去菌體胞外代謝產物。將實施例1所得的枯草芽孢桿菌Corn-1菌劑稀釋(含菌體108cfu/mL)，然後將Corn-1菌劑稀釋液分成兩份，一份用於直接噴霧(處理為培養液，含菌體與代謝產物)；一份在5000轉/分條件下離心20分鐘，上清液是枯草芽孢桿菌Corn-1的胞外代謝產物；沉澱用離心前等量的0.9％的生理鹽水懸浮，即為菌體懸浮液(含菌體108cfu/mL)；用水作為空白對照。結果(見表4)表明，枯草芽孢桿菌Corn-1的培養液(含菌體與代謝產物)、胞外代謝產物、菌體懸浮液處理的病情指數差異不顯著，但是都顯著低於空白對照，說明枯草芽孢桿菌Corn-1胞外代謝產物和活菌體對玉米葉斑病都有防治作用。因此枯草芽孢桿菌Corn-1防治玉米彎孢葉斑病的有效活性成分包括枯草芽孢桿菌Corn-1的菌體及其代謝產物。
表4枯草芽孢桿菌Corn-1菌體及孢外代謝物對玉米彎孢葉斑病的防治效果
實施例5、採用對峙培養法檢測枯草芽孢桿菌Corn-1菌株對11種植物病原真菌的抑制作用，包括玉米紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(F.oxysporium f.sp.vasinfectum)、番茄灰黴病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、玉米穗腐病菌(F.graminearum)、小麥赤黴病菌(F.graminearum)、小麥紋枯病菌(R.cerealis)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis)、小麥根腐病菌(Alternaria triticna)的抑菌譜。這11種病原真菌和枯草芽孢桿菌Corn-1菌株均由河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室保存。具體方法如下枯草芽孢桿菌Corn-1抑制病原真菌效果檢測採用平板對峙培養法，枯草芽孢桿菌Corn-1斜面28℃下活化48h，待測。取本試驗室保存的11種病原真菌，在PDA培養基上活化5d，然後在菌落邊緣用直徑5mm的打孔器打取菌齡一致的菌片，菌絲朝下轉接到另一PDA平板中央，在菌片三周距菌片2cm處呈「品」字形接種待測細菌，以不接細菌為對照，每處理4次重複，放於25℃恆溫培養5d，測量處理菌落半徑和細菌接種點至灰黴病菌菌落邊緣的間距(抑菌帶)，確定抑菌程度，計算抑菌率。
枯草芽孢桿菌Corn-1對供試病原真菌抑制作用結果(如表5所示)枯草芽孢桿菌Corn-1對供試的11種病原真菌的抑菌率在60.14％～94.22％之間，對小麥全蝕病菌的抑菌率達到了94.22％，對小麥根腐病菌的抑菌率最低，為60.14％，說明本發明枯草芽孢桿菌菌株Corn-1具有較廣的抑菌譜。
表5枯草芽孢桿菌菌株Corn-1對植物病原真菌的抑制作用
實施例6室內種子發芽安全性檢測將實施例1所得的枯草芽孢桿菌Corn-1菌液稀釋5倍、10倍和原液分別作為三個處理，設清水為空白對照，對小麥、玉米、棉花、黃瓜、茄子、大豆、馬鈴薯7種主要作物種子(種薯)進行浸種處理30分鐘，然後播於花盆中，每處理50粒種子或種薯，重複3次。觀測各處理對種子發芽的安全性。結果表明(表6)，菌懸液種處理後的小麥、玉米、棉花、黃瓜、茄子、大豆、馬鈴薯等7種作物種子發芽勢和發芽率與對照無顯著差異。
室內葉面噴霧進行檢測將實施例1所得的枯草芽孢桿菌Corn-1菌液稀釋5倍、10倍和原液分別作為三個處理，設清水為空白對照，每處理20棵苗，重複3次；在苗期採用葉面噴霧接種法進行接種，結果表明(表6)，與對照相比，枯草芽孢桿菌Corn-1對7種作物的生長狀況均表現無致病和無傷害作用，對作物使用安全。
表6枯草芽孢桿菌Corn-1對7種大田作物的出苗及生長發育的影響
序列表110河北省農林科學院植物保護研究所120一種枯草芽孢桿菌及其菌劑和應用1601170PatentIn version 3.32101211947212DNA213Bacillus subtilis4001tatctgtcca ccttcggcgg ctggctcata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca60acttctcggg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg120ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcaaac tgcgatccga180actgaaaaca aatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc240cattgtagca cgtgtgtacc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac300cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct taaagtgccc aactgaatgc tggcaactaa360aatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacaac420aaccatgcac cacctgtcac tgggcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcaa480aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcaa attaaaccac atgctccacc540gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc600ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact660catcgtttac ggcgtgaact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct720cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct780acgcatttca ccgctacacg tgaaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt840ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc900gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgctgccacc tacgtat 94權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌菌株Corn-1(Bacillius subtilis Corn-1)，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.1778。
2.利用權利要求1所述菌株Corn-1生產的微生物菌劑，其特徵在於其活性成分為枯草芽孢桿菌Corn-1菌體和它的胞外代謝產物。
3.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特徵在於可按如下方法製備在蔗糖豆餅粉培養基中發酵枯草芽孢桿菌Corn-1，然後將得到的發酵液與基質混合，即得到微生物菌劑。
4.權利要求2或者3所述的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟菌種活化，種子液製備和發酵培養。
5.按照權利要求4所述的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)菌種活化將低溫保存的Corn-1菌株在LB平板培養基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養基上擴繁備用；(2)種子液製備按常規方法製作LB液體培養基，高壓溼熱滅菌後，接入步驟(1)活化的Corn-1菌株，在26～34℃下震蕩培養22～25小時，培養後所得Corn-1菌液作為種子液；(3)發酵培養將按照比例混合好的蔗糖豆餅粉培養基放入發酵罐中，並加入水，初始pH值為6.7～7.2之間，高溫滅菌，然後待溫度降到30℃以下採用負壓方法接入步驟(2)的種子液，再在溫度為26～34℃，通氣量為1∶0.3～1.0，攪拌速度為150～230rpm的條件下發酵培養22～36h；(4)檢測發酵液中菌體數量，待發酵液中芽孢率達到90％停止發酵培養，即得Corn-1菌株的液體製劑。
6.按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的蔗糖豆餅粉培養基中加入植物油或有機矽油。
7.按照權利要求5或6所述的製備方法，其特徵在於所述的發酵培養溫度為30～32℃。
8.按照權利要求5或6所述的的製備方法，其特徵在於所述的發酵培養時間為22～25h。
9.按照權利要求5或6所述的的製備方法，其特徵在於所述的發酵攪拌速度為170～220rpm。
10.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌Corn-1在防治玉米葉斑病上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌Corn－1(Bacillius subtilis Corn－1)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1778，本發明Corn－1菌株可用於玉米葉斑病的防治，具有高效、抑菌譜廣、使用簡單、成本低、無環境汙染等特點。
文檔編號A01N63/02GK1924005SQ200610152019
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月11日 優先權日2006年9月11日
發明者馬平, 李社增, 孔令曉, 鹿秀雲 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所