一種生物分子馬達共振傳感器的構建及檢測方法

2023-05-05 03:38:16 1

專利名稱：一種生物分子馬達共振傳感器的構建及檢測方法
技術領域：
本發明屬於納米分子馬達傳感器生物新技術領域，發現了轉式ATP馬達與共振的相關性，涉及了 ATP馬達傳感器的共振傳感器設計，組裝與生物領域中的應用。
背景技術：
共振是物理學上專業術語，產生共振的重要條件之一，就是具有彈性，而且一件物體受外來的頻率作用時，它的頻率要與後者的頻率相同或基本相近。共振不僅在物理學上運用頻率非常高。而且，共振是宇宙間一切物質運動的一種普遍規律，當然共振也是普遍存在於生命中了。但是應用共振現象組建生物分子馬達超靈敏的共振傳感器，未見報導。

發明內容
本發明人在構建旋轉式生物傳感器過程中，發現了負載與轉速之間存在激活/壓制的現象，而且信號的變化與負載之間存在非線性關係。常用力學理論不能解釋旋轉與負載之間的非線性現象，但是可用共振理論來描述。本發明，將分子馬達旋轉型傳感器發展成為共振型的傳感器。此類生物傳感器的調控因素更加複雜，各種調控要求更高，但是一旦找到了共振的條件將它的應用發展到了一個更高的水平。即使當每個孔的抗體分子數在(pg/ml, well)時,但是其測定抗原的靈敏度可達到(fg/ml, well),要超過其抗體分子數本身的1000倍以上；使傳感器的信號放大與超靈敏的檢測成為可能。並可將其原理廣泛應用於生物大分子的各個領域。在專利200410098929. 9 (
公開日2006年6月21日，CN1789425，已授權)中，我們基於F-ATPase分子馬達的特殊結構功能研究發明了一種可調控分子馬達微動力生物傳感器，該傳感器利用抗體技術通過3亞基抗體-生物素-鏈酶抗生物素-生物素與生物大分子，病毒分子特異性抗原的抗體相連接來實現對分子馬達旋轉功能的調控和作為生物微動力傳感器件在固相的應用。本發明是對申請號為200410098929. 9的中國專利(
公開日2006年6月21日，CN1789425，已授權)進行的進一步重要改進，首先，構建了轉子旋轉式生物傳感器技術，將以前分子馬達傳感器的定子調控測定技術，發展成為轉子旋轉式生物傳感器技術，並且發現，轉子旋轉式生物傳感器是一個共振式旋轉生物傳感器，具有多個共振頻率，由於上述重要的變化，對於分子馬達的製備技術，調控方法等也有重要改進，從而將分子馬達微動力生物傳感器推向了一個更加敏感，更加快速，更加方便應用的新高度。本發明為實現上述目標所實施的技術方案是基於￡亞基作為轉子調控原理，分子馬達旋轉速度的調控，引入了不僅是取決於負載的大小，而且取決於濃度變化與共振之間的關係，對此類生物傳感器的調控因素更加複雜，各種調控要求高，但是一旦找到了共振的條件，就能得到比其它技術更加靈敏的測定生物大分子的方法。用密度梯度離心製備大小均一、活性高的載色體，利用e亞基特異抗體對抗原、核酸及小分子進行了超靈敏快速檢測。該方法適合晶片通量以及自動化的操作。將分子馬達微動力傳感器的應用發展，更力口，靈敏，快速，方便與實用。本發明與CN1789425主要區別為=(I)FtlF1-ATPase分子馬達活性的調控原理不同，CN1789425的原理是轉速隨負載重量變化而改變(定子調控)，而本發明是我們發現FtlF1-ATPase分子馬達活性由FtlF1-ATPase分子馬達e亞基負載轉子共振調控的現象，並且利用此原理可設計全新的生物傳感器，根據e亞基負載可調控雙濃度變化，本發明通過將識別探針(抗體，核酸)連接到e亞基來調控分子共振調控的現象(轉子調控)，(2)本發明將在固/液相中進行旋轉馬達生物傳感器的製備以及檢測工作，使得製備過程以及檢測過程方法大大加快，並且生物活性和均一性得到顯著提高，有利於旋轉式生物傳感器技術應用於高通量的檢測以及自動化的實施。(3)本發明對於ADP的純度要求很高(AmrescoADP貨號0160，純度達到99% )，從而使生物傳感 器技術能夠檢測出共振調控的現象，更靈敏的活性變化(4)實時動態法傳統抗體抗原結合(配體受體結合)反應存在兩個階段a.快速反應階段(特異識別，如親和力，氫鍵，疏水作用等)；b.分子構象變化.傳統抗體抗原Elsia技術需要兩個階段才能觀察，本發明將分子馬達生物傳感器與靶分子的結合和檢測兩個步驟合併為一步進行，邊結合邊檢測，不需要去除游離分子，只需要快速反應階段，大大提高了檢測速度，可達到數秒之內實時動態法；(5)由於引入了高純度的ADP，超靈敏可達到分子水平。(6)本發明可用於抗原檢測，也可用於RNA，DNA的檢測，核酸檢測不需要進行擴增，克服了擴增帶來的假陽性問題。具體來說，本發明涉及如下各項I. 一種改進的分子馬達生物傳感器的均一化製備技術(包括載色體)。該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPase,並且所述FtlF1-ATPase的e亞基上連接有特異的識別分子。2.根據以上I所述的分子馬達生物傳感器，載色體是經過密度梯度離心獲得的大小在50-60nm之間，且ATPase酶活性較高的載色體。3.根據以上I所述的分子馬達生物傳感器，e亞基和識別分子通過e亞基抗體連接。4.根據以上I所述的分子馬達生物傳感器，e亞基所連接的識別分子是可以與待測物質特異結合的分子，從而引起雙濃度變化；5.根據以上2所述的分子馬達生物傳感器，e亞基和識別分子的連接方式可以是通過生物素_鏈酶未和素(或其衍生物)_生物素系統連接，也可以是通過NHS-sulfo和EDC將氨基和羧基連接，還可以是通過互補DNA鏈進行連接。6.根據以上1-5任一項分子馬達生物傳感器，在液相中進行結合反應、ATP合成或者水解反應，由於在液相中，分子之間更容易相互碰撞發生反應，大大縮短了反應時間。7.根據以上6所述，分子馬達和樣品的結合與ATP合成反應可同時進行，邊轉邊測，增加分子碰撞概率，進一步縮短反應檢測時間。8.根據上述1-7所述任一項分子馬達生物傳感器，在蛋白質，核酸，病毒，細菌檢測以及小分子檢測中的應用。9.根據上述1-8所述任一項分子馬達生物傳感器，其檢測原理是以e亞基連接不同負載可以協同共振的方式調控TOFl-ATPase分子馬達的活性為基礎。10.共振調控的分類與檢測方法形態10. I共振原理
權利要求
1.一種改進的分子馬達生物傳感器，該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPase,並且所述F0F1-ATPase的e亞基上連接有特異的識別分子。
2.根據權利要求I所述的分子馬達生物傳感器，其中所述載色體是經過密度梯度離心獲得的大小在50-60nm之間且ATPase酶活性較高的載色體。
3.根據權利要求I所述的分子馬達生物傳感器，其中e亞基和識別分子通過e亞基抗體連接，所述e亞基抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
4.根據權利要求I所述的分子馬達生物傳感器，其中e亞基所連接的識別分子是可以與待測物質特異結合的分子，從而引起雙濃度變化。
5.根據權利要求2所述的分子馬達生物傳感器，其中e亞基和識別分子的連接方式可以是通過生物素-鏈酶親和素(或其衍生物)_生物素系統連接，也可以是通過NHS-sulfo和EDC將氨基和羧基連接，還可以是通過互補DNA鏈進行連接。
6.根據權利要求1-5任一項所述的分子馬達生物傳感器，其中在液相中進行結合反應、ATP合成或者水解反應。
7.根據權利要求6所述的分子馬達生物傳感器，其中分子馬達和樣品的結合與ATP合成反應可同時進行。
8.根據權利要求1-7所述任一項分子馬達生物傳感器，其檢測原理是以e亞基連接不同負載可以協同共振的方式調控TOFl-ATPase分子馬達的活性。
9.根據權利要求1-7所述任一項分子馬達生物傳感器在蛋白質、核酸、病毒、細菌檢測以及小分子檢測中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種生物分子馬達共振傳感器的構建及檢測方法。本發明在構建旋轉式生物傳感器過程中，發現了負載與轉速之間存在激活/壓制的現象，而且信號的變化與負載之間存在非線性關係。常用力學理論不能解釋旋轉與負載之間的非線性現象，但是可用共振理論來描述。本發明，將分子馬達旋轉型傳感器發展成為共振型的傳感器。此類生物傳感器的調控因素更加複雜，各種調控要求更高，但是一旦找到了共振的條件將它的應用發展到了一個更高的水平，是生物傳感器較大的原理與技術突破，產品投入使用後將產生直接的經濟效益和巨大的社會效益。
文檔編號G01N33/68GK102798715SQ201110138288
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月24日 優先權日2011年5月24日
發明者樂加昌, 王佩榮, 張旭 申請人:中國科學院生物物理研究所