鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用的製作方法

2023-05-05 02:26:16 1

專利名稱：鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆、表達技術。
背景技術：
人B淋巴細胞刺激因子(hBAFF)是1999年新發現的一種與人體免疫調控密切相關的腫瘤壞死因子家族成員，主要在外周血單核細胞、脾臟、淋巴結和骨髓中表達。BAFF具有很強的B細胞趨化性，體外它作為B細胞增殖和分化的共刺激因子，能誘導活化的B細胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，對於休眠B細胞,BAFF雖不能獨立激活使之進入細胞周期循環，但通過上調細胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達，延長休眠B細胞的壽命。體內它可以促進脾臟內T1-B細胞向T2-B細胞以及成熟B細胞的發育。BAFF的正常表達是GC形成、抗體親和力成熟、記憶性B細胞形成及B細胞正常發育的必須條件。BAFF-/-小鼠的次級淋巴器官囊外及過渡區B細胞完全缺失。BAFF刺激B細胞增殖、分化並分泌抗體，成熟的B細胞及其產生的抗體構成了機體抵禦感染和抑制腫瘤滋生的關鍵組分。由於BAFF的免疫增強特異活性，自從被發現以來就顯示了巨大的臨床應用前景。2000年11月，美國FDA已正式批准重組人BAFF進入人體臨床試驗，用於治療普通變異免疫缺乏症(CVID)患者。
根據GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列資料庫搜索結果得知，目前只有人、鼠、雞的BAFF cDNA已被克隆，並分別已在GenBank資料庫中申請了序列號，序列號分別是AF116456、AF119383及AF506010。鴨B淋巴細胞刺激因子(duBAFF)cDNA還未被克隆出來，關於鴨BAFF基因的研究在整個國內外還處於完全空白狀態。鴨是十分重要的禽類，由於B淋巴細胞刺激因子(BAFF)具有較強的免疫增強能力，基因工程鴨BAFF蛋白有可能開發成一種能增強鴨類免疫能力的生物製劑，用於體質弱、免疫功能低下的病鴨，增加鴨類抗病毒能力，尤其是在禽流感對人類已構成威脅的今天。近年來，隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發展，大量的禽類細胞因子得以克隆及重組表達，許多細胞因子基因工程藥物面市，給治療禽類疾病提供了新的手段，同時創造了巨大的經濟和社會效益，因此，重組duck BAFF蛋白具有潛在的巨大市場應用價值。同時，B淋巴細胞刺激因子(BAFF)是新發現的免疫系統重要調控因子，對鴨BAFF的研究有助於探索鴨類的免疫調控機制，推動其免疫系統研究的發展。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種從鴨提取的B淋巴細胞刺激因子cDNA，並提供B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組技術。
本發明從鴨中克隆到B淋巴細胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。
鴨B淋巴細胞刺激因子，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。
本發明的鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物正義寡核苷酸兼併引物du15』-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3』(N＝A、T、G、C)反義寡核苷酸兼併引物du25』-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3』(N＝A、T、G、C)(2)從鴨脾臟提取總RNA，(3)通過RT-PCR方法，以上述引物du1及du2為特異性引物，擴增出一段cDNA序列，命名為P1，克隆入pMD18-T載體，並對其鹼基序列進行測定，(4)應用cDNA末端快速擴增(RACE)方法，根據已獲得的P1鹼基序列設計正義引物GSP2(5』-GAAGGCCCACGTGTTTGGTGATGATCTG-3』)及反義引物GSP1(5』-CAGATCATCACCAAACACGTGGGCCTTC-3』)分別用以擴增出上述cDNA3』-及5』-全長末端區域，擴增片段分別命名為P2及P3，分別克隆入pMD18-T載體，對其鹼基序列進行測定；(5)根據P1、P2、P3的重疊區域拼接出cDNA的全長序列，並設計首尾引物FL1(5』-GGAGGAAAGAGCAGCGATGAAATCC-3』)及FL2(5』-GGATGGAACAAAATTAAAATGCACT-3』)一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，挑取陽性克隆進行鹼基序列測定。
上述鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法具體操作如下(1)根據B淋巴細胞刺激因子全長cDNA兩段高保守區域設計同源克隆的正義寡核苷酸兼併引物du1(5』-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3』(N＝A、T、G、C))與反義寡核苷酸兼併引物du2(5』-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3』(N＝A、T、G、C))，(2)應用RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手冊，提取出鴨脾臟細胞的總RNA，(3)應用RT-PCR方法，以上述du1及du2為特異性引物，擴增出一段cDNA序列，全長為408bp，命名為P1，克隆入pMD18-T載體，並對其鹼基序列進行測定。RT-CR的反應條件為以總RNA為模板，在50μl反應體系中，加入5×RT-PCR反應緩衝液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下遊引物各2.5μl、AMV逆轉錄酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，補水至50μl。RT-PCR循環參數為48℃逆轉錄45min，94℃變性2min，再進行40個PCR循環(94℃變性30s，57℃退火1min，68℃延伸2min)，最後於68℃延伸7min。RT-PCR產物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離後，用膠回收試劑盒回收約408bp的DNA條帶，置4℃保存。
(4)應用cDNA末端快速擴增(RACE)方法，採用SMART RACE Kit(Clontech公司)根據已獲得的P1鹼基序列設計正義引物GSP2(5』-GAAGGCCCACGTGTTTGGTGATGATCTG-3』)及反義引物GSP1(5』-CAGATCATCACCAAACACGTGGGCCTTC-3』)分別用以擴增出上述cDNA3』-及5』-全長末端區域，擴增片段分別命名為P2(642bp)及P3(697bp)，分別克隆入pMD18-T載體，對其鹼基序列進行測定。
(5)根據P1、P2、P3的重疊區域拼接出全長序列，並設計首尾引物FL1(5』-GGAGGAAAGAGCAGCGATGAAATCC-3』)及FL2(5』-GGATGGAACAAAATTAAAATGCACT-3』)一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，挑取8個陽性克隆進行鹼基序列測定。
將所得序列與GenBank資料庫序列進行相似性搜索，發現與已知的雞、人、鼠BAFF序列相似率最高，分別是91％、53％、50％，可以確定該序列是鴨B淋巴細胞刺激因子(duBAFF)的全長cDNA，其開放閱讀框如SEQ ID NO.1所示。
對該基因的進一步研究表明該基因主要表達在鴨類免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾臟及胸腺。其中法氏腔上囊表達水平最高，脾臟次之，胸腺最低；該基因的重組融合蛋白具有dsBAFF的高活性功能；該基因編碼的蛋白對鴨B淋巴細胞具有明顯的促存活/增殖效應；對人及鼠的B淋巴細胞都具有促存活/增殖的生物學功能；充分表明本發明克隆得到的基因就是鴨B淋巴細胞刺激因子(duBAFF)的cDNA。
上述鴨B淋巴細胞刺激因子(duBAFF)的cDNA的重組應用，通過現有基因工程方法，生產重組duck BAFF，作為鴨類免疫增強劑。
所說的鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法，轉入鴨體內，增加其免疫力，在飼養中應用。


圖1是duck BAFF全長cDNA的克隆過程示意圖；其中P1代表同源克隆片段；P2代表3』-RACE產物；P3代表5』-RACE產物；箭頭代表引物位置；全長cDNA共1311bp。
圖2是duck BAFF全長cDNA鹼基序列及推測編碼胺基酸序列。AATAAA代表多聚腺苷酸加尾信號；ATTTA代表轉錄不穩定序列。
圖3是duck BAFF與雞、人、鼠BAFF全長胺基酸序列同源性比較圖。其中陰影代表保守的胺基酸；箭頭所指代表弗林蛋白酶識別位點，切割後的C端為BAFF的胞外可溶功能區。
圖4是duck BAFF mRNA在各組織中的表達水平分析圖。β-actin作為內參。
圖5是融合蛋白NusA-His-dsBAFF在BL21(DE3)中的誘導表達，Ni+柱純化的SDS-PAGE鑑定及鼠抗His6-tag的western-blotting鑑定結果，A圖中條帶1是未經IPTG誘導的全菌蛋白，2是經IPTG誘導5小時後的全菌蛋白，3是經Ni+柱純化後目的蛋白；B圖是鼠抗His6-tag的western-blotting鑑定結果，在目的蛋白位置出現了特異性條帶。
圖6是本發明克隆的基因對鴨B淋巴細胞的促存活作用結果示意圖。圖A是說明不同濃度的NusA-His-dsBAFF相對於對照NusA-His、His-TRAIL及PBS在作用鴨B淋巴細胞48小時後，對鴨B淋巴細胞可見顯著的促存活作用，且呈劑量依賴效應；圖B是說明固定濃度的NusA-His-dsBAFF相對於對照NusA-His及PBS分別在作用鴨B淋巴細胞24/48/72小時後的鴨B淋巴細胞存活數量比較情況。
圖7是duck BAFF具有對人及鼠B淋巴細胞的促增殖生物學功能。圖A是說明不同濃度的NusA-His-dsBAFF對人B淋巴細胞的共刺激增殖作用；圖B是說明不同濃度的NusA-His-dsBAFF對鼠B淋巴細胞的共刺激增殖作用；anti-IgM是共刺激因子。
具體實施例方式
在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體的製備實施例和應用實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用到的引物，均在首次出現時標明，其後所用相同引物，均以首次標明的內容相同。
實施例1鴨(Anas Platyrhynchos)，人工飼養。
(1)引物設計應用ClustalX軟體對已克隆出的人、鼠、雞B淋巴細胞刺激因子全長cDNA序列進行同源性比對分析，精心選取出兩段高保守區域用來設計同源克隆的正義寡核苷酸兼併引物du1(5』-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3』(N＝A、T、G、C))與反義寡核苷酸兼併引物du2(5』-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3』(N＝A、T、G、C))，(2)提取總RNA應用RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen公司)按照其操作手冊提取出約0.5克鴨脾臟細胞的總RNA，並通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑑定其質量和純度，紫外分光光度計測定其濃度。
(3)應用RT-PCR方法，以上述du1及du2為特異性引物，擴增出duck BAFF cDNA的一段序列，全長為408bp，命名為P1，克隆入pMD18-T載體，並對其鹼基序列進行測定。RT-PCR的反應條件為以總RNA為模板，在50μl反應體系中，加入5×RT-PCR反應緩衝液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下遊引物各2.5μl、AMV逆轉錄酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，補水至50μl。RT-PCR循環參數為48℃逆轉錄45min，94℃變性2min，再進行40個PCR循環(94℃變性30s，57℃退火1min，68℃延伸2min)，最後於68℃延伸7min。RT-PCR產物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離後，用膠回收試劑盒回收約408bp的DNA條帶，置4℃保存。
(4)應用cDNA末端快速擴增(RACE)方法，採用SMART RACE Kit(Clontech公司)根據已獲得的P1鹼基序列設計正義引物GSP2及反義引物GSP1分別用以擴增出duck BAFFcDNA3』-及5』-全長末端區域，擴增片段分別命名為P2(642bp)及P3(697bp)，分別克隆入pMD18-T載體，對其鹼基序列進行測定。操作按照試劑盒操作手冊要求進行。
(5)如圖1所示，根據P1、P2、P3的重疊區域拼接出duck BAFF cDNA的全長序列，並設計首尾引物FL1及FL2一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，經含Amp抗生素(50mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉化子，挑取出8個陽性克隆送往上海英駿測序公司進行鹼基序列測定，得到如圖2所示的duck BAFF全長cDNA鹼基序列及推測編碼胺基酸序列。
(6)同源檢索將所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列資料庫進行相似性搜索及同源性分析，如圖3所示，發現與已知的雞(GenBank登錄號AF506010)、人(GenBank登錄號AF116456)、鼠(GenBank登錄號AF119383)BAFF胺基酸序列相似性最高(不包括其他種屬BAFF的預測胺基酸序列)，分別是91％、53％、50％，可以確定該序列是鴨B淋巴細胞刺激因子(duBAFF)的全長cDNA。並且其開放閱讀框具有SEQ ID NO.1序列，碥碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
實施例2
duck BAFF基因在各組織的表達水平分析採用實施例1中的提取RNA的方法，分別提取了鴨肝(liver)、腎(kidney)、胸腺(thymus)、腔上囊(bursa)、脾(spleen)、心(heat)及腦(brain)的總RNA，運用半定量RT-PCR法對duck BAFF基因在各組織的表達水平進行了研究，結果如圖4所示，duckBAFF基因主要表達在鴨類免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾臟及胸腺；其中法氏腔上囊表達水平最高，脾臟次之，胸腺最低。試驗中鴨β-actin作為內參，採用的引物為chβ1(5』-ATGGCTCCGGTATGTGCAAGG-3』)和chβ2(5』-AGCTTCTCCTTGATGTCACGC-3』)。RT-PCR體系如實施例1。
可溶性duck RAFF重組載體的構建及其在大腸桿菌中的誘導表達以實施例1得到的duck BAFF全長cDNA為模板，設計引物sdu1(5』-TCAGGACCGCGGGTTCTGCCGTCCACACAGAAG-3』(SacII))及sdu2(5』-ACTGAGCCCGGGTCAGAAGAGTCTGACGGCACCA-3』(SmaI))擴增出duck BAFFcDNA胞外可溶區段(dsBAFF)，引物分別引入酶切位點SacII及SmaI，亞克隆入pET43.1a載體，構建成重組載體pET43.1a-dsBAFF。將此重組載體轉入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，胞漿內可高可溶性表達出目的蛋白NusA-His-dsBAFF，此融合蛋白經促存活與增殖試驗(圖7)，活性檢測證實具有dsBAFF的高活性功能，NusA-His標籤不影響目的蛋白活性。
重組目的蛋白的的Ni+親和純化IPTG誘導含有重組載體pET43.1a-dsBAFF的大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)5小時後，4℃收菌，冰上超聲破碎(工作10s，暫停10s，共99次)表達菌體，4℃，13,000×g，20min離心超聲破碎液後，棄沉澱，留上清過Ni+-NTA柱。簡要過程是3體積BindingBuffer平衡Ni+-NTA柱後，手動上樣含可溶性重組蛋白的上清，6體積Wash Buffer(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗去未結合上Ni+-NTA柱的雜蛋白，最後6體積Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脫目的蛋白，PBS透析除鹽，以SDS-PAGE及毛細管電泳分析純度並以紫外分光光度計檢測蛋白濃度，如圖5(A，條帶3)所示，表達得到的目的蛋白經Ni+柱親和純化得到純度達95％的活性目的蛋白。
western 印跡分析Western-blot中所用一抗為羊抗His6，二抗為辣根過氧化酶標記的鼠抗羊IgG。其簡要步驟是將誘導的產物先行SDS-PAGE，然後以浸入式法將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用記號筆標記蛋白marker各條帶，然而依次經5％脫脂奶粉室溫封閉1h，與抗His6單抗孵育1h，與HRP標記的鼠抗羊IgG孵育1h，每步完成後均嚴格洗膜，最後加TMB避光顯色。結果如圖5(B)所示在目的蛋白位置出現了特異性條帶。
duck BAFF對鴨法氏腔上囊B淋巴細胞促存活作用實驗採用淋巴細胞分離液常規無菌分離鴨法氏腔上囊淋巴細胞(約98％為B淋巴細胞)，用RPMI1640調節細胞密度至5×107個/mL.將B細胞懸液加入96孔培養板，每孔100μl。向每孔內加入不同濃度的NusA-His-dsBAFF/NusA-His6/His-TRAIL，37℃，5％CO2培養72h後每孔加入10μl 5mg/mLMTT，37℃，5％CO2繼續培養5h，加入100μl SDS-HCl溶解沉澱物，37℃過夜，測定各孔OD570值.實驗設三復孔，取其平均值，並計算標準誤差。在體外通過MTT細胞毒試驗檢測duck BAFF對鴨B淋巴細胞的促存活作用，如圖6所示，結果表明本發明克隆得到的duck BAFF對鴨B淋巴細胞具有明顯的促存活效應，與雞、人、鼠BAFF的生物學功能相同，且呈現劑量依賴效應，即當NusA-His-dsBAFF為8μg/ml時duck BAFF的促增殖作用最強。同時，固定濃度的NusA-His-dsBAFF相對於對照NusA-His及PBS分別在作用鴨B淋巴細胞24/48/72小時後，可觀察到72小時時對鴨B淋巴細胞的促存活效應最明顯。
duck BAFF和anti-IgM共刺激人鼠B淋巴細胞增殖採用抗體磁珠無菌分離健康人外周血B淋巴細胞及BALB/c小鼠脾臟B淋巴細胞，在體外通過MTT細胞毒試驗檢測duck BAFF對人外周血B淋巴細胞(抗人IgM預刺激後)的促增殖作用及對小鼠脾臟B淋巴細胞(抗鼠IgM預刺激後)的促增殖作用，方法同上，結果如圖7所示，表明本發明克隆得到的duck BAFF對人及鼠的B淋巴細胞都具有促增殖的生物學功能，且呈現劑量依賴效應，飽和濃度分別為12μg/ml和14μg/ml，進一步證實了BAFF在生物體內生物學功能的保守性。
實施例3將實施例1獲得的鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法，生產重組duckBAFF，作為鴨類免疫增強劑。
實施例4將實施例1獲得的鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法，轉入鴨體內，增加其免疫力，在飼養中應用。
按照本發明的方法可以通過現有基因工程技術，修飾鴨B淋巴細胞刺激因子基因並用於所述研究和生產。
SEQUENCE LISTING110南京師範大學120鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用16022101211867212cDNA213鴨(Anas Platyrhynchos)4001atgaaatccg tggactgtgt gcacgtcatc caacagaagg ataccgcctc ctctccctct 60gccccccctg gtgctgcttc aggcaccacg ggactttttc ctgtcacatt cctgtggctt 120gcaatgctcc tgtcctcttg tcttgcagca gtgtctcttt accatgttct caccctgaaa 180acagagctag aagctctgcg ccacgagctg atctacaggg tccaggcaag gtctccacta 240gagcggcgag ccgtctcccc tgatgacgag aaagcaggtg cccctgtttc ttccttcctg 300caagcctctg cagctggtgc caggcaggag aacgagcttc ctggccctag cccagctgaa 360agtttccaaa aggaaatctc gaacgggagc agaaacaggg ggagaaggtc tgccgtccac 420acagaagaaa cagtgctaca ggcctgcttg caactcatcg ctgacagcaa aagtgatatc 480caacagaaag atgattcaag cattgtccct tggcttctga gctttaaacg tggaacagct 540ctggaagaac atggaaataa aatagtgatc aaagaaacag gatatttttt catatatggc 600caggttttat atacagatac aacatttgct atgggacatc taatacagag gaagaaggcc 660cacgtgtttg gtgatgatct gagcttggtg acattatttc gctgcatcca aaatatgcca 720cagtcttatc cgaataattc ttgctatacc gctggcattg caaaattaga agaaggggac 780gaacttcaac ttacaatacc acgaagacga gccaaaatat ccttggatgg cgatggtact 840ttttttggtg ccgtcagact cttctga 8672102211288212PRT213鴨(Anas Platyrhynchos)4002Met Lys Ser Val Asp Cys Val His Val Ile Gln Gln Lys Asp Thr1 5 10 15Ala Ser Ser Pro Ser Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ser Gly Thr Thr20 25 30Gly Leu Phe Pro Val Thr Phe Leu Trp Leu Ala Met Leu Leu Ser35 40 45Ser Cys Leu Ala Ala Val Ser Leu Tyr His Val Leu Thr Leu Lys50 55 60
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權利要求
1.鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA，其特徵在於，具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.一種權利要求1所述的鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物正義寡核苷酸兼併引物du15』-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3』，反義寡核苷酸兼併引物du25』-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3』，其中N為A、T、G或C；(2)從鴨脾臟提取總RNA，(3)通過RT-PCR方法，以上述引物du1及du2為特異性引物，擴增出一段cDNA序列，命名為P1，克隆入pMD18-T載體，並對其鹼基序列進行測定，(4)應用cDNA末端快速擴增方法，根據已獲得的P1鹼基序列設計正義引物GSP25』-GAAGGCCCACGTGTTTGGTGATGATCTG-3』及反義引物GSP 15』-CAGATCATCACCAAACACGTGGGCCTTC-3』分別用以擴增出上述cDNA 3』-及5』-全長末端區域，擴增片段分別命名為P2及P3，分別克隆入pMD18-T載體，對其鹼基序列進行測定；(5)根據P1、P2、P3的重疊區域拼接出cDNA的全長序列，並設計首尾引物FL15』-GGAGGAAAGAGCAGCGATGAAATCC-3』及FL25』-GGATGGAACAAAATTAAAATGCACT-3』一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，挑取陽性克隆進行鹼基序列測定。
3.一種權利要求1所述的鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA的重組應用，是通過現有基因工程方法，生產重組鴨B淋巴細胞刺激因子，作為鴨類免疫增強劑。
4.鴨B淋巴細胞刺激因子，其特徵在於，具有SEQ ID NO.2所示的序列。
全文摘要
鴨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用，涉及生物基因工程領域。鴨B淋巴細胞刺激因子的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物；從鴨脾臟提取總RNA；通過RT－PCR方法，擴增出一段cDNA，命名為P1，克隆入pMD18－T載體，測序；應用cDNA末端快速擴增方法，根據P1的序列設計正義引物及反義引物分別用以擴增出上述cDNA 3』－及5』－全長末端區域，擴增片段分別命名為P2及P3，分別克隆入pMD18－T載體，並測序；將P1、P2、P3拼接出cDNA全長序列，並設計首尾引物一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18－T載體，挑取陽性克隆進行測序。所述鴨B淋巴細胞刺激因子的cDNA可通過現有基因工程方法，生產重組duck BAFF，作為鴨類免疫增強劑。
文檔編號C12N15/10GK1844390SQ20061003966
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月19日 優先權日2006年4月19日
發明者張雙全, 管政兵 申請人:南京師範大學