抗IgA1抗體的製作方法

2023-05-05 02:42:11

專利名稱：抗IgA1抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別並結合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的絲氨酸蘇氨酸連接型糖鏈；並且涉及產生該抗體的雜交瘤、編碼該抗體的DNA、含有該DNA的載體、對該載體進行轉化而得到的轉化體、使用該雜交瘤或轉化體的抗體或該抗體片段的製造方法、使用該抗體或抗體片段的診斷劑以及含有該抗體或抗體片段作為有效成分的治療劑。
背景技術：
近年來，報導了如下實例伴隨著各種疾病的發病和病情的發展，附加在與該疾病和病情相關的細胞所表達的蛋白質上的糖鏈結構發生變化。該實例中，具有代表性的是在超過80%的人類癌症種類中觀察到表達的、作為O連接型(絲氨酸蘇氨酸型)糖鏈抗原之一的Tn抗原(湯姆森(Thomsen)抗原、CD 175抗原)和在該Tn抗原上附加有涎酸的涎酸化Tn抗原(CD175s抗原)的表達(非專利文獻2)。已知這些糖鏈抗原在正常細胞中幾乎觀察不到表達，並且正在進行將其作為癌特異性疫苗療法的靶分子應用於醫療的研究(非專利文獻I)。這些癌特異性糖鏈抗原的表達通過生物體內存在的構成複雜的糖鏈生物合成途徑和糖鏈代謝途徑的酶活性來進行調控。作為其中一例，已知如下例子在癌細胞中，編碼參與糖鏈生物合成途徑的蛋白質的基因的表達方式發生變化，結果，糖鏈生物合成途徑在中途被阻斷；等。Tn抗原作為正常細胞中的O連接型糖鏈的生物合成途徑的中間產物而已知，其具有在蛋白質胺基酸序列中的特定的絲氨酸(Ser)殘基或蘇氨酸(Thr)殘基的側鏈中存在的羥基上具有α連接的N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)的結構(GalNAc a-Ser/Thr)。利用核心I β 3半乳糖轉移酶(corel β 3Gal_T, T-合成酶)的活性在該Tn抗原的非還原末端側附加一分子半乳糖，由此進行TF抗原(湯姆森-弗裡登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原、CD176抗原)等正常型O連接型糖鏈的生物合成。認為在多種癌細胞系中，細胞內的核心I β 3半乳糖轉移酶的活性降低，結果，糖鏈的生物合成途徑被阻斷，從而表達Tn抗原或涎酸化Tn抗原。癌細胞內核心I β 3半乳糖轉移酶的活性降低的機制較複雜，直到目前也沒有完全弄清楚。但是，作為其機制之一，推測為如下機制編碼核心I β 3半乳糖轉移酶的活性表達所需的特定的伴侶蛋白(Cosmc)的基因發生了突變，結果，細胞內的核心1β3半乳糖轉移酶活性大幅度降低(非專利文獻6)。由於在多個癌症種類中共同地觀察到Tn抗原的表達，因此認為細胞內的糖鏈生物合成途徑和糖鏈代謝途徑中的異常是使附加在該細胞內表達的大量不同糖蛋白質上的糖鏈結構產生共同變化的主要原因。已知糖鏈結構的變化與病情的發展密切相關的代表性的疾病為癌症。此外，除了癌症以外，作為已知糖鏈結構的變化與病情的發展密切相關的疾病，已知有IgA腎病。IgA腎病是以作為免疫球蛋白之一的免疫球蛋白A(IgA)顆粒狀沉積在腎小球的繫膜區的病理 所見為特徵的慢性腎小球腎炎，於1968年由Berger首次報導(非專利文獻2)。該疾病是在日本國內的慢性腎小球腎炎患者中約佔半數的代表性的腎炎。據稱約四成被診斷為IgA腎病的患者在隨後20年以內發展成晚期腎衰竭，因而不得不進行人工透析或腎移植。由此可見，雖然IgA腎病普遍被認為是預後不良的疾病，但在臨床上尚未建立有效性得到證明的治療方法。在IgA腎病的患者體內，已知兩種IgA同種型(IgAl和IgA2)中主要是IgAl沉積於腎臟。此外，作為該沉積的原因之一，有如下報導人IgAl分子中特異性存在的、附加於鉸鏈區的O連接型糖鏈的結構從正常型變成Tn抗原或涎酸化Tn抗原(非專利文獻3、非專利文獻4)。已證明，當附加於IgAl鉸鏈區的O連接型糖鏈缺失半乳糖而變成Tn抗原或涎酸化Tn抗原時，IgAl分子的自身凝集能力亢進，與特異性識別該糖鏈缺陷型IgAl的自身抗體結合而形成免疫複合物，並且，形成凝集體或免疫複合物後的IgAl分子避開通常的循環血液中的清除機制而沉積在腎繫膜區(非專利文獻5)。進而報導了 在從IgA腎病患者分離出的產生IgA的細胞中，因Cosmc的表達量降低而導致核心I β 3半乳糖轉移酶活性降低(非專利文獻6)。即，在IgA腎病患者體內的產生IgA的細胞中，糖鏈生物合成途徑在中途被阻斷，結果，不能產生具有正常型糖鏈的IgAl，取而代之，產生糖鏈缺陷型IgAl。作為IgA腎病的發病機制之一，提出了如下機制包含該糖鏈缺陷型IgAl的複合物沉積在腎小球上，結果引發腎組織的炎症。一般而言，IgA由血液中或組織內的B細胞或由B細胞分化成的漿細胞產生。已知漿細胞是B細胞分化的最終階段，分布於次級淋巴組織、全身的黏膜組織、骨髓等中並產生大量的抗體，而產生IgA的漿細胞主要分布於黏膜組織。另一方面還已知，在次級淋巴組織的生發中心，由獲得高親和性IgA抗體產生能力的B細胞克隆分化出記憶B細胞或漿細胞，並分布於全身的靶器官而長期持續地產生抗體。但尚未明確產生與IgA腎病的發病相關的糖鏈缺陷型IgA的細胞在B細胞分化過程的哪個階段中產生以及產生糖鏈缺陷IgA的B細胞或漿細胞分布於體內的何種組織。已知約半數的IgA腎病患者的血中IgA值升高(非專利文獻7)。而且已知，作為在IgA腎病患者中共同觀察到的現象，在末梢血或尿液等體液以及腎小球中檢測到一般在健康人中觀察不到的糖鏈缺陷型IgAl (非專利文獻8)。如上所述，該糖鏈缺陷型IgAl即半乳糖缺失型IgAl是促進IgA腎病的病情發展的因素，但近年來查明，在除IgA腎病以外的幾種人類疾病例如作為過敏性疾病的過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、作為自身免疫疾病的系統性紅斑狼瘡或作為癌症的IgAl型骨髓瘤的一部分疾病中，該糖鏈缺陷型IgAl的出現和在腎臟的蓄積也導致腎功能的降低(非專利文獻8)。基於上述背景，糖鏈缺陷型IgAl作為以IgA腎病為代表的特定的人類疾病的生物標誌物例如診斷生物標誌物、預測生物標誌物或藥效動力學生物標誌物正逐漸被人們所認識。人IgAl的鉸鏈區很難以IgAl重鏈多肽的胺基酸序列號的形式來嚴格地定義。一般是指構成IgAl分子的重鏈多肽中位於CHl結構域與CH2結構域之間的區域。在構成普通的分泌型人IgAl分子的重鏈多肽(序列號2)中，多指從N末端起第223位的脯氨酸開始至第240位的絲氨酸或第241位的半胱氨酸為止的區域。該區域也稱為IgAl鉸鏈區核心肽。在迄今為止的研究中，已鑑定出該區域中附加有O連接型糖鏈的胺基酸殘基，已知有 第225位的蘇氨酸、第228位的蘇氨酸、第230位的絲氨酸、第232位的絲氨酸、第236位的蘇氨酸共五處。另外，已知N連接型糖鏈不與鉸鏈區結合，而與構成IgAl分子的重鏈多肽中第263位的天冬醯胺和第459位的天冬醯胺結合。作為現行的IgA腎病確診法的腎活檢(活組織檢查)是給患者帶來精神上的痛苦、腎周圍出血的風險以及住院數天所產生的經濟負擔的方法。到目前為止，已研究了幾種以直接檢測糖鏈缺陷型IgAl並進行分析為目的的實驗方法。使用識別並結合Tn型糖鏈或涎酸化Tn型糖鏈的凝集素例如長柔毛野豌豆(Vicia villosa)來源的凝集素、大果瓦泰豆(Vatairea macrocarpa)來源的凝集素、大豆來源的凝集素、散大蝸牛(Helix aspersa)來源的凝集素或樹錦雞兒(Caragana arborescens)來源的凝集素等的ELISA法或蛋白免疫印跡法等免疫學方法是簡易的方法之一(非專利文獻9)，但由於這些凝集素具有僅識別糖鏈結構並與其並結合的性質，因此，存在與人來源試樣等樣品中含有的、IgAl以外的具有O連接型糖鏈的糖蛋白(粘蛋白類、補體Cl抑制物等)也非選擇性地進行結合的問題。另外，使用抗Tn單克隆抗體例如MLS128、22-1-1、HBTnl或Briclll等的ELISA或免疫蛋白印跡等免疫學方法也是簡易的方法之一，但與上述凝集素法同樣地存在特異性低的問題(非專利文獻10)。另一方面，將利用聚糖酶或肽酶等各種酶對從人來源試樣等樣品中純化提取出的IgAl進行處理而得到的糖鏈和糖肽的混合物通過基質輔助雷射解吸電離串聯飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)等進行分析的方法具有特異性和檢測靈敏度較高的優點(非專利文獻11)。但是，該方法需要蛋白質的純化、酶處理、裝置分析的工序，因而難以稱其為簡易，而且存在定量性差的問題。由此可見，尚未獲知能夠特異性地、簡易且定量性地檢測或測定人來源試樣等樣品中含有的糖鏈缺陷IgAl的方法。另外，雖然認為上述產生糖鏈缺陷型IgAl的細胞在其細胞內或細胞表面表達或蓄積糖鏈缺陷型IgAl，但尚未獲知能夠特異 性地且簡易地檢測這種細胞的方法。比企等人的方法(專利文獻I)中，首先，在固定有識別作為正常型O連接型糖鏈的TF抗原(湯姆森-弗裡登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原、⑶176抗原)的植物凝集素木菠蘿凝集素的ELISA板上捕獲正常型IgAl，製作ELISA板。接著，從患者來源的試樣中純化出IgAl，將其用生物素等標記後添加到該ELISA板上，利用與預先捕獲在板上的正常型IgAl的自身凝集反應而使糖鏈缺陷型IgAl結合到板上。該方法的問題在於定量性差。這是因為，尚未明確IgAl鉸鏈區的糖鏈缺陷的程度與自身凝集性的強度之間的相關性，而且不能排除由標記引起的患者來源的IgAl的變性給凝集性帶來的影響。另外，由於需要從試樣中純化出IgAl，因此，不得不說是在簡易性方面也存在問題的方法。成田等人的方法(專利文獻2)無需對患者來源的IgAl進行純化分離，因此是比上述方法更簡易的方法。該方法為如下方法製作固定有鏈球菌來源的IgA結合肽SAP的ELISA板，向該板上添加患者來源的試樣，從而將IgA捕獲到板上；然後，添加識別N-乙醯半乳糖胺的植物凝集素(長柔毛野豌豆B4凝集素；VVL)的標記物，由此檢測糖鏈缺陷型IgAl0但是，VVL除了與絲氨酸/蘇氨酸上α連接的N-乙醯半乳糖胺結合以外，還與N連接型糖鏈中含有的半乳糖的非還原末端上β連接的N-乙醯半乳糖胺結合，因此，該成田等人的方法不是特異性檢測IgAl鉸鏈區的O連接型糖鏈的結構變化的方法。比企等人的另一方法(專利文獻3)為如下方法使患者來源的血清在填充有木菠蘿凝集素瓊脂糖的層析柱上通過而分離出IgAl，然後將該IgAl固定在ELISA板上，接著，向該ELISA板上添加針對具有IgAl鉸鏈區的胺基酸序列的合成肽(PVPSTPPTPSPSTPPTPSPS)的兔來源多克隆抗體，最後，使用標記的抗兔IgG抗體進行檢測。該方法是對患者來源的血清中含有的、完全缺失鉸鏈區的O型糖鏈的IgAl進行檢測的方法，而不是對鉸鏈區具有Tn型糖鏈的糖鏈缺陷型IgAl進行特異性檢測的方法。另外，由於IgAl的純化中使用作為TF抗原特異性凝集素的木菠蘿凝集素，因此，使患者血清中含有的糖鏈缺陷型IgAl的回收不完全。
雖然不是直接檢測糖鏈缺陷型IgAl的方法，但也進行了嘗試利用ELISA法分析患者來源的試樣來診斷IgA腎病的研究。日本專利第4197393號中記載的方法為如下方法製作固定有將具有IgAl鉸鏈區的胺基酸序列的合成肽(PVPSTPPTPSPSTPPTPSPSC)與牛血清白蛋白連接而製成的蛋白質的ELISA板,並向該ELISA板上添加患者來源的試樣。該方法中，通過將與IgAl鉸鏈區特異性結合的自身抗體(IgG型)捕獲到板上並最後添加抗人IgG抗體的標記物，能夠檢測該自身抗體。但是，該方法中，僅能檢測不與鉸鏈區具有Tn型糖鏈的IgAl結合而與完全缺失鉸鏈區的O型糖鏈的IgAl結合的IgG型自身抗體。作為特異性識別IgAl的單克隆抗體，報導了 通過對小鼠進行人IgAl重鏈蛋白質免疫而得到的B3506B4抗體或者通過對小鼠進行人母乳來源的IgAl免疫而得到的3C10抗體等(非專利文獻12)。B3506B4抗體或3C10抗體對正常糖鏈型IgAl也具有親和性。到目前為止，尚未獲 知特異性識別包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl分子的抗體。普遍已知在對人施用非人抗體例如小鼠抗體等時，其作為異物而被識別，由此在人體內誘導出抗小鼠抗體的人抗體(人抗小鼠抗體，Human Anti Mouse Antibody ;HAMA)。已知HAMA與所施用的小鼠抗體反應而引起副作用(非專利文獻13 16)，或者，加快小鼠抗體在體內的消失(非專利文獻17 19)，降低小鼠抗體的治療效果(非專利文獻20、21)。為了解決上述問題，正在嘗試利用基因重組技術由非人抗體製作人嵌合抗體和人源化抗體。人源化抗體與小鼠抗體等非人抗體相比，在對人進行施用的方面具有多個優點。例如，據報導，在使用猴進行的實驗中，與小鼠抗體相比，其免疫原性降低，血中半衰期延長(非專利文獻22、非專利文獻23)。即，人源化抗體與非人抗體相比，對人產生的副作用少，並可以期待其治療效果長期持續。另外，由於人源化抗體利用基因重組技術來製作，因此，能夠製作成多種形式的分子。例如，使用YI亞類作為人抗體的重鏈(以下記為H鏈)恆定區(以下記為C區)(將H鏈C區記為CH)時，能夠製作抗體依賴性細胞毒活性(以下記為ADCC活性)等效應功能高的人源化抗體(非專利文獻24)，並且，可以期待其血中半衰期比小鼠抗體延長(非專利文獻25)。特別是在將細胞表面上表達Tn抗原型IgAl的產生Tn抗原型IgAl的細胞從人體內除去的治療中，為了通過抗體使效應細胞蓄積在靶細胞的附近而對靶細胞進行特異性殺傷，抗體的Fe段(抗體重鏈的鉸鏈區以後的區域)介導的補體依賴性細胞毒活性(以下記為CDC活性)或ADCC活性等細胞毒活性是很重要的。在人的治療中，為了發揮細胞毒活性，優選使用人嵌合抗體、人源化抗體或人源化抗體(非專利文獻26、27)。而且，隨著近來蛋白質工程、基因工程的進步，人源化抗體也可以製作成Fab、Fab』、F(ab』)2、單鏈抗體(以下記為scFv)(非專利文獻28)、二聚體化V區片段(以下記為雙價抗體(Diabody))(非專利文獻29)、二硫鍵穩定的V區片段(以下記為dsFv)(非專利文獻30)、包含⑶R的肽(非專利文獻31)等小分子量的抗體片段，這些抗體片段與完整的抗體分子相比，向靶組織的移行性更優良(非專利文獻32)。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本特開平9-311132號公報
專利文獻2 :日本特開2007-24661號公報專利文獻3 :日本特開平10-111290號公報非專利文獻非專利文獻I Crit Rev Oncog.，6，57(1995)非專利文獻2 J Urol Nephrol.，74，694(1968)非專利文獻3:Clin Exp Immunol. , 100, 470 (1995)非專利文獻4 J Am Soc Neph.，7，955 (1996)非專利文獻5 :Nephrol Dial Transplant. , 17, 50(2002) 非專利文獻6 J Intern Med.，258，467 (2005)非專利文獻7 :日本腎臟學會誌，44(7)，514-523(2002)非專利文獻8 :Seminars in Nephrolog, 28 (I), 78 (2008)非專利文獻9 JBC 282，28256，2007; Kidney Int.，1997，52:509非專利文獻10 Chem Bio Chem, 6, 22292005非專利文獻11 Carbohydrate Research, 339 (13), 2329-2355 (2004)非專利文獻12 Clinical&Experimental Immunology, 79 (I), 35-40 (1990)非專利文獻13 Hum. Pathol.，38，564 (2007)非專利文獻14 Hum. Pathol.，36，886 (2005)非專利文獻15 FEBS Lett.，579，6179 (2005)非專利文獻16 =Cancer Res.，65，7378 (2005)非專利文獻17 Hum. Pathol.，36，886 (2005)非專利文獻 I8 0ncogene, 13, 2328 (2006)非專利文獻19 =Virchows Arch.，448，52 (2006)非專利文獻20 J. Immunol.，135，1530 (1985)非專利文獻21 =Cancer Res.，46，6489 (1986)非專利文獻22 =Cancer Res. , 56, 1118 (1996)非專利文獻23 :Immunol.，85, 668(1995)非專利文獻24 =CancerRes. , 56, 1118 (1996)非專利文獻25 Jmmunol.，85, 668(1995)非專利文獻26 J. Immunol.，144，1382 (1990)非專利文獻27 =Nature, 322, 323 (1988)非專利文獻28 Science, 242, 423(1988)非專利文獻29 =Nature Biotechnol.，15，629 (1997)非專利文獻30 :Molecular Immunol. , 32, 249 (1995)非專利文獻31 J. Biol. Chem.，271，2966 (1996)非專利文獻32 =Cancer Res.，52，3402 (1992)

發明內容
發明所要解決的問題本發明的目的在於提供特異性識別並結合包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl的單克隆抗體或該單克隆抗體的使用方法。需要特異性識別並結合包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl的單克隆抗體或該單克隆抗體的使用方法。用於解決問題的手段本發明涉及下述(1Γ(32)項。(I) 一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別並結合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽(以下稱為IgAl重鏈)的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的絲氨酸/蘇氨酸連接型糖鏈(以下稱為O連接型糖鏈)。(2) 一種單克隆抗體或該抗體片段，其不識別結合有O連接型糖鏈的由IgAl重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區中包含結合有半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區，而識別並結合包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區。(3)如⑴或⑵所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結合半乳糖的O連接型糖鏈為選自α -N-乙醯半乳糖胺-絲氨酸/蘇氨酸(以下稱為Tn抗原)或涎酸化Tn抗原中的至少一種O連接型糖鏈。(4)如(3)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結合半乳糖的O連接型糖鏈為Tn抗原。(5)如(1Γ(4)中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別並結合包含序列號I表示的胺基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區的抗體。(6)如(1Γ(4)中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別並結合包含序列號I表示的胺基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區多肽的抗體，並且，所述鉸鏈區多肽是在選自從該多肽的氨基末端起第3位的蘇氨酸、第6位的蘇氨酸、第8位的絲氨酸、第10位的絲氨酸、第14位的蘇氨酸中的至少一個胺基酸殘基上結合有不具有半乳糖的N-乙醯半乳糖胺的糖肽。(7)如(1) (4)中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是對包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的補體Cl抑制物不顯示交叉反應性的單克隆抗體。(8)如(1Γ(4)中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是在向包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區上結合時與選自單克隆抗體ΚΜ4137、ΚΜ4140、ΚΜ4144中的至少一種單克隆抗體發生競爭反應的單克隆抗體。(9)如(1Γ(4)中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是與選自單克隆抗體中的至少一種單克隆抗體所結合的、存在於包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體。(10)如(1) (9)中任一項所述的單克隆抗體或抗體片段，其中，單克隆抗體是由選自雜交瘤KM4137(FERM BP-11214)、KM4140 (FERM BP-11215)、KM4144 (FERM BP-11216)中的至少一種雜交瘤生產的單克隆抗體。(11)如(1) (9)中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為
基因重組抗體。(12)如(11)所述的基因重組抗體或該抗體片段，其中，基因重組抗體為選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中的抗體。(13)如(1) (12)中任一項所述的抗體片段，其中，抗體片段為選自Fab、Fab』、F(ab』)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(雙價抗體)、二硫鍵穩定的V區(dsFv)和包含CDR的肽中的抗體片段。(14) 一種雜交瘤，其生產(1Γ(9)中任一項所述的單克隆抗體。(15) 一種DNA，其編碼(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段。(16) 一種重組載體，其含有(15)所述的DNA。(17) 一種轉化株，其通過將(16)所述的重組載體導入宿主細胞中而得到。(18) 一種抗體或該抗體片段的製造方法，用於製造(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段，其特徵在於，將(14)所述的雜交瘤或(17)所述的轉化株在培養基中進行培養，在培養物中生成並蓄積(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段，並從該培養物中收集抗體或該抗體片段。 (19) 一種IgAl的免疫學檢測或測定方法，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述方法中，使用(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段。(20) 一種IgAl的檢測試劑，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述檢測試劑中，使用(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段。(21) 一種IgAl相關疾病的診斷劑，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述診斷劑中，使用(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段。(22)如(21)所述的診斷劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。(23)如(21)所述的診斷劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。(24) 一種IgAl相關疾病的治療劑，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述治療劑中，含有(I廣(13)中任一項所述的抗體或抗體片段作為有效成分。(25)如(24)所述的治療劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。(26)如(24)所述的治療劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。(27) 一種IgAl相關疾病的診斷方法，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述診斷方法包括使用(I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段，對具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl進行檢測或測定。(28)如(27)所述的診斷方法，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。(29)如(27)所述的診斷方法，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。(30) (I廣(13)中任一項所述的抗體或該抗體片段在製造IgAl相關疾病的治療劑中的應用，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區。(31)如(30)所述的抗體或該抗體片段的應用，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。(32)如(30)所述的抗體或該抗體片段的應用，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。發明效果根據本發明，能夠提供一種單克隆抗體，其特異性識別並結合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈。另外，根據本發明，能夠提供與包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的、由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區相關的各種疾病的治療劑或診斷劑。


圖I是表示質粒pCR2B8PVH的構建流程的圖。圖2是表示質粒pCRIgA的構建流程的圖。 圖3是表示質粒pCRmlgA的構建流程的圖。圖4是表示質粒pCR2B8PmIgA的構建流程的圖。圖5是表示質粒pKAN932B8PVHmIgA的構建流程的圖。圖6是表示mlgAl-Fc的SDS聚丙烯醯胺電泳的圖。圖7是通過ELISA法對mIgAl_Fc的O連接型糖鏈結構進行分析而得到的圖。縱軸表示樣品波長415nm、參比波長490nm下的平均螢光強度(0D415-0D490)，凡例中的值表示競爭物質濃度(μ g/ml)。圖8是通過ELISA法對建立的單克隆抗體的結合特異性進行分析而得到的圖。縱軸為ELISA的吸光度，表示對欄外示出的各固定化抗原的結合性。圖9是通過競爭ELISA法對建立的單克隆抗體的結合特異性進行分析而得到的圖。上段中,Tn抗原型人IgAl為競爭物質，下段中，人血漿來源的IgAl為競爭物質。縱軸表不吸光度，橫軸表不競爭物質的濃度(μ g/ml)。圖10是通過流式細胞術對建立的單克隆抗體的結合特異性進行分析而得到的圖，上段為確認與表達mlgAl的DG44細胞株結合的圖，下段為確認與表達mlgAl的Lec8細胞株結合的圖。縱軸表不細胞數，橫軸表不突光強度。圖11表示通過使用建立的單克隆抗體而構建的夾心ELISA法對糖鏈缺陷型IgAl進行定量而得到的結果。縱軸表示吸光度，橫軸表示抗原的濃度(μ g/ml)。圖12 表示通過流式細胞術(FCM)測定 KM4137( ^),1^4140(^)和 ΚΜ4144(·)對生物素標記的抗附加有Tn抗原的mlgA鉸鏈肽單克隆抗體KM4137(a)、KM4140 (b)或KM4144(c)與Tn抗原型人IgAl的結合的競爭抑制活性而得到的結果。縱軸表示樣品波長415nm、參比波長490nm下的平均螢光強度(0D415-0D490)，橫軸表示競爭物質濃度(μ g/ml) ο
具體實施例方式本發明涉及一種單克隆抗體，其特異性識別並結合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈。作為免疫球蛋白Al的重鏈基因，只要是編碼免疫球蛋白Al的重鏈的基因則均可，作為一例，可以列舉包含編碼分泌型免疫球蛋白Al重鏈恆定區的胺基酸序列(序列號2)的鹼基序列(序列號3)的基因。另外，在嚴格條件下與包含序列號3表示的鹼基序列的DNA雜交並且編碼具有IgAl重鏈功能的多肽的基因等也包括在本發明的IgAl重鏈基因中。在嚴格條件下雜交的DNA是指以具有序列號3表不的喊基序列的DNA為探針,通過集落雜交法、噬菌斑雜交法、DNA印跡雜交法、DNA微陣列法等而得到的能夠雜交的DNA，具體而言，可以列舉通過如下方法進行鑑定的DNA:使用固定有來源於雜交的集落或噬菌斑的DNA、或者具有該序列的PCR產物或寡聚DNA的過濾器或載玻片，在O. 7 I. O摩爾/升的氯化鈉存在下在65°C下進行雜交，然後，使用O. Γ2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成包括150毫摩爾/升的氯化鈉、15毫摩爾/升的檸檬酸鈉)，在65°C的條件下清洗過濾器或載玻片，由此進行鑑定。雜交可以依據[Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆實驗指南)，第二版(冷泉港實驗室出版社，1989)、Current Protocols inMolecular Biology (最新分子生物學實驗方法)(約翰威立父子出版公司，1987-1997)、DNACloning I: CoreTechniques, A Practical Approach (DNA 克隆 I :核心技術與實用方法)，第二版(牛津大學，1995)]等中記載的方法來進行。作為能夠雜交的DNA，可以列舉與序列號3表不的喊基序列具有至少60%以上的同源性的DNA,優選與序列號3表不的喊基序列具 有80%以上的同源性的DNA，更優選與序列號3表示的鹼基序列具有95%以上的同源性的DNA。編碼真核生物的蛋白質的基因的鹼基序列常常可以觀察到基因的多態性。本發明中使用的IgAl重鏈基因也包括鹼基序列因基因的多態性而稍有突變的基因。作為IgAl重鏈，可以列舉具有序列號2表示的胺基酸序列的多肽；包含在序列號2表示的胺基酸序列中缺失、取代或添加一個以上的胺基酸而成的胺基酸序列且具有IgAl重鏈的功能的多肽；以及包含與序列號2表不的胺基酸序列具有60%以上、優選80%以上、更優選90%以上、最優選95%以上的同源性的胺基酸序列且具有IgAl重鏈的功能的多妝等。具有在序列號2表示的胺基酸序列中缺失、取代或添加一個以上的胺基酸而成的胺基酸序列的多肽可以通過如下方法得到使用[Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第二版(冷泉港實驗室出版社，1989)、Current Protocols in MolecularBiology (約翰威立父子出版公司，1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10,6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79，6409 (1982)、Gene, 34，315 (1985)、Nucleic AcidsResearch, 13，4431 (1985) ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，488 (1985)]等中記載的定點誘變法，在例如編碼具有序列號2表示的胺基酸序列的多肽的DNA中導入定點突變。缺失、取代或添加的胺基酸數沒有特別限定，優選為一個至數十個、例如廣20個的胺基酸，更優選為一個至數個、例如I飛個的胺基酸。在沒有特別說明的情況下，本發明中記載的同源性的數值可以是使用本領域技術人員公知的同源性檢索程序而計算出的數值，對於鹼基序列而言，可以列舉使用BLAST [J. Mol. Biol. ,215,403(1990)]中默認的參數而計算出的數值等，對於胺基酸序列而言，可以列舉使用 BLAST2 [Nucleic AcidsRes. , 25, 3389 (1997) ; GenomeRes. , 7,649(1997) ;http ://www. ncb i. nlm. nih. gov/Education/BLASTinfo/informations, html]中默認的參數而計算出的數值等。作為默認的參數，G(起始空位罰分，Cost to open gap)在鹼基序列的情況下為5,在胺基酸序列的情況下為11 ;_E(空位延伸罰分，Cost to extend gap)在鹼基序列的情況下為2,在胺基酸序列的情況下為I ;_q(核苷酸錯配罰分，Penalty for nucleotidemismatch)為-3 ;-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)為 I ;-e(期望值，expect value)為10 ;_W(字長大小，word size)在鹼基序列的情況下為11個殘基，在胺基酸序列的情況下為3個殘基；-y (非空位延伸下降的閾值，Dropoff (X) for blastextensions in bits)在blastn中為20,在blastn以外的程序中為7 ;-X(空位比對的下降閾值，X dropoff value for gapped alignment in bits)為 15 ;_Z(最終空位比對的下降值，final X dropoff value for gapped alignment in bits)在 blastn 中為 50,在blastn 以外的程序中為 25 (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/html/blastcgihe 1ρ·html)。包含序列號2表示的胺基酸序列的部分序列的多肽可以通過本領域技術人員公知的方法來製作，例如，可以通過使編碼序列號2表示的胺基酸序列的DNA的一部分缺失並對導入有包含上述DNA的表達載體的轉化體進行培養來製作。另外，基於這樣製作的多肽或DNA，通過與上述同樣的方法，可以得到具有在序列號2表示的胺基酸序列的部分序列中 缺失、取代或添加一個以上的胺基酸而成的胺基酸序列的多肽。本發明中，包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的、由IgAl重鏈基因編碼的多肽，只要是包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈則均可，具體而言，可以列舉包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的、由序列號3表示的鹼基序列編碼的IgAl重鏈多肽。作為IgAl的鉸鏈區,具體而言,可以列舉與文獻[Biochemical and BiophysicalResearch Communication]中公開的IgAl重鏈多肽的第223 240位相當的區域等。本發明中，包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的、由IgAl重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區，只要是包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈多肽的鉸鏈區則均可，具體而言，可以列舉在包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的由序列號3表示的鹼基序列編碼的IgAl重鏈多肽中共同含有的、由序列號I表不的胺基酸序列。O連接型糖鏈是指在蛋白質的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的胺基酸殘基中藉助各胺基酸側鏈所含的-OH基而結合有糖鏈的結構。在O連接型糖鏈中，將多肽上的Ser或Thr胺基酸側鏈的-OH基上結合有N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)的O連接型糖鏈稱為粘蛋白型糖鏈。作為O連接型糖鏈的具體例，可以列舉T抗原(TF抗原)、涎酸化T抗原、Tn抗原或涎酸化Tn抗原等(表I)。[表I]
糖鏈抗原名稱糖鏈結構
Tn 抗原GalNAcl α — Ser/Thr
誕酸化 Tn 抗原 NeuNAc α 2 — 6GalNAcl α — Ser/Thr
T 抗原Gal β I — 3GalNAcl α — Ser/Thr
誕酸化 T 抗原 NeuNAc α 2 — 3Gal β I — 3GalNAcl α — Ser/Thr(NeuNAc Ν-乙醯神經氨酸)
本發明中，未結合半乳糖的O連接型糖鏈是指在藉助蛋白質的Ser或Thr的胺基酸殘基的-OH基結合的N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)上未結合半乳糖(Gal)的O連接型糖鏈，具體而言，可以列舉上述的Tn抗原和涎酸化Tn抗原。未結合半乳糖的O連接型糖鏈是正常O連接型糖鏈的合成途徑中的中間體，通常在正常細胞的糖蛋白質中幾乎不存在，而在癌症和腎病等某些特定的疾病中觀察到表達。以下，本發明中，有時將未結合半乳糖的O連接型糖鏈記為異常糖鏈，將結合有異常糖鏈的蛋白質記為糖鏈缺陷型蛋白質，將結合有異常糖鏈的IgAl記為糖鏈缺陷型IgAl。作為O連接型糖鏈所結合的多肽中的胺基酸殘基，可以列舉IgAl重鏈多肽的鉸鏈區的胺基酸序列中的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的胺基酸殘基。另外，對於O連接型糖鏈所結合的多肽中的胺基酸殘基，可以通過使用 Net0Glyc3. I Server (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/)等序列檢索軟體來確認結合O連接型糖鏈的共有序列。或者，可以通過對具有O連接型糖鏈的糖蛋白進行質譜(MS)分析來確定具體的糖鏈結合位點。本發明中，作為IgAl重鏈多肽上的O連接型糖鏈所結合的鉸鏈區多肽中的胺基酸殘基，在IgAl重鏈多肽的鉸鏈區胺基酸序列中任意一個Ser或Thr殘基上均可以結合O連接型糖鏈，優選列舉包含選自人IgAl重鏈多肽的胺基酸序列中第225位的蘇氨酸、第228位的蘇氨酸、第230位的絲氨酸、第232位的絲氨酸、第236位的蘇氨酸中的至少一個胺基酸殘基的糖鏈結合位點。作為每一分子IgAl重鏈多肽的重鏈鉸鏈區上結合的O連接型糖鏈數，只要在至少一個Ser殘基或Thr殘基上結合有O連接型糖鏈即可，O連接型糖鏈數沒有限定。作為獲取表達本發明的包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl(以下記為糖鏈缺陷型IgAl)的細胞的方法，可以通過如下方法製作表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞在O連接型糖鏈合成過程中，向在多肽上的Ser/Thr上結合的N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與尿苷5』 - 二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的細胞株中導入編碼IgAl重鏈的DNA和編碼IgAl輕鏈的DNA，由此製作表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞。另外，也可以通過使涎酶和半乳糖苷酶等糖鏈切割酶對表達包含正常O型糖鏈的IgAl的細胞起作用來製作表達具有未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl的細胞。作為向多肽上的Ser或Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶的具體例，可以列舉β 1，3-半乳糖基轉移酶[The Journal of Biological Chemistry, 277, 178-186(2002)]等。另外，作為與向多肽上的Ser或Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶的活性相關的蛋白質，可以列舉與該酶的蛋白質摺疊相關的伴侶Cosmc[Procedings of the NationalAcademy of Sciences of the UnitedStates of America, 99, 16613-16618(2002)]等。IgA腎病患者來源的IgAl表達細胞，由於編碼向多肽上的Ser/Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與UDP-半乳糖的轉運相關的蛋白質等的DNA上發生了添加、缺失或取代等而使酶的活性降低或缺失，因此，可以作為表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞來利用。作為與UDP-半乳糖的轉運相關的蛋白質，可以列舉UDP-半乳糖轉運蛋白等。作為UDP-半乳糖轉運蛋白的活性降低或缺失的細胞系，可以列舉LecS細胞[Glycobiology. , I, 307-14 (1991)]等。本發明中，作為表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞，可以列舉在人體中內源性存在的細胞、由人體中內源性存在的細胞建立的細胞系或通過基因重組技術得到的細胞等。優選列舉使在如上所述的O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與UDP-半乳糖的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的細胞系、具有相同的性質並且在人體中內源性存在的細胞等。作為在人體中內源性存在的細胞，優選在O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與UDP-半乳糖的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的細胞系，具體而言，可以列舉在IgA腎病患者體內或癌症患者體內表達IgAl重鏈多肽的細胞，例如，可以列舉通過活組織檢查等得到的免疫相關細胞或腫瘤細胞中表達IgAl重鏈多肽的細胞。 作為通過基因重組技術得到的細胞，可以列舉如下細胞製作使O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與UDP-半乳糖的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的宿主細胞，將包含編碼目標多肽的cDNA的表達載體導入宿主細胞中，由此表達糖鏈缺陷型IgAl。作為宿主細胞，具體而言，可以列舉UDP-半乳糖轉運蛋白的活性降低的LecS細胞，或者，因β 1，3-半乳糖基轉移酶或與該酶活性相關的Comsc伴侶蛋白的異常而使酶的活性降低或缺失的IgA腎病患者來源的IgAl表達細胞等。此外，作為製作糖鏈缺陷型IgAl蛋白的方法，可以列舉使用上述的IgAl表達細胞來表達糖鏈缺陷型IgAl蛋白並進行純化的方法等。作為獲取糖鏈缺陷型IgAl蛋白的方法，可以通過以IgAl蛋白與其他物質的融合蛋白的形式進行表達和純化來獲取。作為與IgAl蛋白融合的物質，可以列舉抗體恆定區、抗體Fe段、GST標籤、組氨酸標籤(也稱為His標籤)或Myc標籤等多肽等。該融合蛋白可以通過使用蛋白A、鎳柱、特異性抗體柱等親和層析柱來分離純化。本發明的單克隆抗體或該抗體片段對如上得到的糖鏈缺陷型IgAl細胞或糖鏈缺陷型IgAl具有結合活性。本發明的抗體或該抗體片段與糖鏈缺陷型IgAl蛋白的結合例如可以通過以下方法確認使用公知的免疫學檢測方法、優選螢光細胞染色法等來確認表達特定抗原的細胞與抗特定抗原的抗體的結合性的方法。另外，也可以將公知的免疫學檢測方法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice (單克隆抗體的原則與實踐)，第三版,美國學術出版社(1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual (抗體實驗指南)，冷泉港實驗室(1988)；単夕口 - >抗體実験^ 二二 7 > (單克隆抗體實驗指南)、講談社寸λ r λ V λ V > (1987)]等組合來進行確認。作為本發明的單克隆抗體，可以列舉由雜交瘤生產的抗體、以及由利用包含抗體基因的表達載體進行轉化而得到的轉化體生產的基因重組抗體。雜交瘤例如可以通過如下方法製備製備表達上述糖鏈缺陷型IgAl的細胞等作為抗原，利用經該抗原免疫後的動物誘導出具有抗原特異性的抗體生產細胞，進而，使該抗體生產細胞與骨髓瘤細胞融合。通過對該雜交瘤進行培養或者對動物施用該雜交瘤細胞而使該動物產生癌性腹水並對該培養液或腹水進行分離、純化，可以獲得抗糖鏈缺陷型IgAl抗體。作為進行抗原免疫的動物，只要能夠製作雜交瘤則均可以使用，優選使用小鼠、大鼠、倉鼠、兔等。另外，由如下製作的雜交瘤生產的抗體等也包括在本發明的抗體中從上述動物中獲取具有抗體產生能力的細胞，在體外對該細胞實施免疫，然後與骨髓瘤細胞融合而製作雜交瘤。單克隆抗體是指單一克隆的抗體產生細胞所分泌的抗體,該抗體僅識別一個表位(也稱為抗原決定簇)，並且構成單克隆抗體的胺基酸序列(一級結構)一致。表位可以列舉單克隆抗體所識別並結合的單一胺基酸序列、由胺基酸序列構成的立體結構、結合有糖鏈的胺基酸序列以及由結合有糖鏈的胺基酸序列構成的立體結構等。作為本發明的單克隆抗體的表位，可以列舉糖鏈缺陷型IgAl蛋白的立體結構。作為本發明的單克隆抗體，只要是識別並結合糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區的 單克隆抗體，則可以是任意一種抗體，具體而言，可以列舉單克隆抗體KM4137、KM4138、KM4139、KM4140 和 KM4144 等。更具體而言，可以列舉由雜交瘤KM4137生產的單克隆抗體KM4137、與單克隆抗體KM4137競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4137所結合的存在於糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體。作為本發明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4138生產的單克隆抗體KM4138、與單克隆抗體KM4138競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4138所結合的存在於糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體。作為本發明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4139生產的單克隆抗體KM4139、與單克隆抗體KM4139競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4139所結合的存在於糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體。另外，作為本發明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4140生產的單克隆抗體KM4140、與單克隆抗體KM4140競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4140所結合的存在於糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體。此外，作為本發明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4144生產的單克隆抗體KM4144、與單克隆抗體KM4144競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4144所結合的存在於糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體等。作為與本發明的單克隆抗體發生競爭反應的單克隆抗體，具體而言，可以列舉如上所述對各種單克隆抗體和存在於糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區的表位具有競爭反應的單克隆抗體。與單克隆抗體發生競爭反應是指，以與本發明的單克隆抗體相同或部分相同的表位作為抗原並與該表位結合的抗體。另外，作為與本發明的單克隆抗體所結合的表位進行結合的單克隆抗體，具體可以列舉如上所述與各種單克隆抗體所識別的存在於糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區的表位結合的單克隆抗體。雜交瘤KM4137、KM4140、KM4144於2009年12月18日依照布達佩斯條約保藏於日本獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(305-856，日本茨城縣筑波市東I丁目 I 番地 I 中央第 6)，保藏編號分別為 FERM BP-11214.FERM BP_11215、FERM BP-11216。作為基因重組抗體，包括人嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或該抗體片段等通過基因重組技術製造的抗體。基因重組抗體中，具有抗原結合活性、抗原性低且血中半衰期延長的基因重組抗體優選作為治療劑。人嵌合抗體是指包含非人抗體的重鏈可變區(以下記為VH)和輕鏈可變區(以下記為VL)與人抗體的重鏈恆定區(以下記為CH)和輕鏈恆定區(以下記為CL)的抗體。本發明的人嵌合抗體可以如下進行製造。S卩，由本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl並與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體或者產生特異性識別糖鏈缺陷型IgAl並與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體的雜交瘤獲取編碼VH和VL的cDNA，將它們插入到具有編碼人抗體的CH和CL的基因的動物細胞用表達載體中，構建人嵌合抗體表達載體，將其導入動物細胞中而對抗體進行表達，從而製作人嵌合抗體。作為人嵌合抗體的CH，只要屬於人免疫球蛋白(以下記為hlg)則均可以使用，優選hlgG類的CH,而且可以使用屬於hlgG類的hIgGl、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亞類中的任意一種。另外，作為人嵌合抗體的CL，可以是屬於hlg的任意一種CL，可以使用K類或λ類的CL。 人源化抗體是指將非人抗體的VH和VL的CDR的胺基酸序列移植到人抗體的VH和VL的適當位置而得到的抗體,也稱為人⑶R移植抗體、重構抗體(reshaped antibody)。本發明的人源化抗體可以如下製造構建編碼抗體可變區的cDNA，所述抗體可變區是將由產生本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白並與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體的雜交瘤產生的非人抗體的VH和VL的CDR的胺基酸序列移植到任意的人抗體的VH和VL的框架(以下記為FR)中而形成的抗體可變區(以下記為V區)，將上述cDNA插入到具有編碼人抗體的CH和CL的基因的動物細胞用表達載體中，構建人源化抗體表達載體，並將其導入動物細胞中，由此進行表達，從而製造人源化抗體。人抗體的VH和VL的FR的胺基酸序列只要是人抗體來源的VH和VL的FR的胺基酸序列，則均可以使用。可以使用例如蛋白資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中登記的人抗體的VH和VL的FR的胺基酸序列或者Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, US Dept. Health and Human Services (1991)等中記載的人抗體的 VH 和 VL 的FR的各亞類的共有胺基酸序列等。作為人源化抗體的CH，只要屬於hlg則均可以使用，優選hlgG類的CH，而且可以使用屬於hlgG類的hlgGl、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亞類中的任意一種。另外，作為人源化抗體的CL，只要屬於hlg則可以為任意一種，可以使用K類或λ類的CL。人抗體原本是指人體中內源性存在的抗體，也包括從利用最近的基因工程、細胞工程、發育工程的技術進步製作的人抗體噬菌體文庫和產生人抗體的轉基因動物而得到的抗體等。人體中內源性存在的抗體例如可以如下獲得分離出人末梢血淋巴細胞，使其感染EB病毒等而永生化，並進行克隆，由此可以培養產生該抗體的淋巴細胞，並可以從培養上清中純化出該抗體。人抗體噬菌體文庫是通過將由人B細胞製備的抗體基因插入到噬菌體基因中而使Fab、scFv等抗體片段在噬菌體表面進行表達而得到的文庫。可以以抗體片段對固定有抗原的底物的結合活性為指標，從該文庫中回收在表面表達具有期望的抗原結合活性的抗體片段的噬菌體。該抗體片段還可以進一步通過基因工程方法轉化為包含兩條完整的H鏈和L鏈的人抗體分子。產生人抗體的轉基因動物是指細胞內重組有人抗體基因的動物。具體而言，例如，向小鼠ES細胞中導入人抗體基因，將該ES細胞移植入小鼠的早期胚胎中，然後使其發育，由此可以製作產生人抗體的轉基因小鼠。由產生人抗體的轉基因動物製作人抗體的方法中，通過通常的在人以外的動物中實施的雜交瘤製作方法獲取產生人抗體的雜交瘤，並進行培養，由此，可以在培養上清中產生並蓄積人抗體。在構成上述抗體或抗體片段的胺基酸序列中缺失、添加、取代或插入一個以上的 胺基酸並且具有與上述抗體或其抗體片段相同的活性的抗體或其抗體片段也包括在本發明的抗體或其抗體片段中。缺失、取代、插入和/或添加的胺基酸數為一個以上，其數量沒有特別限定，可以是利用分子克隆第二版、最新分子生物學實驗方法、NucleicAcids Research, 10，6487 (1982)、Proc.Natl.Acad. Sci. , USA, 79，6409 (1982)、Gene,34, 315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. SciUSA, 82，488(1985)等中記載的定點誘變法等公知的技術能夠缺失、取代或添加的程度的數量。例如為一個至數十個，優選為廣20個，更優選為f 10個，進一步優選為I飛個。在上述抗體的胺基酸序列中缺失、取代、插入或添加一個以上的胺基酸殘基表示如下含義。即，意味著在同一序列中的任意且一個或多個胺基酸序列中，存在一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代、插入和/或添加。另外，既存在同時發生缺失、取代、插入和/或添加的情況，也存在被取代、插入或添加的胺基酸殘基為天然型和非天然型中的任意一種的情況。作為天然型胺基酸殘基，可以列舉L-丙氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-穀氨醯胺、L-穀氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸和L-半胱氨酸等。以下示出可相互取代的胺基酸殘基的優選例。同一組中所含的胺基酸殘基可以相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸B組天冬氨酸、穀氨酸、異天冬氨酸、異穀氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C組天冬醯胺、穀氨醯胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸作為本抗體的效應活性，可以列舉ADCC活性、CDC活性、抗體依賴性吞噬活性(antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP)、調理作用等，可以通過各種方法進行調控。作為調控效應活性的方法，可以列舉對結合於抗體的Fe段的糖鏈進行調控的方法、對抗體的Fe段的胺基酸殘基進行胺基酸改變的方法等。作為對結合於抗體的Fe段的糖鏈進行調控的方法，可以列舉通過將IgG抗體的第297位的糖鏈除去而降低ADCC、⑶C活性的方法[MolecularImmunology, 32，1311，(1995)，W02008/030564];使半乳糖與抗體的Fe段的結合減少而降低CDC活性的方法等。
另外，作為對結合於抗體的Fe段的糖鏈進行調控的方法，可以列舉如下方法生產在IgG抗體的Fe段的第297位的天冬醯胺上結合的N連接型糖鏈中包含在糖鏈所結合的基部的N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)上未結合巖藻糖的糖鏈的抗體的方法(US7，214，775、US6, 946, 292);生產包含結合有平分型(bisecting)GlcNAc的糖鏈的抗體的方法[NatureBiotechnology, 17, 176, (1999)];生產具有結合有與非還原末端結合的半乳糖(Gal)的糖鏈的抗體的方法[Hum. Antibod. Hybridomas, 5, 143-151，(1994)];等。作為對抗體的Fe段的胺基酸殘基進行胺基酸改變的方法，可以列舉如下方法通過進行抗體的Fe段的胺基酸改變來調控效應活性的方法(J.B.C.，277,26733-26740, 2002、US6, 737, 056、US7, 297, 775、US2007/0020260,W02005/070963)；以及通過進行抗體的Fe段的各亞類之間的結構域交換來調控效應活性的方法(W02007/011041)等。作為本發明的抗體片段，可以列舉Fab、Fab』、F(ab』)2、scFv、雙價抗體、dsFv等。作為本發明的抗體片段，可以列舉Fab、F(ab』)2、Fab』、scFv、雙價抗體、dsFv和包含⑶R的肽等。Fab是將IgG用蛋白分解酶木瓜蛋白酶進行處理而得到的片段中(在H鏈的第224位的胺基酸殘基處切斷)、N末端側約一半的H鏈與整個L鏈通過二硫鍵結合而成的分子量約為5萬的具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的Fab可以通過將本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體用蛋白分解酶木瓜蛋白酶進行處理而得到。或者，可以通過將編碼該抗體的Fab的DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中並將該載體導入原核生物或真核生物中使其進行表達來製造。F(ab』 )2是將IgG的鉸鏈區的兩個二硫鍵的下部用胃蛋白酶分解而得到的、兩個Fab區在鉸鏈部分結合而構成的、分子量約為10萬的具有抗原結合活性的片段。本發明的F(ab』)2可以通過將本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體用蛋白分解酶胃蛋白酶進行處理而得到。或者，可以通過使下述Fab』以硫醚鍵結合或以二硫鍵結合來製作。Fab』是將上述F(ab』 )2的鉸鏈區的二硫鍵切斷而得到的分子量約為5萬的具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的Fab』可以通過將本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的F(ab』)2用還原劑二硫蘇糖醇進行處理而得到。或者，可以通過將編碼該抗體的Fab』片段的DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中並將該載體導入原核生物或真核生物中使其進行表達來製造。
scFv是使用適當的肽接頭(以下記為P)將一條VH與一條VL連接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，並且是具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的scFv可以通過如下方法製造獲取編碼本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結 合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，並將該表達載體導入原核生物或真核生物中，由此進行表達。雙價抗體為scFv 二聚體化而得到的抗體片段，並且是具有二價抗原結合活性的抗體片段。二價抗原結合活性可以相同，也可以使其中一者具有不同的抗原結合活性。本發明的雙價抗體可以通過如下方法製造獲取本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體，以P的胺基酸序列長度為8個殘基以下的方式構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，並將該表達載體導入原核生物或真核生物中，由此進行表達。dsFv是指使VH和VL中各一個胺基酸殘基取代為半胱氨酸殘基的多肽藉助該半胱氨酸殘基之間的二硫鍵結合而得到的抗體片段。取代為半胱氨酸殘基的胺基酸殘基可以根據Reiter等人公開的方法[Protein Engineering, 7，697 (1994)]基於抗體的立體結構預測來進行選擇。本發明的dsFv可以通過如下方法製造獲取編碼本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，並將該表達載體導入原核生物或真核生物中，由此進行表達。包含⑶R的肽可以包含VH或VL的⑶R中的至少一個區域以上而構成。包含多個CDR的肽可以直接進行結合或者藉助肽接頭而進行結合。本發明的包含CDR的肽可以通過如下方法製造構建編碼本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體的VH和VL的⑶R的DNA，將該DNA插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，並將該表達載體導入原核生物或真核生物中，由此進行表達。另外，包含⑶R的肽也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法來製造。本發明中包括利用化學或基因工程方法在本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體或抗體片段上結合藥劑、蛋白質、放射性同位素等而得到的與抗體的結合物。本發明的結合物通過利用化學方法[抗體工學入門(抗體工程入門)，金光修著，地人書館(1994)]在本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的N末端側或C末端側、抗體或其抗體片段中的適當的取代基或側鏈以及抗體或其抗體片段中的糖鏈等上結合藥劑、蛋白質、放射性同位素等來製造。另外，也可以通過基因工程方法來製造，S卩，使編碼本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體或其抗體片段的DNA與編碼要結合的蛋白質的DNA連接後插入表達載體中，並將該表達載體導入原核生物或真核生物的宿主細胞中。作為藥劑，可以列舉化療劑、抗體藥品、免疫刺激劑、高分子藥劑等。作為蛋白質，可以列舉細胞因子、增殖因子、毒蛋白等。此外，與抗體或該抗體片段結合的藥劑可以為前藥的形式。本發明中的前藥是指利用存在於腫瘤環境中的酶等進行化學修飾而轉變為具有殺傷癌細胞的作用的物質的藥劑。作為化療劑，包括烷化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素、植物來源的生物鹼、拓撲異構酶抑制劑、激素療法製劑、激素拮抗劑、芳香化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉬絡合物衍生物、M期抑制劑、激酶抑制劑等任何的化療劑。作為化療劑，可以列舉阿米福汀(氨磷汀)、順鉬、達卡巴嗪(DTIC)、更生黴素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲黴素、環 磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿黴素)、阿黴素脂質體(多喜)、表柔比星、吉西他濱(健擇)、柔紅黴素、柔紅黴素脂質體(DaunoXome)、丙卡巴肼、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春鹼、長春新鹼、博來黴素、道諾黴素、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬醯胺酶、白消安、卡鉬、奧沙利鉬、奈達鉬、克拉屈濱、喜樹鹼、CPT-IlUO-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、5_氟脫氧尿苷、氟達拉濱、羥基脲、異環磷醯胺、伊達比星、美司那、依立替康、拓撲替康(V )、米託蒽醌、託泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡黴素、密妥坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、鏈脲黴素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內酯、硫鳥嘌呤、塞替派、烏拉莫司汀、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉬、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI571)、厄洛替尼、Flt3抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑(易瑞沙、特羅凱等)、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德黴素、雷帕黴素、安吖啶、全反式維甲酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青黴胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環孢素、雷帕黴素、氫化可的松、蓓薩羅丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、硫唑嘌呤、青黴胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維甲酸、蓓薩羅丁、砷、硼替佐米、別嘌呤醇、吉妥單抗、替伊莫單抗、131託西莫單抗、塔革雷汀、奧唑米星、克拉黴素、瘤可維、異環磷醯胺、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明、甲氨蝶呤、類美登醇(Maytansinoid)及其衍生物等。作為使化療劑與抗體結合的方法，可以列舉通過戊二醛使化療劑與抗體的氨基之間結合的方法、通過水溶性碳二亞胺使化療劑的氨基與抗體的羧基結合的方法等。作為抗體藥品，可以列舉對通過抗體的結合誘導凋亡的抗原、與腫瘤的病態形成相關的抗原或調節免疫功能的抗原、與病變部位的血管新生相關的抗原具有抗性的抗體。作為通過抗體的結合誘導凋亡的抗原，可以列舉分化抗原(Cluster ofdifferentiation,以下記為 CD) 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7. I)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7. 2)、人類白細胞抗原(HLA)II類、EGFR等。作為與腫瘤的病態形成相關的抗原或調節免疫功能的抗原，可以列舉CD4、CD40、CD40 配體、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7 家族分子的配體(CD28、CTLA-4、IC0S、PD-1、BTLA)、0X-40、0X-40 配體、CD137、腫瘤壞死因子(TNF)受體家族分子(DR4、DR5、TNFRU TNFR2)、TNF相關的凋亡誘導配體受體(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κ B受體活化因子配體(RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細胞因子[白細胞介素-I α (以下將白細胞介素記為 IL)、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(TGF) β、TNF α等]、上述細胞因子的受體、趨化因子(SLC、ELC、1-309、TARC, MDC、CTACK等)、上述趨化因子的受體。作為抑制病變部位的血管新生的抗體的抗原，可以列舉血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、成纖維細胞生長因子(FGF)、EGF、血小板源性生長因子(I3DGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促紅細胞生成素(EP0)、TGFi3、IL-8、Ephilin、SDF-l等以及它們的受體。作為免疫刺激劑,可以是作為免疫佐劑已知的天然物,作為具體例，使免疫亢進的 藥劑可以列舉β -I, 3-葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)、α -半乳糖神經醯胺(KRN7000)、菌體粉末(溶鏈菌、BCG)、菌體提取物(雲芝多糖)。作為高分子藥劑，可以列舉聚乙二醇(以下記為PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚環氧乙烷、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯醯胺等。通過使這些高分子藥劑與抗體或抗體片段結合，可以期待發揮如下效果(I)提高對化學性、物理性或生物性的各種因素的穩定性；(2)顯著延長血中半衰期；(3)抑制免疫原性消失並抑制抗體產生；等[才-卜醫薬品，廣川書店(1993)]。例如，作為使PEG與抗體結合的方法，可以列舉與PEG化修飾試劑進行反應的方法等[廣M才-卜醫薬品，廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可以列舉賴氨酸的氨基的修飾劑(日本特開昭61-178926)、天冬氨酸和穀氨酸的羧基的修飾劑(日本特開昭56-23587)、精氨酸的胍基的修飾劑(日本特開平2-117920)等。作為細胞因子或增殖因子，只要是使NK細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞等細胞亢進的細胞因子或增殖因子則均可，可以列舉例如幹擾素(以下記為IFN)-a、INF-β、INF- y、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)等。作為毒蛋白，可以列舉蓖麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，還包括為調節毒性而向蛋白質中引入突變而得到的蛋白毒素。作為放射性同位素，可以列舉:131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At、Rel86、Rel88、Inlll等。放射性同位素可以通過氯胺T法等直接與抗體進行結合。另外，也可以在抗體結合用於螯合放射性同位素的物質。作為螯合劑，可以列舉甲基苯基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。本發明中，可以將本發明中使用的抗體與一種以上的其他藥劑組合來施用，或者也可以與放射線照射組合。作為其他藥劑，可以列舉上述的化療劑、抗體藥品、免疫刺激齊U、細胞因子或增殖因子等。作為放射線照射，包括X射線、Y射線等光子(電磁波)照射；電子束、質子束、重離子束等粒子束照射等。
作為組合施用的方法，可以與本發明中使用的抗體同時施用，或者也可以在施用本發明中使用的抗體前後施用。本發明的檢測方法、定量方法、檢測試劑、定量試劑或診斷劑中，可以列舉將特定的標記物標記到本發明的抗體上來使用的方法。作為標記物，可以列舉通常的免疫學檢測或測定方法中使用的標記物，可以列舉鹼性磷酸酶、過氧化物酶、螢光素酶等酶；吖啶德酯、洛酚鹼等發光物質；異硫氰酸螢光素(FITC)、三甲基羅丹明(RITC)等螢光物質；等。以下，對本發明的抗體的製造方法進行具體說明。I.單克隆抗體的製造方法(I)抗原的製備通過下述中記載的方法，將包含編碼全長或部分長度IgAl重鏈的cDNA的表達載體導入在O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與UDP-半乳糖的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的酵母、昆蟲細胞、動物細胞等中，由此，能夠得到作為抗原的糖鏈缺陷型IgAl蛋白或表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞。另外，也可以使用通過從在細胞膜上或培養液中大量表達糖鏈缺陷型IgAl的各種人來源的培養細胞、人組織等中純化出糖鏈缺陷型IgAl來製備抗原的方法，或者，製備具有糖鏈缺陷型IgAl的部分序列的合成肽並作為抗原使用。此外，可以通過在試管內向使用不具有糖鏈附加能力的大腸桿菌等原核生物進行表達、純化而得到的IgAl蛋白上附加糖鏈來得到糖鏈缺陷型IgAl。另外，同樣地操作，向具有正常的O連接型糖鏈合成過程的酵母、昆蟲細胞、動物細胞等宿主細胞中導入包含編碼全長或部分長度IgAl重鏈的cDNA的表達載體，由此可以獲得表達具有正常O連接型糖鏈的IgAl重鏈的細胞，並可以從該細胞中純化出具有正常O連接型糖鏈的IgAl重鏈蛋白。如上得到的糖鏈缺陷型IgAl蛋白、具有正常O連接型糖鏈的IgAl蛋白或它們的表達細胞可以用於目標抗體的篩選、確認所獲得的抗體對抗原的反應性。作為本發明中使用的多肽，可以通過使用Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第二 版，冷泉港實驗室出版社(1989)或 Current Protocols INMolecularBiology，約翰威立父子出版公司(1987-1997)等中記載的方法等，例如利用以下的方法，使編碼該多肽的DNA在宿主細胞中進行表達來製造。首先，將編碼全長多肽的cDNA插入適當的表達載體的啟動子的下遊，由此製作重組載體。此時若有需要，也可以基於全長cDNA來製備包含編碼多肽的部分的適當長度的DNA片段，並使用該DNA片段來代替上述全長cDNA。接著，將該重組載體導入適合於該表達載體的宿主細胞中，由此可以得到生產多肽的轉化體。作為宿主細胞，只要是大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等具有附加O連接型糖鏈的能力並且能夠表達目的基因的宿主細胞，則均可以使用。作為表達載體，使用能夠在所使用的宿主細胞中進行自主複製或者能夠整合到染色體中並且在能夠轉錄編碼多肽的DNA的位置含有適當的啟動子的表達載體。在使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞的情況下，含有編碼本發明中使用的多肽的DNA而構成的重組載體優選為在原核生物中能夠進行自主複製並且包含啟動子、核糖體結合序列、本發明中使用的DNA和轉錄終止序列的載體。該重組載體可以進一步含有調控啟動子的基因。作為表達載體，可以列舉例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2(均為羅氏診斷公司製造)、pKK233_2 (Pharmacia 公司製造)、pSE280 (Invitrogen 公司製造)、pGEMEX_l (Promega公司製造)、pQE-8 (QIAGEN公司製造)、pKYP10(日本特開昭58-110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984) ] > pLSAl[Agric.Biol. Chem.，53，277 (1989) ]、pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，4306 (1985)]、pBlue scriptll SK(-) (Stratagene 公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERMBP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2 (FERMBP-400)製備，日本特開昭60-221091]、pGKA2 [由大腸杆M IGKA2 (FERM BP-6798)製備，日本特開昭 60-221091]、pTerm2 (US4686191, US4939094,US5160735)、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol.，172,2392(1990)]、pGEX (Pharmacia 公司製造)、pET 系統(Novagen 公司製造)、pME18SFL3 等。作為啟動子，只要是能夠在所使用的宿主細胞中發揮功能的啟動子則均可使用。可以列舉例如trp啟動子(Ptrp)、Iac啟動子、PL啟動子、PR啟動子、T7啟動子等來源於大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。另外，也可以使用兩個Ptrp串聯而成的串聯啟動子、tac啟動子、lac T7啟動子、let I啟動子等經過人為設計改變而得到的啟動子等。另外，作為上述重組載體，優選使用將作為核糖體結合序列的夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子的間隔調節至適當距離(例如6 18個鹼基)而得到的質粒。編碼本發明中使用的多肽的DNA的鹼基序列中，可以對鹼基進行取代，以形成最適於在宿主內表達的密碼子，由此，能夠提高目標多肽的生產率。此外，上述重組載體中的基因的表達不一定需要轉錄終止序列，但優選在緊鄰結構基因的下遊配置轉錄終止序列。作為宿主細胞，可以列舉屬於埃希氏菌屬等的微生物，可以列舉例如大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HBlOI、大腸桿菌No. 49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌DH5a等。作為重組載體的導入方法，只要是向上述宿主細胞中導入DNA的方法則均可以使用，可以列舉例如使用鈣離子的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69，2110 (1972)]、Gene, 17, 107(1982)或 Molecular&General Genetics, 168, 111 (1979)中記載的方法等。在使用動物細胞作為宿主的情況下，作為表達載體，可以列舉例如pcDNAI、pcDM8 (由 7 t ^ '> 公司銷售)、pAGE107[日本特開平 3-22979 ；Cytotechnology, 3,13 3, (1990)], pAS3-3(日本特開平 2-227075)、pCDM8 [Nature, 329，840，(1987)]> pcDNAI/Amp(Invitrogen 公司製造)、pcDNA3. I (Invitrogen 公司製造)、pREP4 (Invitrogen 公司製造)、pAGE103[J.Biochemistry, 101，1307(1987) ]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93[W097/10354]等。作為啟動子，只要是能夠在動物細胞中發揮功能的啟動子則均可以使用，可以列舉例如巨細胞病毒(CMV)的IE (即刻早期)基因的啟動子、SV40的早期啟動子、逆轉錄 病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SR α啟動子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的啟動子和增強子等。另外，也可以將人CMV的IE基因的增強子與啟動子一同使用。
作為宿主細胞，只要是在糖鏈合成途徑中向多肽上的Ser/Thr上結合的N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與尿苷5』-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的細胞系，則均可以使用。具體而言，可以列舉作為Μ)Ρ-半乳糖轉運蛋白缺失的中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)的Lec8突變體[ACSSymp. Ser. 128，214(1980)]。此外，可以使用在與糖鏈合成途徑相關的酶、轉運蛋白的活性未缺失的細胞中使UDP-半乳糖轉運蛋白(別名UDP-半乳糖轉位蛋白，UGALT)或者核心I合酶即糖蛋白-N-乙醯半乳糖胺3-β -半乳糖基轉移酶(C1GALT1，別名核心1_β -3-gal-t，t合酶)或C1GALT1-特異伴侶蛋白Kclgaltlcl，別名核心I β _3_半乳糖基轉移酶-特異分子伴侶(COSMC)，C1GALT2)等酶、轉運蛋白的功能降低或缺失的細胞系。作為與糖鏈合成途徑相關的酶、轉運蛋白的活性未缺失的細胞，可以列舉例如那馬瓦(Namalwa)細胞、作為猴細胞的COS細胞、作為中國倉鼠來源的細胞的CHO細胞、ΗΒΤ5637 (日本特開昭63-299)等。作為降低基因功能的方法，可以列舉反義法、核酶法[Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.，96，1886 (1999)]、同源重組法[Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual (小鼠胚胎操作實驗指南)，第二版,冷泉港實驗室出版社(1994)、Gene Targeting, APractical Approach (基因尋祀實踐探討)，牛津大學出版社旗下的IRL出版社(1993)]、RNA-DNA 寡核苷酸(RDO)法、RNA 幹擾(RNAi)法[Nature, 391，806, (1998)、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95, 15502, (1998)、Nature, 395, 854, (1998)、Proc. Natl. Acad. Sci.USA)，96，5049，(1999)、Cell, 95，1017，(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96，1451，(1999)roc. Natl. Acad. Sci. USA, 95，13959，(1998)、Nature Cell Biol.，2，70，(2000)]、使用逆轉錄病毒的方法、使用轉座子的方法[Nature Genetics, 25, 35, (2000)]等。作為載體的導入方法，只要是向動物細胞中導入DNA的方法則均可以使用，可以列舉例如電穿孔法[Cytotechnology, 3，133 (1990)]、磷酸I丐法(日本特開平2-227075)、脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，7413 (1987)]等。作為基因的表達方法，除了直接表達以外，還可以根據Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版,冷泉港實驗室出版社(1989)中記載的方法等進行分泌生產、融合蛋白表達等。在真核生物來源的細胞中進行表達的情況下，可以得到附加有糖或糖鏈的多肽。將如上得到的轉化體在培養基中進行培養，在培養物中生成並蓄積該多肽，並從該培養物中進行收集，由此可以製造多肽。將該轉化體在培養基中進行培養的方法可以根據宿主的培養中使用的通常的方法來進行。對利用使用誘導性啟動子作為啟動子的重組載體進行轉化後的微生物進行培養時，可以根據需要向培養基中添加誘導物。例如，對利用使用Iac啟動子的重組載體進行轉化後的微生物進行培養時，可以向培養基中添加異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷等，對利用使用trp啟動子的重組載體進行轉化後的微生物進行培養時，可以向培養基中添加吲哚丙烯酸等。
作為用於培養以動物細胞為宿主而得到的轉化體的培養基，可以使用普遍使用的 RPMI 1640 培養基[The Journal of the American MedicalAssociation, 199，519 (1967)]、伊戈爾(Eagle)的 MEM 培養基[Science, 122，501 (1952)]、杜爾貝科改良 MEM 培養基[Virology, 8，396 (1959) ]、199 培養基[Proc. Soc. Exp. Biol.Med.，73，1(1950)]或者向這些培養基中添加FCS等而得到的培養基等。培養通常在pH6 8、3(T40°C、5%C02存在下等條件下進行廣7天。另外，在培養中，可以根據需要向培養基中添加卡那黴素、青黴素等抗生素。如上所述，將包含重組有編碼本發明中使用的多肽的DNA的重組載體的來源於微生物、動物細胞等的轉化體根據通常的培養方法進行培養，生成並蓄積該多肽，並從該培養物進行收集，由此可以製造本發明中使用的多肽。作為基因的表達方法，除了直接表達以夕卜，還可以根據MolecularCloning, Alaboratory Manual,第二版,冷泉 港實驗室出版社(1989)中記載的方法等進行分泌生產、融合蛋白表達等。作為多肽的生產方法，有如下方法在宿主細胞內生產的方法、分泌到宿主細胞外的方法以及在宿主細胞外膜上生產的方法，通過改變使用的宿主細胞或者所生產的多肽的結構，可以選擇適當的方法。在宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產多肽的情況下，通過使用鮑爾森等人的方法[J. Biol. Chem. ,264，17619(1989)]、羅等人的方法[Proc. Natl. Acad.Sci.，USA, 86，8227 (1989)、Genes Develop.，4，1288 (1990)]或者日本特開平 05-336963、W094/23021等中記載的方法，可以使該基因產物分泌到宿主細胞外。另外，還可以根據日本特開平2-227075中記載的方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因等的基因擴增系統來提高生產量。多肽可以以例如如下所述的方式進行分離和純化。多肽在細胞內以溶解狀態進行表達的情況下，培養結束後通過離心分離來回收細胞，懸濁於水性緩衝液中後，利用超聲波破碎機、法式壓濾壺、MANT0N-GULIN勻漿器、臥式砂磨機等將細胞破碎，從而得到無細胞提取液。將該無細胞提取液進行離心分離，從所得到的上清中利用通常的酶的分離純化法得到純化製備品，即，單獨或組合使用溶劑提取法、利用硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑的沉澱法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂的陰離子交換層析法、使用S-S印haroseFF(Pharmacia公司製造)等樹脂的陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂的疏水層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、聚焦層析法、等電點電泳等電泳法等方法。另外，多肽在細胞內形成包涵體而進行表達的情況下，同樣地將細胞回收後進行破碎，並進行離心分離，由此，以沉澱級分的形式回收該多肽的包涵體。利用蛋白變性劑使回收的該多肽的包涵體可溶化。通過對該可溶化液進行稀釋或透析，使該多肽恢復至正常的立體結構，然後，通過與上述同樣的分離純化方法得到多肽的純化製備品。另外,本發明中使用的多肽也可以通過Fmoc法(荷甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法來製造。另外，還可以利用Advanced ChemTech公司、/、° -々> · 二卟-公司、Pharmacia 公司、Protein Technology Instrument 公司、Synthecel 1-Vega 公司、PerSeptive公司、島津製作所等的肽合成儀進行化學合成。(2)動物的免疫和抗體產生細胞的製備
對3 20周齡的小鼠、大鼠或倉鼠進行如上製備的抗原的免疫，收集該動物的脾臟、淋巴結、末梢血中的抗體產生細胞。另外，在免疫原性低因而在上述動物中未觀察到充分的抗體效價升高的情況下，還有使用CD27敲除動物作為被免疫動物的方法。免疫通過將抗原連同適當的佐劑[例如，完全弗氏佐劑(Complete Freund』 sAdjuvant)或氫氧化鋁凝膠和百日咳菌疫苗等]一同施用到動物的皮下、靜脈內或腹腔內來進行。在抗原為部分肽的情況下，與BSA(牛血清白蛋白)或KLH(鑰孔蜮血藍蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體蛋白製成結合物,將其作為免疫原使用。關於抗原的施用，在第一次施用之後，每隔f 2周施用5 10次。每次施用後第3 7天從眼底靜脈叢採血，利用酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實驗室，1988]等考察其血清與抗原的反應。將其血清對免疫所用的抗原顯示出充分的抗體效價的小鼠、大鼠或倉鼠供作脾臟細胞的供給源。 在供於脾臟細胞與骨髓瘤細胞的融合時，在抗原物質的末次施用後第3 7天從免疫後的小鼠、大鼠或倉鼠中摘除脾臟，收集脾臟細胞。將脾臟在MEM培養基(日水製藥公司製造)中細細切碎，用鑷子攪散，並離心分離(1200rpm、5分鐘)，然後，棄去上清，用Tris-氯化銨緩衝液(pH7. 65)處理f 2分鐘以除去紅細胞，並用MEM培養基洗滌3次，從而提供融合用脾臟細胞。(3)骨髓瘤細胞的製備作為骨髓瘤細胞，使用由小鼠得到的確立細胞系。可以使用例如8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠(BALB/c來源)骨髓瘤細胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [CurrentTopicsin Microbiology and Immunology, 18，I (1978)]、P3_NSl/l_Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6，511(1976)]、SP2/0_Ag 14 (SP-2)[Nature, 276, 269(1978)],P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123，1548 (1979)]、P3_X6 3_Ag8 (X63)[Nature, 256，495 (1975)]等。這些細胞系在8-氮雜鳥嘌呤培養基[向在RPMI-1640培養基中添加有穀氨醯胺(I. 5mM)、2_巰基乙醇(5X I(T5M)、慶大黴素(10 μ g/mL)和胎牛血清(FCS)的培養基(以下稱為正常培養基)中進一步添加8-氮雜鳥嘌呤(lSyg/mL)而得到的培養基]中傳代培養，在細胞融合的3 4天之前傳代到正常培養基中，以確保融合當天達到2X IO7個以上的細胞數。(4)細胞融合將上述抗體產生細胞和骨髓瘤細胞用MEM培養基或PBS (磷酸氫二鈉I. 83g、磷酸二氫鉀O. 21g、食鹽7. 65g、蒸餾水I升、pH7. 2)充分洗滌，以使細胞數達到抗體產生細胞骨髓瘤細胞=5 10:1的方式進行混合，離心分離(1200rpm、5分鐘)後，棄去上清，將沉澱的細胞群充分攪散後，在攪拌的同時在37°C下以O. 2 lmL/ΙΟ8個抗體產生細胞的量加入2g聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、2mL MEM和0. 7mL 二甲亞碸的混合溶液，並每隔2分鐘加入r2mL的MEM培養基，重複數次後，加入MEM培養基至總量達到50mL。離心分離(900rpm、5分鐘)後，棄去上清，輕輕地將細胞攪散後，通過用刻度吸管吸入並吹出，輕輕地將細胞懸浮於IOOmL HAT培養基[在正常培養基中添加有次黃嘌呤(10_4摩爾/升)、胸腺嘧啶核苷(1·5Χ10_5摩爾/升)和氨基蝶呤(4Χ10_7摩爾/升)的培養基]中。將該懸浮液以100 μ L/孔分注到96孔培養板中，在5%C02的培養箱中在37°C下培養7 14天。培養後，取一部分培養上清，通過後述的結合分析等選出與包含本發明中使用的多肽的抗原發生反應而不與不含多肽的抗原發生反應的細胞。然後，利用有限稀釋法重複進行兩次克隆[第一次使用HT培養基(從HAT培養基中除去氨基蝶呤而得到的培養基)，第 二次使用正常培養基]，選出穩定地觀察到強抗體效價的細胞作為產生單克隆抗體的雜交瘤株。(5)單克隆抗體的製備對姥鮫烷處理[腹腔內施用O. 5mL的2，6，10，14-四甲基十五碳烷(姥鮫烷)，飼養2周]後的8 10周齡的小鼠或裸鼠以2X106飛XlO7細胞/只的量腹腔內注射(4)中得到的產生抗CD27單克隆抗體的雜交瘤細胞。在1(Γ21天內雜交瘤產生癌性腹水。從該小鼠中收集腹水，離心分離(3000rpm、5分鐘)除去固體成分後，用40 50%的硫酸銨進行鹽析，然後，利用辛酸沉澱法、DEAE-瓊脂糖柱、蛋白A柱或凝膠過濾柱進行純化，收集IgG或IgM級分，作為純化的單克隆抗體。抗體亞類的確定使用亞類分型試劑盒通過酶免疫測定法來進行。蛋白量的定量通過勞裡法和280nm下的吸光度來計算。(6)結合分析作為抗原，使用通過本項(I)中記載的方法將包含編碼本發明中使用的⑶27多肽的cDNA的表達載體導入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等中而得到的基因導入細胞或重組蛋白、或者由人組織得到的純化多肽或部分肽。在抗原為部分肽的情況下，與BSA(牛血清白蛋白)或KLH(鑰孔誠血藍蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體蛋白製成結合物，並使用該結合物。將上述抗原分注到96孔板中並使其固相化，然後，分注被免疫動物血清、產生單克隆抗體的雜交瘤的培養上清或純化抗體作為第一抗體，並使其發生反應。用PBS或PBS-0. 05%吐溫充分洗滌後，分注由生物素、酶、化學發光物質或放射線化合物等標記的抗免疫球蛋白抗體作為第二抗體，並使其發生反應。用PBS-吐溫充分洗滌後，進行與第二抗體的標記物質對應的反應。與識別包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的CD27且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體產生競爭的抗體,可以通過向上述結合分析系統中添加受試抗體並使其反應來獲得。即，篩選出在加入受試抗體時單克隆抗體的結合受到抑制的抗體，由此可以獲得在向糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區上結合時與獲得的單克隆抗體產生競爭的單克隆抗體。另外，與識別糖鏈缺陷型IgAl且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體所識別的表位結合的抗體，可以通過如下方法獲得對在上述結合分析系統中獲得的抗體的表位進行鑑定，製作所鑑定出的表位的部分糖鏈結合肽或者模擬表位的立體結構的糖鏈結合肽等，並進行免疫。2.基因重組抗體的製作作為基因重組抗體的製作例，以下示出人嵌合抗體和人源化抗體的製作方法。(I)基因重組抗體表達用載體的構建基因重組抗體表達用載體是指重組有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動物細胞用表達載體，可以通過將編碼人抗體的CH和CL的DNA分別克隆到動物細胞用表達載體中來進行構建。人抗體的C區可以使用任意的人抗體的CH和CL。可以列舉例如人抗體的Y I亞類的CH和K類的CL等。作為編碼人抗體的CH和CL的DNA，可以使用包含外顯子和內含子的染色體DNA，也可以使用cDNA，優選使用cDNA。作為動物細胞用表達載體，只要是能夠重組並表達編碼人抗體的C區的基因的載體則均可以使用。可以列舉例如pAGE107 [Cytotechnol.，3，133 (1990) ]、pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]、pHSG274[Gene, 27，223 (1984) ]、pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78，1527(1981) ]、pSGlbd2-4[Cytotechnol.,4，173(1990)]、pSElUKlSedl-3[Cytotechnol.，13, 79(1993)〕等。作為動物細胞用表達載體中使用的啟動子和增強子，可以列舉SV40的早期啟動子[J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的 LTR[Biochem. Biophys. Res.Commun.，149，960 (1987)]、免疫球蛋白 H 鏈的啟動子[Cell, 41，479 (1985)]和增強子[Cell, 33，717(1983)]等。基因重組抗體表達用載體可以使用抗體H鏈和L鏈存在於不同載體上的類型或者存在於同一載體上的類型(串聯型)中的任意一種，從基因重組抗體表達載體的構建的容易度、向動物細胞中導入的容易度、抗體H鏈與L鏈在動物細胞內的表達量的平衡均衡等觀點出發，優選串聯型基因重組抗體表達用載體[J. Immunol. Methods, 167，271(1994)]。作為串聯型基因重組抗體表達用載體，可以列舉pKANTEX93[W097/10354]、 pEE18[Hybridoma, 17，559(1998)]等。(2)編碼人以外的動物來源的抗體的V區的cDNA的獲得和胺基酸序列的分析編碼非人抗體的VH和VL的cDNA可以如下獲得。從產生非人抗體的雜交瘤細胞中提取mRNA，併合成cDNA。將合成的cDNA克隆到噬菌體或質粒等載體中，製作cDNA文庫。使用編碼小鼠抗體的C區部分或V區部分的DNA作為探針，從該文庫中分別分離出具有編碼VH或VL的cDNA的重組噬菌體或重組質粒。分別確定重組噬菌體或重組質粒上的目標小鼠抗體的VH或VL的全長鹼基序列，由鹼基序列分別推測出VH或VL的全長胺基酸序列。作為人以外的動物，只要能夠製作小鼠、大鼠、倉鼠、兔等的雜交瘤細胞則均可以使用。作為由雜交瘤細胞製備總RNA的方法，可以列舉異硫氰酸胍三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol. , 154, 3 (1987)]等，另外，作為試劑盒，可以列舉RNAeasy試劑盒(QIAGEN公司製造)等。作為由總RNA製備mRNA的方法,可以列舉固定有寡聚(dT)的纖維素柱法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版(冷泉港實驗室出版社，1989)]等，另外，作為試劑盒，可以列舉01igoTM-dT30〈Super>mRNA純化試劑盒(Takara公司製造)等。作為由雜交瘤細胞製備mRNA的試劑盒,可以列舉FastTrack mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司製造)、QuickPrepm RNA純化試劑盒(Pharmacia公司製造)等。作為cDNA的合成和cDNA文庫的製作方法，可以列舉常規方法[MolecularCloning, A Laboratory Manual,第二版(冷泉港實驗室出版社，1989) ; Current Protocolsin Molecular Biology,副刊1_34]或者使用市售試劑盒例如用於cDNA合成和質粒克隆的SuperScript 質粒系統(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene公司製造)的方法等。在製作cDNA文庫時，用於重組以由雜交瘤細胞提取出的mRNA為模板而合成的cDNA的載體只要是能夠重組該cDNA的載體則均可以使用。可以使用例如ZAPExpress [Strategies, 5, 58(1992)]>pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]>λ ZAPII (Stratagene 公司製造)、λ gtlO> Xgtll [DNA Cloning: A PracticalApproach, I, 49 (1985) ]、λ BlueMid (Clontech 公司製造)、λ ExCell、pT7T318U (Pharmacia公司製造)、pcD2 [Mol. Cell. Biol.，3，280 (1983)]和 pUC18 [Gene, 33，103 (1985)]等。作為用於導入由噬菌體或質粒載體構建的cDNA文庫的大腸桿菌，只要是能夠導入、表達和保持該cDNA文庫的大腸桿菌 則均可以使用。可以使用例如XLl-Blue MRF，[Strategies, 5，81 (1992)]、C600 [Genetics, 39，440(1954)]、Y1088、Y1090[Science, 222，778(1983)]、NM522[J. Mol. Biol.，166，I (1983)]、K802[J. Mol.Biol.，16，118(1966)]和 JM105[Gene, 38，275(1985)]等。作為從cDNA文庫中篩選編碼非人抗體的VH或VL的cDNA克隆的方法，可以通過使用同位素或突光標記的探針的克隆雜交法或曬菌斑雜交法[Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版(冷泉港實驗室出版社，1989)]來進行篩選。另外，也可以製備引物，將由mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，通過聚合酶鏈反應[以下記為PCR法；Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版、冷泉港實驗室出版社(1989) ; CurrentProtocolsin Molecular Biology,副刊 1-34]來製備編碼 VH 或 VL 的 cDNA。將通過上述方法篩選出的cDNA利用適當的限制性酶等進行切割後，克隆到pBluescript SK(-) (Stratagene公司製造)等質粒中，進行通常使用的鹼基序列分析方法例如桑格(Sanger, F.)等人的雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]等的反應，並使用鹼基序列自動分析裝置例如A. L. F. DNA測序儀(Pharmacia公司製造)等進行分析，由此，可以確定該cDNA的鹼基序列。由確定出的鹼基序列分別推測VH和VL的全長胺基酸序列，與已知的抗體的VH和VL 的全長胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services (1991)]進行比較，由此,可以分別確認所獲得的cDNA是否編碼包含分泌信號序列的抗體的VH和VL的完整胺基酸序列。關於包含分泌信號序列的抗體的VH和VL的完整胺基酸序列，通過與已知的抗體的VH和VL的全長胺基酸序列[Sequencesof Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，可以推測出分泌信號序列的長度和N末端胺基酸序列，進而可以獲知它們所屬的亞類。另外，VH和VL的各⑶R的胺基酸序列也通過與已知的抗體的VH和VL的胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and HumanServices (1991)]進行比較來找出。進而，使用VH和VL的完整胺基酸序列，利用任意的資料庫例如對於SWISS-PR0T或PIR-蛋白等利用BLAST法[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]等進行序列同源性檢索，從而可以確認使用的胺基酸序列是否是新的胺基酸序列。(3)人嵌合抗體表達載體的構建將編碼非人抗體的VH或VL的cDNA分別克隆到本項2的(I)中記載的基因重組抗體表達用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上遊，從而可以構建人嵌合抗體表達載體。例如，為了使編碼非人抗體的VH或VL的cDNA的3』末端側與人抗體的CH或CL的5』末端側連接，製作以如下方式設計的VH和VL的cDNA :連接部分的鹼基序列編碼適當的胺基酸並且為適當的限制性酶識別序列。將所製作的VH和VL的cDNA分別克隆到本項2的(I)中記載的人源化抗體表達用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上遊，以使它們以適當的形式進行表達，從而可以構建人嵌合抗體表達載體。另外，也可以使用在兩端具有適當的限制性酶的識別序列的合成DNA，通過PCR法對編碼非人抗體VH或VL的cDNA分別進行擴增，並將它們分別克隆到本項2的(I)中記載的基因重組抗體表達用載體中。(4)編碼人源化抗體的V區的cDNA的構建編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA可以如下構建。首先，分別選擇用於移植非人抗體的VH或VL的CDR的胺基酸序列的人抗體的VH或VL的框架區(以下記為FR)的胺基酸序列。作為選擇的FR的胺基酸序列，只要是人抗體來源的胺基酸序列則均可以使用。可以列舉例如蛋白資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中登記的人抗體的FR的胺基酸序列、人抗體的FR的各亞類的共有胺基酸序列[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, US Dept. Health and Human Services (1991)]等。為了抑制抗體的結合活性的降低，選擇與原來的抗體的VH或VL的FR的胺基酸序列具有儘量高的同源性(至少60%以上)的FR的胺基酸序列。接著，向選擇好的人抗體的VH或VL的FR的胺基酸序列中分別移植原抗體的CDR的胺基酸序列，從而分別設計出人源化抗體的VH或VL的胺基酸序 列。考慮在抗體基因的鹼基序列中出現的密碼子的使用頻率[Sequences of Proteins ofImmunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)],將設計好的胺基酸序列轉變為DNA序列，從而分別設計出編碼人源化抗體的VH或VL的胺基酸序列的DNA序列。基於設計好的DNA序列，合成多條包含約100個鹼基的長度的合成DNA，使用這些合成DNA進行PCR法。這種情況下，從PCR中的反應效率和能夠合成的DNA的長度考慮，優選對於H鏈、L鏈均設計6條合成DNA。另外，通過在位於兩端的合成DNA的5』末端導入適當的限制性酶的識別序列，可以容易地將編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA克隆到本項2的(I)中構建的人源化抗體表達用載體中。PCR反應後,將擴增產物分別克隆到pBluescript SK(-) (Stratagene公司製造)等質粒中，通過本項2的(2)中記載的方法來確定鹼基序列，從而獲得具有編碼期望的人源化抗體的VH或VL的胺基酸序列的DNA序列的質粒。(5)人源化抗體的V區的胺基酸序列的改變已知僅將非人抗體的VH和VL的⑶R移植到人抗體的VH和VL的FR中時，人源化抗體的抗原結合活性與原來的非人抗體相比降低[BI0/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。認為其原因在於，原來的非人抗體的VH和VL中，不僅CDR與抗原結合活性相關，而且FR內的胺基酸殘基也直接或間接地與抗原結合活性相關，因此，通過人源化使非人抗體的FR的胺基酸殘基取代為人抗體的FR的胺基酸殘基時，抗原結合活性降低。為了解決該問題，在人源化抗體中，鑑定出人抗體的VH和VL的FR的胺基酸序列中直接與抗原的結合相關的胺基酸殘基、與CDR的胺基酸殘基相互作用的胺基酸殘基以及維持抗體的立體結構並間接與抗原的結合相關的胺基酸殘基，將這些胺基酸殘基取代為原來的非人抗體的胺基酸殘基，由此使降低的抗原結合活性升高[BI0/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。人源化抗體的製作中，為了解決如何能夠有效地鑑定出這些與抗原結合活性相關的FR的胺基酸殘基的問題，利用X射線晶體分析[J. Mol. Biol.，112，535(1977)]或計算機模擬分析[ProteinEngineering, 7, 1501 (1994)]等進行抗體的立體結構的構建和分析。上述抗體的立體結構的信息給人源化抗體的製作帶來很多有益的信息，而另一方面，尚未建立能夠適用於所有抗體的人源化抗體的製作方法，就現狀而言，需要進行針對各個抗體製作多種改變體並研究它們與抗原結合活性的相關性等各種嘗試。人抗體的VH和VL的FR的胺基酸殘基可以通過使用改變用合成DNA進行本項2的(4)中記載的PCR法來進行改變。對於PCR後的擴增產物，通過本項2的(2)中記載的方法來確定鹼基序列，從而確認已實施了目標改變。(6)人源化抗體表達載體的構建將構建好的編碼基因重組抗體的VH或VL的cDNA分別 克隆到本項2的(I)中記載的基因重組抗體表達用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上遊，從而可以構建人源化抗體表達載體。例如，通過向本項2的(4)和(5)中構建人源化抗體的VH或VL時使用的合成DNA中、位於兩端的合成DNA的5』末端導入適當的限制性酶的識別序列，可以將構建好的VH或VL的cDNA分別克隆到本項2的(I)中記載的人源化抗體表達用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上遊，以使它們以適當的形式進行表達。(7)基因重組抗體的瞬時表達為了有效地評價製作的多種人源化抗體的抗原結合活性，可以使用本項2的(3)和(6)中記載的基因重組抗體表達載體或者對上述載體進行改變後的表達載體，進行基因重組抗體的瞬時表達。作為用於導入表達載體的宿主細胞，只要是能夠表達基因重組抗體的宿主細胞則可以使用任何細胞，從表達量高的觀點出發，一般使用C0S-7細胞(ATCCCRL1651) [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991)]。作為將表達載體導入C0S-7細胞的方法,可以列舉DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res. , CRCpress, 283 (1991)]、脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，7413 (1987)]等。導入表達載體後，培養上清中的基因重組抗體的表達量和抗原結合活性可以通過酶聯免疫吸附法[以下記為ELISA法；Monoclonal Antibodies-Principles andpractice,第三版,美國學術出版社(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)、単夕口 - >抗體実験7 二二 7 >、講談社寸4工 > 於4 7 4、y夕(1987)]等來測定。(8)基因重組抗體的穩定表達通過將本項2的(3)和(6)中記載的基因重組抗體表達載體導入適當的宿主細胞中，可以得到穩定表達基因重組抗體的轉化株。作為將表達載體導入宿主細胞的方法，可以列舉電穿孔法[日本特開平2-257891、Cytotechnology, 3，133(1990)]等。作為用於導入基因重組抗體表達載體的宿主細胞，只要是能夠表達基因重組抗體的宿主細胞則可以使用任何細胞。可以列舉例如小鼠SP2/0-Agl4細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8. 653細胞(ATCC CRL1580)、兩種中國倉鼠卵巢細胞CHO/dhfr-細胞(ATCCCRL9096)和 CH0/DG44 細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics, 12，555 (1986)]、獲得了凝集素抗性的 Lecl3 細胞[Somatic Cell and Molecular genetics, 12，55 (1986)]、a 1,6-巖藻糖轉移酶基因缺失的CHO細胞(W005/35586、W002/31140)、大鼠YB2/3HL.P2. Gil. 16Ag. 20 細胞(ATCC CRL1662)等。除了上述宿主細胞以外，還可以使用與細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關的酶等蛋白質、與在N-糖苷鍵複合型糖鏈的還原末端的N-乙醯葡糖胺的6位上使巖藻糖的I位進行α連接的糖鏈修飾相關的酶等蛋白質或與細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的宿主細胞，優選使用W005/35586、W002/31140等中記載的α I, 6_巖藻糖轉移酶基因缺失的CHO細胞等。導入表達載體後，根據日本特開平2-257891中公開的方法，在含有G418硫酸鹽(以下記為G418，SIGMA公司製造)等藥劑的動物細胞培養用培養基中進行培養，由此可以篩選穩定表達基因重組抗體的轉化株。作為動物細胞培養用培養基，可以使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)、雜交瘤-SFM培養基(Invitrogen公司製造)或者在這些培養基中添加有胎牛血清(以下記為FCS)等各種添加物的培養基等。通過將所得到的轉化株在培養基中進行培養，可以在培養上清中表達並蓄積基因重組抗體。培養上清中的基因重組抗體的表達量和抗原結合活性可以通過ELISA法等來測定。另外，可以根據日本特開平2-257891中公開的方法，利用DHFR擴增系統等，使轉化株的基 因重組抗體的表達量升高。基因重組抗體可以使用蛋白A層析柱從轉化株的培養上清中進行純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學術出版社(1996)；Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]。另外，除此以外,可以使用蛋白純化中通常使用的純化方法。例如，可以將凝膠過濾、離子交換層析和超濾等組合來進行純化。純化後的基因重組抗體的H鏈、L鏈或整個抗體分子的分子量可以通過聚丙烯醯胺凝膠電泳[以下記為SDS-PAGE ；Nature, 227,680(1970)]或蛋白免疫印跡法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學術出版社(1996) ；Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]等來測定。3.本發明的抗體或抗體片段的活性評價 純化後的本發明的抗體或抗體片段的反應特異性可以如下進行評價。將表達正常型糖鏈的細胞和在O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關的蛋白質或與尿苷5』 - 二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的轉運相關的蛋白質等的活性降低或缺失的細胞系作為宿主，可以分別製作表達編碼IgAl重鏈的鹼基序列(3)的IgAl表達細胞。這樣，可以製作出表達具有正常O連接型糖鏈的IgAl的細胞、表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞，並通過ELISA法和螢光抗體法[Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373(1993)]等測定表達各IgAl的細胞系與純化抗體的反應性。另外，通過將膜型IgAl的細胞外結構域以融合蛋白等可溶物的形式分別在上述宿主細胞中進行表達並在適當的條件下進行純化，可以分別製作保持了立體結構的可溶型IgAl蛋白。作為融合蛋白，可以列舉使IgAl蛋白與抗體恆定區(也稱為Fe)、GST標籤、組氨酸標籤(也稱為His標籤)或Myc標籤等其他多肽融合而得到的蛋白。該融合蛋白可以通過使用蛋白A、鎳柱、特異性抗體柱等親和層析柱來進行分離純化。也可以通過利用表面等離子體共振(SPR)的BIAcore 、ELISA法或免疫沉澱法等來測定這些純化的可溶型CD27蛋白與純化抗體的反應性[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學術出版社(1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實驗室(1988)]。
4.使用特異性識別本發明的糖鏈缺陷型IgAl且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體或其抗體片段的疾病診斷方法通過使用本發明的抗體或該抗體片段對糖鏈缺陷型IgAl或表達、蓄積該多肽的細胞進行檢測或定量，可以診斷糖鏈缺陷型IgAl相關疾病。作為與糖鏈缺陷型IgAl蛋白或表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞相關的疾病，只要是在生物體內發現包含糖鏈缺陷型IgAl多肽的蛋白或者表達糖鏈缺陷型IgAl多肽的細胞的疾病則均包括在內。優選為與健康人相比時與糖鏈缺陷型IgAl蛋白或表達糖鏈缺陷型IgAl的細胞相關的疾病的患者的該多肽的表達量增加的疾病。具體而言，可以列舉自身免疫疾病或癌症。作為自身免疫疾病，可以列舉以IgA腎病為主的慢性腎小球腎炎、系統性紅斑狼瘡、過敏性紫癜等。另外，作為癌症，可以列舉來源於漿細胞的癌症，具體而言，可以列舉漿細胞瘤、IgA型骨髓瘤套細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、小淋巴細胞性白血病、伯基特卜)淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、瀰漫性大細胞淋巴瘤、漿細胞瘤等。本發明中，作為糖鏈缺陷型IgAl多肽的檢測或測定對象的生物試樣，只要是組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液、培養液等可能包含該多肽的試樣則沒有特別限定。與糖鏈缺陷型IgAl相關的疾病中，例如，IgA腎病的診斷可以如下進行。對於從多名健康人的體內收集的生物試樣，使用本發明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，利用下述的免疫學方法，進行糖鏈缺陷型IgAl多肽的檢測或測定，從而確認健康人的生物試樣中的該多肽的表達量。對受試者的生物試樣也同樣考察該多肽的表達量，將其表達量與健康人的表達量進行比較。在受試者的該多肽的表達量與健康人相比增加的情況下，可以判斷為IgA腎病或者將來患IgA腎病的可能性高。與糖鏈缺陷型IgAl相關的疾病中，例如癌症的診斷可以如下進行。對於從多名健康人的生物體內收集的生物試樣，使用本發明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，利用下述的免疫學方法，進行糖鏈缺陷型IgAl多肽的檢測或測定，從而確認健康人的生物試樣中的該多肽的表達量。對受試者的生物試樣也同樣考察該多肽的表達量，將其表達量與健康人的表達量進行比較。在受試者的該多肽的表達量與健康人相比增加的情況下，可以判斷癌症為陽性。含有本發明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物的診斷劑中，根據目標的診斷方法，可以含有用於進行抗原抗體反應的試劑、該反應的檢測用試劑。作為用於進行抗原抗 體反應的試劑，可以列舉緩衝劑、鹽等。作為檢測用試劑，可以列舉抗體或該抗體片段、或者它們的衍生物、或者識別它們的衍生物的標記的二次抗體、標記物的底物等通常的免疫學檢測或測定方法中使用的試劑。作為本發明中檢測或測定糖鏈缺陷型IgAl的量的方法，可以列舉任意的公知方法。例如，可以列舉免疫學檢測或測定方法等。免疫學檢測或測定方法是指使用實施過標記的抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量的方法。作為免疫學檢測或測定方法，可以列舉放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescentimmunoassay)、蛋白免疫印跡法和物理化學方法(TIA、LAPIA、PCIA)等。
作為放射免疫測定法(RIA)，例如可以列舉下述方法使本發明的抗體或該抗體片段與抗原或表達抗原的細胞等反應，進而使實施過放射線標記的抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應，然後，利用閃爍計數儀等進行測定。作為酶免疫測定法(EIA或ELISA)，例如可以列舉下述方法使本發明的抗體或該抗體片段與抗原或表達抗原的細胞等反應，進而使實施過標記的抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應，然後，利用吸光光度計來測定發光色素；可以使用例如夾心ELISA法等。作為酶免疫測定法中使用的標記物，可以使用如上所述的任意的公知(石川榮次等編，酶免疫測定法，醫學書院)的酶標記。可以使用例如鹼性磷酸酶標記、過氧化物酶標記、螢光素酶標記、生物素標記等。夾心ELISA法為如下方法將抗體結合在固相上後，使其捕獲要檢測或測定的抗原，並使第二抗體與被捕獲的抗原反應。該ELISA法中，準備兩種識別要檢測或測定的抗原的抗體或抗體片段，其抗原識別部位不同，預先使其中一種抗體或抗體片段吸附到板(例如，96孔板)上，將第二抗體或抗體片段用FITC等螢光物質、過氧化物酶等酶、生物素等預 先進行標記。在吸附有上述抗體的板上，使從生物體內分離出的細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液等進行反應，然後，使標記後的單克隆抗體或抗體片段反應，並進行與標記物質相對應的檢測反應。在利用該方法測定受試樣品中的抗原濃度的情況下，可以由將濃度已知的抗原進行梯度稀釋而製作的標準曲線計算出受試樣品中的抗原濃度。作為夾心ELISA法中使用的抗體，可以使用多克隆抗體、單克隆抗體中的任意一種，也可以使用Fab、Fab』、F(ab』)2等抗體片段。作為夾心ELISA法中使用的兩種抗體的組合，可以是識別不同表位的單克隆抗體或抗體片段的組合，也可以是為多克隆抗體與單克隆抗體或抗體片段的組合。作為突光免疫測定法(FIA)，可以列舉文獻[Monoclonal Antibodies-Principlesand practice,第三版,美國學術出版社(1996);単夕口 - >抗體実験二工 >、講談社
a r λ V AV >7 (1987)]等中記載的方法。作為螢光免疫測定法中使用的標記物，可以使用如上所述的任意的公知(川生明著，螢光抗體法，〃 7卜寸47公司)的螢光標記。例如，可以使用FITC標記、RITC標記等。作為發光免疫測定法(luminescentimmunoassay)，可以使用[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學術出版社(1996);単夕口 - >抗體実験二二 7 >、講談社寸^ > r 7 ^ ^ (1987)]等中記載的方法來進行。作為發光免疫測定法中使用的標記物，可以列舉如上所述的任意的公知[今井一洋編，生物發光和化學發光，廣川書店；臨床檢查42(1998)]的發光體標記。例如，可以使用吖啶鐵酯標記、洛酚鹼標記等。蛋白免疫印跡法為如下方法將抗原或表達抗原的細胞等用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳[Antibodies-A Laboratory Manual (冷泉港實驗室，1988)]使級分分離後,將該凝膠印跡到PVDF膜或硝酸纖維素膜上，使識別抗原的抗體或抗體片段與該膜進行反應，進而使實施過FITC等螢光物質、過氧化物酶等酶標記、生物素標記等的抗小鼠IgG抗體或結合片段進行反應，然後，使該標記可見化，由此來進行確認。以下示出蛋白免疫印跡法的一例。使表達具有序列號2表示的胺基酸序列的多肽的細胞或組織溶解，在還原條件下使每個泳道的蛋白量為O. f 30 μ g，通過SDS-PAGE法進行電泳。將電泳後的蛋白轉印到PVDF膜上，在含有1%BSA的PBS(以下記為BSA-PBS)中在室溫下反應30分鐘，進行封閉操作。在此，使本發明的單克隆抗體進行反應，用含有O. 05%的吐溫-20的PBS(以下記為吐溫-PBS)進行洗滌，並使過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG在室溫下反應2小時。用吐溫-PBS洗滌，使用ECLTM蛋白免疫印跡檢測試劑(Amersham公司製造)等對結合有單克隆抗體的條帶進行檢測，由此，可以檢測出具有序列號2表示的胺基酸序列的多肽。作為蛋白免疫印跡法的檢測中使用的抗體，可以使用能夠與未保持天然型的立體結構的多肽結合的抗體。物理化學方法具體而言可以如下進行使用本發明的抗體或該抗體片段，使作為抗原的結合半乳糖缺失的O型糖鏈的CD27與本發明的抗體或該抗體片段結合，由此形成凝集體，並對該凝集體進行檢測。除此以外，作為物理化學方法，可以列舉毛細管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法等[臨床檢查法提要，金原出版，499 (1998)]。例如，乳膠免疫比濁法中，使用敏化抗體或抗原的粒徑約O. I μ πΓ約I μ m的聚苯 乙烯乳膠等載體，利用對應的抗原或抗體引起抗原抗體反應時，反應液中的散射光增加，透射光減少。將該變化以吸光度或積分球濁度的形式進行檢測，由此可以測定受試樣品中的抗原濃度等。由於本發明的抗體或該抗體片段能夠與糖鏈缺陷型IgAl多肽的重鏈鉸鏈區結合，因此，可以適合用於檢測表達該多肽的細胞。在表達該多肽的細胞的檢測中，可以使用公知的免疫學檢測方法，優選使用免疫沉澱法、免疫細胞染色法和免疫組織染色法等。另外，也可以應用使用FMAT8100HTS系統
八F 才^ f ^公司製造)的螢光抗體染色法等。免疫沉澱法為如下方法使表達該多肽的細胞等與本發明的單克隆抗體或抗體片段反應後，加入對蛋白G-瓊脂糖等免疫球蛋白具有特異性結合能力的載體而使抗原抗體複合物沉澱。或者，也可以通過如下方法來進行。使上述本發明的抗體或該抗體片段固相化於ELISA用96孔板上，然後，利用BSA-PBS進行封閉。在抗體為未純化的狀態例如雜交瘤培養上清等未純化的狀態下，使抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或G等預先固相化於ELISA用96孔板上，用BSA-PBS封閉後，分注雜交瘤培養上清而使其進行結合。棄去BSA-PBS，用PBS充分洗滌後，使表達具有序列號2表示的胺基酸序列的多肽的細胞或組織的溶解液進行反應。用SDS-PAGE用樣品緩衝液從充分洗滌後的板上提取出免疫沉澱物，通過上述蛋白免疫印跡法進行檢測。免疫細胞染色法和免疫組織染色法是指如下的螢光抗體染色法(流式細胞術)將表達抗原的細胞或組織等根據需要用表面活性劑或甲醇等進行處理，以增加抗體的通過性，然後使本發明的抗體進行反應，進而，使實施過FITC等螢光標記、過氧化物酶等酶標記、生物素標記等的抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應，然後，使該標記可見化並利用顯微鏡進行顯微觀察，或者使細胞與螢光標記的抗體反應並利用流式細胞儀進行分析。例如，可以使用文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學術出版社(1996);単夕口 - >抗體実験7 二二 7 >、講談社寸(1987)]等中記載的方法來進行。特別是，由於本發明的抗體或該抗體片段能夠與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區結合，因此，可以優選用於對細胞膜上保持天然型立體結構而表達的CD27進行檢測的流式細胞術的分析。另外，通過使用利用螢光抗體染色法原理的FMAT8100HTS系統(7:/94 K八4t A公司製造)，可以在不對所形成的抗體-抗原複合物與未參與抗體-抗原複合物形成的游離抗體或抗原進行分離的情況下測定抗原量或抗體量。5.使用特異性識別並結合本發明的糖鏈缺陷型IgAl多肽的單克隆抗體或該抗體片段的疾病治療方法本發明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl多肽且與該重鏈鉸鏈區結合的單克隆抗體或其抗體片段可以用於治療與糖鏈缺陷型IgAl多肽相關的疾病。作為與糖鏈缺陷型IgAl多肽相關的疾病，只要是在生物體內發現表達該多肽的細胞的疾病則可以為任何疾病，可以列舉例如IgA腎病或癌症等。
此外，作為疾病，還可以列舉患有IgA腎病並表現腎病症候群的疾病或表現腎衰竭的疾病。作為癌症，可以列舉造血器官起源的腫瘤(也稱為血液癌)或上皮起源的實體癌。作為血液癌，具體而言，可以列舉白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、多發性骨髓瘤等。作為具體的非霍奇金淋巴瘤，可以列舉套細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、小淋巴細胞性白血病、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、瀰漫性大細胞淋巴瘤、漿細胞瘤等。作為實體癌，具體而言，可以列舉乳腺癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌或胰腺癌等。作為本發明的治療劑，可以列舉以本發明的抗體或該抗體片段作為有效成分的癌治療劑。具有ADCC活性或CDC活性等效應活性的癌治療劑或者利用凋亡誘導作用的癌治療劑等也包括在本發明的治療劑內。本發明的抗體或該抗體片段能夠識別在細胞膜上表達的糖鏈缺陷型IgAl多肽，因此，能夠識別生物體內存在的表達糖鏈缺陷型IgAl多肽的細胞。因此，屬於本發明的抗體或該抗體片段且具有效應活性的抗體或該抗體片段能夠在體內和體外殺傷表達糖鏈缺陷型IgAl多肽的細胞。另外，上述本發明的抗體或該抗體片段能夠殺傷生物體內的表達糖鏈缺陷型IgAl多肽的細胞而使其減少，因此，可以作為治療劑特別有效地使用。含有本發明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物的治療劑可以僅含有作為有效成分的該抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，通常優選以與藥理學上可容許的一種以上的載體一同混合併通過製劑學的技術領域中公知的任意方法製造而成的醫藥製劑的形式來提供。施用途徑優選使用治療時最有效的途徑，可以列舉經口施用或者口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌肉內和靜脈內等非經口施用，在抗體或肽製劑的情況下，可以優選列舉靜脈內施用。作為施用形式，可以列舉噴霧劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、膠帶劑等。作為適於經口施用的製劑，可以列舉乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。乳劑和糖漿劑這樣的液體製備物可以使用如下成分作為添加劑來製造水、蔗糖、山梨
醇、果糖等糖類，聚乙二醇、聚丙二醇等二醇類，芝麻油、橄欖油、大豆油等油類，對羥基苯甲酸酯等防腐劑，草莓香料、薄荷等香料類。膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等可以使用如下成分作為添加劑來製造乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑，澱粉、海藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等粘結劑、脂肪酸酯等表面活性劑、甘油等增塑劑等。作為適於非經口施用的製劑，可以列舉注射劑、栓劑、噴霧劑等。注射劑使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液或者兩者的混合物的載體等來製備。栓劑使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來製備。另外，噴霧劑使用該抗體或抗體片段本身以及不刺激接受者的口腔和氣管黏膜並且使該抗體或抗體片段分散為微細粒子而容易吸收的載體等來製備。作為載體，具體可以例示例如乳糖、甘油等。根據該抗體或抗體片段和使用的載體的性質，可以為氣溶膠、乾粉等製劑。另外，也可以向這些非經口劑中添加在經口劑中作為添加劑而例示的成分。施用量或施用次數根據目標治療效果、施用方法、治療時間、年齡、體重等而不同，通常成人每天為10 μ g/kg、mg/kg。 以下，通過實施例更具體地對本發明進行說明，但本發明不受下述實施例的限定。實施例I在細胞膜上高表達糖鏈缺陷型IgAl的CHO細胞株的製作(I)膜型 IgA 表達質粒 pKAN932B8PVHmIgA 的構建按照以下順序製作用於在細胞膜上表達膜型免疫球蛋白A的載體pKAN932B8PVHmIgA。本質粒是記載在專利W003/085107中的表達使抗CD20抗體2B8P的重鏈Fab部分與膜型免疫球蛋白的恆定區連接而成的蛋白質的質粒載體。I. pCR2B8PVH 的製作以專利W003/085107中記載的質粒載體pKANTEX932B8P為模板，通過以下所示的PCR反應對包含抗⑶20抗體2B8P的重鏈可變區的基因片段進行擴增。在含有O. 2毫摩爾/升dNTPs、l毫摩爾/升氯化鎂的反應液中使用Ing的pKANTEX932B8P、l微摩爾/升RitNotNheIfw (序列號4)、I微摩爾/升RitNotNheIrv (序列號5)和2. 5單位的KOD聚合酶(東洋紡公司製造)，調節至總計50 μ L，進行PCR反應。反應條件為以98°C下15秒、65°C下2秒、74°C下30秒為I次循環，進行25次循環。將該反應液利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，然後，使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒(4 > '卜口夕工 >公司製造)，依照附帶的使用說明書將約450bp的PCR產物導入pCR-Blunt載體中，從而獲得具有序列號6所示的DNA序列的pCR2B8PVH(圖I)。2. pCRIgA 的製作接著，以作為人源cDNA克隆FLJ46724登記在基因庫(Genebank)中的質粒(由NEDO人類cDNA測序項目分售)為模板，使用以下所示的PCR對包含免疫球蛋白A的恆定區的DNA片段進行擴增。在含有O. 2毫摩爾/升dNTPs、l毫摩爾/升氯化鎂的反應液中使用Ing包含FLJ46724的質粒、I微摩爾/升Ig-a_NheI (序列號7)、1微摩爾/升Ig-b-BamHI (序列號8)和2. 5單位的KOD聚合酶(東洋紡公司製造)，調節至總計50 μ L，進行PCR反應。反應條件為以98°C下15秒、68°C下30秒為I次循環，進行25次循環。將該反應液利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，然後，使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒( >
卜口夕工 >公司製造)，依照附帶的使用說明書將約IOOObp的PCR產物導入pCR-Blunt載體中，從而獲得具有序列號9所不的DNA序列的pCRIgA (圖2)。
3. pCRmlgA 的製作接著，在含有O. 2毫 摩爾/升dNTPs、l毫摩爾/升氯化鎂的反應液中使用O. 02微摩爾/升的AMD-A(序列號10)、0. 02微摩爾/升的AMD-B (序列號11)、I微摩爾/升的AMDBamHIfw (序列號12)、I微摩爾/升的AMDSpeIrv (序列號13)和2. 5單位的KOD聚合酶(東洋紡公司製造)，調節至總計50 μ L，進行PCR反應。反應條件為以98°C下15秒、65°C下2秒、74°C下30秒為I次循環，進行25次循環。將該反應液利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，然後，使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒(4 > '卜口夕工 >公司製造)，依照附帶的使用說明書將約450bp的PCR產物導入pCR-Blunt載體中，從而獲得具有序列號14所示的DNA序列的pCRmIgA(圖3)。4. pCR 2B8P mlgA 的製作使將上述I項中製作的pCR2B8PVH用限制性酶NotI和限制性酶NheI消化而得到的約450bp的DNA片段和將上述2項中製作的pCRIgA用限制性酶NheI和限制性酶BamHI消化而得到的約IOOObp的DNA片段與將上述3項中製作的pCRmlgA用限制性酶NotI和限制性酶BamHI消化而得到的約3. 5Kbp的質粒DNA連接，由此，構建編碼抗⑶20抗體2B8P的重鏈可變區與膜型免疫球蛋白的重鏈恆定區連接而成的DNA的質粒pCR 2B8P mlgA(圖4)。將本質粒所編碼的膜型IgAl序列(重鏈)示於序列號15。5. pKAN932B8PVHmIgA 的構建使將上述4項中製作的pCR 2B8P mlgA用限制性酶NotI和限制性酶SpeI消化而得到的1580bp的DNA片段和將KANTEX932B8P用限制性酶EcoRI和限制性酶NotI消化而得到的2845bp的DNA片段與同樣將pKANTEX932B8P用限制性酶EcoRI和限制性酶SpeI消化而得到的約13. 5Kbp的DNA片段連接，由此，製作表達抗⑶20抗體2B8P的恆定區為膜型免疫球蛋白A的蛋白的質粒pKAN932B8PVHmIgA(圖5)。將使用該表達載體轉化的大腸桿菌接種到IOOmL的LB培養基中，培養過夜後，回收菌體，使用Qiafilter質粒中量純化試劑盒(Qiafilter Plasmid midi kit) ( ^ 7 ^ >公司製造)，依照附帶的規程對質粒進行純化。純化後，將30μ g的質粒載體用限制性酶AatII進行消化，由此進行線性化。線性化之後，進行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉澱，溶解於1/10濃度的TE緩衝液(ImM TrisHCl, O. ImM EDTA)後，測定濃度，並供於基因導入。(2)膜型免疫球蛋白A表達質粒pKAN932B8PVHmIgA的導入將pKAN932B8PVHmIgA基因導入作為主要表達Tn型糖鏈的突變CHO細胞的Lec8細胞和主要表達正常型糖鏈的CH0/DG44細胞中，由此，建立表達膜型免疫球蛋白A的Lec8細胞和DG44細胞。膜型免疫球蛋白A表達質粒pKAN932B8PVHmIgA向CH0/DG44細胞(以下記為DG44)或Lec8細胞中的導入可以依據電穿孔法[寸4卜f7 口夕-，3，133(1990)]按照以下順序進行。首先，將在基本培養基[添加有10%胎牛透析血清(4 > if卜口 - 工>公司)、50μ g/mL慶大黴素(於力9 4 f 7夕公司)和IXHT添加劑(4 >匕' 卜口 -夕工>公司製造)的伊思考夫改良的杜爾貝科培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(4 卜口 — 二 >公司)]中傳代的DG44細胞懸浮於K-PBS緩衝液[137毫摩爾/升KCl >2. 7暈摩爾/升NaCl、8. I暈摩爾/升Na2HPO4^ I. 5暈摩爾/升KH2PO4^4. O暈摩爾/升MgCl2]中，使其達到8 X IO6個/mL，製備細胞懸浮液。將200 μ L (I. 8 X IO6個)製備好的細胞懸浮液與10 μ g上述(I)中製備的線性化質粒pKAN932B8PVHmIgA混合。但是，Lec8細胞的傳代在未添加I XHT添加劑的基本培養基(以下記為HT-培養基)中進行。將該細胞DNA混合液轉移到Gene Pulser的電擊杯(電極之間的距離為2mm) (BIO-RAD公司)中，然後，使用基因導入裝置Gene Pulser(BIO-RAD公司)，在脈衝電壓為O. 35KV、電容為250 μ F的條件下進行基因導入。將該細胞懸浮液混合到30mL的HT-培養基[添加有10%胎牛透析血清(4 >匕' 卜口 -夕工 >公司製造)和5O μ g/mL慶大黴素(f力9 4 f 7夕公司)的伊思考夫改良的杜爾貝科培養基^ ^卜口 - ^工 >公司製造)]中，以100 μ L/孔接種到3塊96孔板上。接種2天後，更換為含有500 μ g/mL G418的傳代用培養基，培養10天。10天後，更換為含有50nM MTX (Sigma aldrich公司製造)的HT-培養基，獲得MTX抗性株。將Lec8株來源的膜型免疫球蛋白表達株命名為mIgA/Lec8，另一方面，將DG44細胞來源的膜型免疫球蛋白A表達細胞命名為mIgA/DG44。實施例2糖鏈缺陷型IgAl-Fc融合蛋白的製備為了獲得可溶性mlgAl蛋白，設計了使mlgAl細胞外區部分與人IgG4Fc連接而成的Fe融合蛋白mlgAl-Fc。具體而言,利用PCR法製作使mlgAl細胞外區的一部分與人IgG4Fc連接而成的基因片段，將其插入實施例I中得到的pKAN932B8PVHmIgA中，由此，製備Fe融合mlgAl表達載體pKANTEX-mlgAl-Fc。將該表達載體導入CH0/DG44細胞株和Lec8細胞株中，向培養基中添加500μ g/mL的G418，由此篩選基因導入細胞。將篩選出的基因導入細胞在無血清培養基Excell-302 (SAFC公司)中培養一周，得到含有mlgAl-Fc的培養上清。使用Mabselect (GE Healthcare公司)柱,依照附帶的說明書從約I升的培養上清中進行純化，獲得各自約為5mg的DG44來源mlgAl-Fc和Lec8來源mlgAl-Fc。將所得到的各mlgAl-Fc供於SDS-PAGE分析，考察分子量和純化度(圖6)。另外，為了確認純化蛋白的修飾糖鏈，實施以下的酶免疫測定法。向96孔的EIA用板(Greiner公司)中以50 μ L/孔分注I μ g/mL的DG44來源的mlgAl-Fc或Lec8來源的mlgAl-Fc或者人IgG4(SIGMA公司)，在4°C下放置過夜使其進行吸附。洗滌後，以100 μ L/孔加入1%BSA-PBS，在室溫下反應I小時，對殘餘的活性基團進行封閉。棄去1%BSA-PBS，以50 μ L/孔分注用PBS稀釋的小鼠抗人IgAl單克隆抗體Β3506Β4 (Beckman Coulter公司)或小鼠抗Tn抗原抗體22_1_1 (MBL公司)作為一次抗體，使其反應2小時。用O. 05%吐溫-PBS洗滌後，以50 μ L/孔加入稀釋後的過氧化物酶標記抗小鼠免疫球蛋白(DAK0公司)作為二次抗體，在室溫下反應I小時，用O. 05%吐溫-PBS洗滌後，使用ABTS [2. 2-連氮基雙(3-乙基苯並噻唑_6_磺酸)銨]底物液[I毫摩爾/升ABTS、0· I摩爾/升檸檬酸緩衝液(ρΗ4· 2)、0· 1%_進行顯色，使用酶標儀(MULTISKAN SPECTRUM, Thermo公司)測定樣品波長415nm、參比波長490nm下的吸光度(0D415-0D490)。結果，確認到抗IgAl抗體與DG44來源的mlgAl-Fc和Lec8來源的mlgAl-Fc結合,而另一方面,確認到抗Tn抗原抗體僅與Lec8來源mlgAl-Fc結合(圖7)。由以上確認，Lec8來源的mlgAl-Fc具有Tn抗原型O連接型糖鏈。實施例3抗Tn抗原附加型IgAl的鉸鏈區的單克隆抗體的製作(I)作為免疫原的糖肽的製備
使用自動合成計(島津製作所)，合成如下的肽(Tn附加型IgAl鉸鏈肽，序列號16):在人IgAl (IgAl)鉸鏈區胺基酸序列(從氨基末端數第223位至第240位的胺基酸)的第230位和第232位的絲氨酸(Ser)以及第225位、第228位和第236位的蘇氨酸(Thr)上通過α連接附加有N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)，進而為了與載體蛋白結合而在氨基末端附加有半胱氨酸(Cys)。為了提高免疫原性，通過以下的方法製作與KLH(和光純藥公司)的結合物，作為免疫原。即，將KLH溶解於PBS中並調節至10mg/mL，滴加1/10體積的25mg/mL的MBS [N-馬來醯亞胺基苯甲酸琥珀醯亞胺酯](於力^ ^ >夕公司)，攪拌30分鐘使其反應。利用預先用PBS平衡化的七7 7 r'y G-25柱等凝膠過濾柱除去游離的MBS，將2. 5mg所得到的KLH-MBS與溶解在O. IM磷酸鈉緩衝液(pH7. O)中的Img肽混合，在室溫下攪拌3小時使其反應。反應後，將用PBS透析而得到的物質作為免疫原。(2)動物的免疫和抗體產生細胞的製備將100 μ g通過⑴所示的方法製備的Tn抗原附加型IgAl鉸鏈肽-KLH結合物連同2mg鋁凝膠和I X IO9個細胞的百日咳疫苗(千葉縣血清研究所製造)一起施用給4周
齡的雌性SD大鼠(日本工^ ^ V -公司)，從2周後開始每周施用一次IOOyg的結合物，共計4次。從尾靜脈採血，通過以下所示的酶免疫測定法考察對來源於人血漿的Tn抗原附加IgAl的反應性，在末次免疫3天後從顯示充分抗體效價的大鼠中摘除脾臟。將脾臟在MEM培養基(日水製藥公司)中細細切碎，用鑷子攪散，離心分離(1200rpm，5分鐘)後，棄去上清，用Tris-氯化銨緩衝液(pH7. 65)處理廣2分鐘以除去紅細胞，用MEM培養基洗滌3次，用於細胞融合。(3)酶免疫測定法使用人血漿來源IgAl (BI0PUR公司)作為分析用的陰性對照抗原，使用Tn抗原型人IgAl作為陽性對照抗原。Tn抗原型人IgAl通過如下方法得到使5U/mL的β -半乳糖苷酶(ProZyme公司，GKX-5013)、lU/mL的神經氨酸酶(於力7 4公司，24229-61)在37°C下與人血漿來源IgAl作用過夜，將正常糖鏈轉換為Tn抗原。另外，為了排除僅識別Tn抗原的抗體，與IgAl同樣地對人血漿來源的Cl抑制物蛋白(ZLB - 7，商品名夂V於-卜)進行酶處理，將所得到的Tn抗原型Cl抑制物也作為陰性對照抗原使用。向96孔的EIA用板(々'' 9 4 f -公司)中以50 μ L/孔分別分注2. 5 μ g/mL的各抗原，在4°C下放置過夜使其進行吸附。洗滌後，以100 μ L/孔加入1%BSA-PBS，在室溫下使其反應I小時，對殘餘的活性基團進行封閉。棄去1%BSA-PBS，以50 μ L/孔分注雜交瘤的培養上清或被免疫大鼠抗血清作為一次抗體，使其反應2小時。用O. 05%吐溫-PBS洗滌後，以50 μ L/孔加入稀釋後的過氧化物酶標記抗大鼠免疫球蛋白(夕' -公司)作為二次抗體，在室溫下使其反應I小時，用O. 05%吐溫-PBS洗滌後，使用ABTS[2. 2-連氮基雙(3-乙基苯並噻唑_6_磺酸)銨]底物液[I毫摩爾/升ABTS、0· I摩爾/升檸檬酸緩衝液(ρΗ4· 2)、0· 1%_進行顯色，使用酶標儀(Emax ；Molecular Devices公司)測定樣品波長415nm、參比波長490nm下的吸光度(0D415-0D490)。(4)小鼠骨髓瘤細胞的製備將8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤細胞系P3-U1在正常培養基中進行培養，確保細胞融合時達到2 X IO7以上的細胞，作為親本株供於細胞融合。(5)雜交瘤的製作將⑵中得到的大鼠脾細胞與⑷中得到的骨髓瘤細胞以10:1的比例進行混合，離心分離(1200rpm、5分鐘)後，棄去上清，將沉澱的細胞群充分攪散，然後，在攪拌的同時在37°C下以每IO8個小鼠脾細胞為O. 5mL的量加入Ig聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、ImL MEM培養基和O. 35mL 二甲亞碸的混合溶液，並每隔f 2分鐘向該懸浮液中加入ImLMEM培養基，重複數次後，加入MEM培養基至總量達到50mL。離心分離(900rpm、5分鐘)後，棄去上清，輕輕地將細胞攪散後，通過用刻度吸管吸入並吹出，輕輕地將細胞懸浮於IOOmL HAT培養基[在添加有10%胎牛血清的RPMI培養基中加入HAT培養基添加劑(Invitrogen公司)而得到的培養基]中。將該懸浮液以200 μ L/孔分注到96孔培養用板中，在5%C02的培養箱中在37°C下培養1(Γ14天。通過(3)中記載的酶免疫測定法對該培養上清進行考察，選出與Tn抗原型人IgAl特異性反應的孔，重複克隆兩次，從而建立生產抗Tn抗原附加mlgA鉸鏈肽單克隆抗體的雜交瘤株KM4137、4138、4139、4140、4144。通過使用亞類特異性的二次抗體的酶免疫測定法對抗體類別進行考察，確定KM4137、KM4138、KM4139、KM4144為大鼠IgG2a，KM4140為大鼠IgG2b。它們的抗體類別示於表2中。[表2]
權利要求
1.一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別並結合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽(以下稱為IgAl重鏈)的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的絲氨酸/蘇氨酸連接型糖鏈(以下稱為O連接型糖鏈)。
2.一種單克隆抗體或該抗體片段，其不識別結合有O連接型糖鏈的由IgAl重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區中包含結合有半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區，而識別並結合包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區。
3.如權利要求I或2所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結合半乳糖的O連接型糖鏈為選自a -N-乙醯半乳糖胺-絲氨酸/蘇氨酸(以下稱為Tn抗原)或涎酸化Tn抗原中的至少一種O連接型糖鏈。
4.如權利要求3所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結合半乳糖的O連接型糖鏈為Tn抗原。
5.如權利要求廣4中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別並結合包含序列號I表示的胺基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區的抗體。
6.如權利要求廣4中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別並結合包含序列號I表示的胺基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區多肽的抗體，並且，所述鉸鏈區多肽是在選自從該多肽的氨基末端起第3位的蘇氨酸、第6位的蘇氨酸、第8位的絲氨酸、第10位的絲氨酸、第14位的蘇氨酸中的至少一個胺基酸殘基上結合有不具有半乳糖的N-乙醯半乳糖胺的糖肽。
7.如權利要求廣4中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是對包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的補體Cl抑制物不顯示交叉反應性的單克隆抗體。
8.如權利要求r4中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是在向包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區上結合時與選自單克隆抗體KM4137、KM4140、KM4144中的至少一種單克隆抗體發生競爭反應的單克隆抗體。
9.如權利要求廣4中任一項所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是與選自單克隆抗體KM4137、KM4140、KM4144中的至少一種單克隆抗體所結合的、存在於包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區的表位進行結合的單克隆抗體。
10.如權利要求I、中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，單克隆抗體是由選自雜交瘤KM4137(FERM BP-11214)、KM4140 (FERM BP-11215)、KM4144 (FERM BP-11216)中的至少一種雜交瘤生產的單克隆抗體。
11.如權利要求I、中任一項所述的抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為基因重組抗體。
12.如權利要求11所述的基因重組抗體或該抗體片段，其中，基因重組抗體為選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中的抗體。
13.如權利要求f12中任一項所述的抗體片段，其中，抗體片段為選自Fab、Fab』、F(ab』)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(雙價抗體)、二硫鍵穩定的V區(dsFv)和包含CDR的肽中的抗體片段。
14.一種雜交瘤,其生產權利要求廣9中任一項所述的單克隆抗體。
15.一種DNA，其編碼權利要求f 13中任一項所述的抗體或該抗體片段。
16.—種重組載體,其含有權利要求15所述的DNA。
17.一種轉化株，其通過將權利要求16所述的重組載體導入宿主細胞中而得到。
18.一種抗體或該抗體片段的製造方法，用於製造權利要求廣13中任一項所述的抗體或該抗體片段，其特徵在於，將權利要求14所述的雜交瘤或權利要求17所述的轉化株在培養基中進行培養，在培養物中生成並蓄積權利要求廣13中任一項所述的抗體或該抗體片段，並從該培養物中收集抗體或該抗體片段。
19.一種IgAl的免疫學檢測或測定方法，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述方法中，使用權利要求廣13中任一項所述的抗體或該抗體片段。
20.一種IgAl的檢測試劑，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述檢測試劑中，使用權利要求廣13中任一項所述的抗體或該抗體片段。
21.—種IgAl相關疾病的診斷劑，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述診斷劑中，使用權利要求廣13中任一項所述的抗體或該抗體片段。
22.如權利要求21所述的診斷劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。
23.如權利要求21所述的診斷劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。
24.一種IgAl相關疾病的治療劑，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述治療劑中，含有權利要求廣13中任一項所述的抗體或抗體片段作為有效成分。
25.如權利要求24所述的治療劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。
26.如權利要求24所述的治療劑，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。
27.—種IgAl相關疾病的診斷方法，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區，所述診斷方法包括使用權利要求廣13中任一項所述的抗體或該抗體片段，對具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl進行檢測或測定。
28.如權利要求27所述的診斷方法，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。
29.如權利要求27所述的診斷方法，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。
30.權利要求f13中任一項所述的抗體或該抗體片段在製造IgAl相關疾病的治療劑中的應用，所述IgAl具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區。
31.如權利要求30所述的抗體或該抗體片段的應用，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為自身免疫疾病。
32.如權利要求30所述的抗體或該抗體片段的應用，其中，與具有包含未結合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區的IgAl相關的疾病為IgA腎病。
全文摘要
本發明的目的在於提供一種對IgA腎病的診斷有效的單克隆抗體，其特異性識別並結合由免疫球蛋白A1的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的絲氨酸蘇氨酸連接型糖鏈。根據本發明，能夠提供一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別並結合由免疫球蛋白A1的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區，所述鉸鏈區包含未結合半乳糖的絲氨酸蘇氨酸連接型糖鏈；並且能夠提供使用該抗體或抗體片段的診斷劑以及含有該抗體或抗體片段作為有效成分的治療劑。
文檔編號C12N1/15GK102712923SQ20108005984
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月28日 優先權日2009年12月28日
發明者佐佐木由香, 佐藤光男, 森勝弘, 神田豐, 金子悅士 申請人:協和發酵麒麟株式會社