一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用的製作方法
2023-05-04 22:46:41 1
一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用。使用保藏號為CCTCC?NO：V201349的大豆花葉病毒分離物侵染本氏菸草獲得感染菸草的大豆花葉病毒。按照本發明所述的方法獲得感染菸草的大豆花葉病毒在驗證抗大豆花葉病毒抗性候選基因中的應用。本發明從眾多分離物中篩選獲得了能夠侵染菸草的大豆花葉病毒，通過將該分離物侵染菸草並通過調查發病症狀、南農1138-2回接實驗、ELISA以及RT-PCR檢測手段進行了證實。該發明獲得了感染菸草的大豆花葉病毒，使得在菸草上驗證大豆抗SMV候選基因功能成為現實，打破了大豆遺傳轉化難的限制。
【專利說明】一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，涉及一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用。
【背景技術】
[0002]大豆花葉病毒(Soybean Mosaic Virus, SMV)病是全球最主要的大豆病害之一,分布十分廣泛，大豆種植區幾乎都有發生。SMV屬於馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，大豆感染SMV後，會產生花葉和壞死等症狀，造成大豆光合面積減少和光合能力降低，植株矮化，生長量下降，籽粒出現褐斑，一般造成大豆減產15%，甚至絕收。
[0003]培育抗病品種是控制SMV最有效方法，除了傳統的抗病育種方法以外，大豆轉基因技術已成為快速培育抗病品種的方法之一。轉基因育種以及闡明抗病機理的理論研究都需要抗性功能明確的抗病基因作為物質基礎。大豆起源於中國，許多大豆種質資源存在抗SMV基因，人們通過精細定位、酵母雙雜交、生物信息學分析等技術手段能從抗性種質中獲得SMV抗性候選基因.另外，人們也從其它物種中獲得一些可能對SMV具有抗性的基因。這些候選抗性基因可在菸草等模式植物上進行基因功能的間接驗證或者直接轉化大豆驗證這些基因的功能，在大豆上驗證功能的同時也有機會獲得轉基因大豆抗病材料用於培育抗病品種。
[0004]目前，農桿菌介導遺傳轉化已成為大豆遺傳轉化的主要方法。儘管科學家們已經通過多種手段不斷改進轉化體系以提高大豆轉化效率。但轉化周期長、轉化效率低、嵌合體比率高、成本高、工作量大等瓶頸問題還沒有徹底解決，轉化過程始終受到供體基因型、農桿菌菌株、載體、外植體類型、篩選劑、暗培養條件、操作手法等多方面的因素的限制，使得大豆仍然是世界上公認最難轉化的作物之一。因此，大豆抗SMV候選基因直接轉化大豆進行功能驗證難度非常大。而菸草的遺傳轉化體系已經非常成熟，它具有省時、省力、花費低、成功率高等優點。但由於SMV的寄主範圍較窄，主要侵染豆科植物，如大豆、四季豆、豇豆、豌豆、蠶豆、紫雲英等。至今未發現可以侵染菸草的SMV類型。菸草雖然轉化容易，但由於SMV不能侵染菸草，人們一直無法通過轉化菸草驗證大豆抗SMV候選基因的功能。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法。
[0006]本發明的另一目的是提供感病菸草的應用。
[0007]一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法,使用保藏號為CCTCC V201349的大豆花葉病毒分離物侵染本氏菸草獲得感染菸草的大豆花葉病毒。
[0008]本發明所述的感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法，優選具體步驟如下:
[0009](I)在感病大豆品種南農1138-2上人工接種保藏號為CCTCC V201349的大豆花葉病毒分離物，並進行繁殖，發病後取大豆花葉病症狀典型的葉片加入0.lmol/L、pH=7.3~7.4的磷酸緩衝液，再加600目的金剛砂，在研缽中研成勻漿；
[0010](2)人工氣候箱中培養本氏菸草，25°C，光照16小時，黑暗8小時，溼度60%，確保氣候箱中無蚜蟲，以防止蚜蟲傳毒造成株系交叉侵染，待本氏煙長至5~6葉時期，用毛刷將步驟(1)製備的勻漿塗到每一片菸葉上，頂端嫩葉不接種，接種後用裝有自來水的噴壺衝洗本氏煙，2~3周後觀察發病情況，侵染反應劃分為3種類型:
[0011]a.無症狀:接種後沒有症狀或只在接種葉上出現局部枯斑而上位葉無症狀；
[0012]b.壞死:接種後上位葉或頂端生長點出現壞死；
[0013]c.花葉:接種後上位葉出現花葉、皺縮、捲曲等:
[0014]在上位葉上出現壞死或花葉的視為感染大豆花葉病毒；
[0015](3)通過本氏菸草中SMV的血清檢測、SMV CP基因RT-PCR以及染病本氏菸草葉片回接感病大豆品種南農1138-2進行檢測，結果呈陽性，說明菸草確實感染了大豆花葉病毒。
[0016]其中，步驟(1)中每Ig新鮮葉片加5ml所述的磷酸緩衝液。
[0017]所述的本氏菸草中SMV的雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析方法優選:待菸草出現典型發病症狀後，選取新鮮的、具有典型症狀的葉片I~2片進行雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析DAS — ELISA實驗，每個樣本3次重複，並設置陽性、陰性、空白對照，顯色I小時後，將顯色的酶標板放入酶標儀中，測定0D=405nm的吸光度，並參照以下標準分析實驗結果:
[0018]a.底物孔 OD 值< 0.15
[0019]b.陽性對照OD值/陰性對照OD值> 10
[0020]c.樣品OD值=原始值-底物孔OD值
[0021 ] d.樣品OD值≥2倍陰性對照OD值，判為陽性，
[0022]e.樣品OD值< 2倍陰性對照OD值，判為陰性；
[0023]之後，再次人工接種本氏煙對所述的大豆花葉病毒分離物進行驗證，設置8次重複，每一個重複均通過ELISA檢測到大豆花葉病毒。
[0024]所述的SMV CP基因RT-PCR檢測方法優選:分別取經過8次重複的本氏菸葉各IOOmg,在液氮中充分研磨後提取總RNA,用引物Oligo dT合成cDNA第一鏈，以2XTaq mix聚合酶以反轉錄後的染病本氏菸草cDNA為模板，採用SMV CP基因的一對引物CP-F =SEQID N0.1/CP-RiSEQ ID N0.2進行PCR反應，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳後置於凝膠成像系統中觀察產物的擴增情況，8個樣本均在正確的位置出現了 CP條帶，證明樣品中含有病毒。
[0025]所述的染病本氏菸草葉片回接感病大豆品種南農1138-2方法優選:將大豆花葉病毒侵染本氏菸草的8次重複分別回接南農1138-2，2~3周後出現典型花葉症狀，然後通過DAS—ELISA實驗和SMV CP基因RT-PCR擴增均能檢測到大豆花葉病毒，證實菸草確實感染了 SMV。
[0026]按照本發明所述的方法獲得的感染菸草的大豆花葉病毒在驗證抗大豆花葉病毒抗性候選基因中的應用。
[0027]一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用，將大豆花葉病毒抗性候選基因構建到植物表達載體，利用植物表達載體侵染通過本發明所述的方法獲得的感染大豆花葉病毒的轉基因菸草，通過觀察菸草的感病情況，或者分析相關基因的表達從而驗證候選基因對大豆花葉病毒的抗性。[0028]一種能夠侵染菸草的SMV分離物SMV-S9，於2013年12月4日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC V201349。
[0029]有益效果:
[0030]本發明從本技術所獲得的眾多SMV分離物中篩選獲得了能夠侵染菸草的大豆花葉病毒，通過將該分離物侵染菸草並通過調查發病症狀、南農1138-2回接實驗、ELISA以及RT-PCR檢測手段進行了證實。該發明獲得了感染菸草的大豆花葉病毒，使得在菸草上驗證大豆抗SMV候選基因功能成為現實，打破了大豆遺傳轉化難的限制。
[0031]說明書附圖
[0032]圖1本氏煙感染大豆花葉病毒後的症狀，A:野生型本氏煙；B:SMV感染引起的花葉症狀。
[0033]圖2本氏菸草葉片雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析實驗，其中S9、S10以及陽性對照
孔呈亮黃色，其餘孔呈無色。
[0034]圖3本氏菸草葉片雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析實驗，其中，可侵染SMV分離物再次接種本氏煙8次重複和陽性對照孔呈亮黃色，其餘孔呈無色。
[0035]圖4RT-PCR檢測本氏煙中SMV的CP基因
[0036]M:markerD2000; +:染病的南農1138-2作為陽性對照；wt:野生型本氏煙為陰性對照；1-8 =SMV接種本氏煙8個樣品。
[0037]圖5SMV侵染本氏煙`草後回接南農1138-2的症狀
[0038]A:野生型南農1138-2 ；B感病菸草回接的南農1138-2的症狀
[0039]圖6SMV接種本氏煙後回接南農1138-2雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析實驗，其中回接南農1138-2的發病葉片和陽性對照孔呈亮黃色，其餘孔呈無色。
[0040]圖7RT-PCR檢測南農1138-2中SMV的CP基因
[0041]M:markerD2000,1~8泳道分別為SMV侵染本氏菸草的8次重複分別回接南農1138-2。
[0042]圖8SMV病樣的單斑分離純化
[0043]注:接種SMV病樣後，離體的Topcrop葉片上出現葉脈壞死斑，每個壞死斑被定義為一個純化的分離物。
[0044]生物樣品保藏信息
[0045]SMV-S9，分類命名為:馬鈴薯Y病毒屬大豆花葉病毒SMV-S9 (Soybean mosaicvirus SMV-S9)，於2013年12月4日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC V201349。
【具體實施方式】
[0046]實施例1
[0047]1、可侵染本氏菸草的SMV分離物獲得
[0048](I)從全國大豆產區分離鑑定出37個SMV分離物(表1 )，這些分離物人工接種在感病大豆品種南農1138-2上繁殖，發病後取症狀典型的葉片加入0.lmol/L、pH=7.3~7.4的磷酸緩衝液(約每Ig新鮮葉片加5ml緩衝液)再加少許金剛砂(約600目)在研缽中研成勻漿。[0049](2)人工氣候箱中培養本氏菸草，25°C，光照16小時，黑暗8小時，溼度60%，確保氣候箱中無蚜蟲，以防止蚜蟲傳毒造成株系交叉侵染，待本氏菸草長至5~6葉時期，人工接種SMV。
[0050]用毛刷將勻漿塗到每一片菸葉上，頂端嫩葉不接種，接種後用裝有自來水的噴壺衝洗本氏菸草。2~3周後觀察發病情況，侵染反應劃分為3種類型:
[0051]a.無症狀(接種後沒有症狀或只在接種葉上出現局部枯斑而上位葉無症狀)；
[0052]b.壞死(接種後上位葉或頂端生長點出現壞死)
[0053]c.花葉(接種後上位葉出現花葉、皺縮、捲曲等)。
[0054]在上位葉上出現壞死或花葉的(類型b、c)視為感染SMV，即該病毒可侵染本氏煙。結果發現S9、SlO兩個分離物可侵染本氏煙並在上位葉呈現出花葉症狀(表1，圖1)。
[0055]表1
[0056]
【權利要求】
1.一種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用，其特徵在於使用保藏號為CCTCC V201349的大豆花葉病毒分離物侵染本氏菸草獲得感染菸草的大豆花葉病毒。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於具體步驟如下 (1)在感病大豆品種南農1138-2上人工接種保藏號為CCTCCV201349的大豆花葉病毒分離物，並進行繁殖，發病後取大豆花葉病症狀典型的葉片加入0.lmol/L、pH=7.3~7.4的磷酸緩衝液，再加600目的金剛砂，在研缽中研成勻漿； (2)人工氣候箱中培養本氏菸草，25°C，光照16小時，黑暗8小時，溼度60%，確保氣候箱中無蚜蟲，以防止蚜蟲傳毒造成株系交叉侵染，待本氏煙長至5~6葉時期，用毛刷將步驟(I)製備的勻漿塗到每一片菸葉上，頂端嫩葉不接種，接種後用裝有自來水的噴壺衝洗本氏煙，2~3周後觀察發病情況，侵染反應劃分為3種類型: a.無症狀:接種後沒有症狀或只在接種葉上出現局部枯斑而上位葉無症狀； b.壞死:接種後上位葉或頂端生長點出現壞死； c.花葉:接種後上位葉出現花葉、皺縮、捲曲等: 在上位葉上出現壞死或花葉的視為感染大豆花葉病毒； (3)通過本氏菸草中SMV的雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析檢測、SMVCP基因RT-PCR以及染病本氏菸草葉片回接感病大豆品種南農1138-2進行檢測，結果呈陽性，說明菸草確實感染了大豆花葉病毒。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(1)中每Ig新鮮葉片加5ml所述的磷酸緩衝液。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的本氏菸草中SMV的雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析檢測方法為:待菸草出現典型發病症狀後，選取新鮮的、具有典型症狀的葉片I~2片進行雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析DAS — ELISA實驗，每個樣本3次重複，並設置陽性、陰性、空白對照，顯色I小時後，將顯色的酶標板放入酶標儀中，測定0D=405nm的吸光度，並參照以下標準分析實驗結果: a.底物孔OD值10 c.樣品OD值=原始值-底物孔OD值 d.樣品OD值≥2倍陰性對照OD值，判為陽性， e.樣品OD值<2倍陰性對照OD值，判為陰性； 之後，再次人工接種本氏煙對所述的大豆花葉病毒分離物進行驗證，設置8次重複，每一個重複均通過ELISA檢測到大豆花葉病毒。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的SMVCP基因RT-PCR檢測方法為:分別取權利要求4中經過8次重複的本氏菸葉各IOOmg,在液氮中充分研磨後提取總RNA，用引物Oligo dT合成cDNA第一鏈，以2XTaq mix聚合酶以反轉錄後的染病本氏菸草cDNA為模板，採用SMV CP基因的一對引物CP-F:SEQ ID N0.1/CP-RiSEQ ID N0.2進行PCR反應，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳後置於凝膠成像系統中觀察產物的擴增情況，8個樣本均在正確的位置出現了 CP條帶，證明樣品中含有病毒。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的染病本氏菸草葉片回接感病大豆品種南農1138-2方法為:將權利要求4中大豆花葉病毒侵染本氏菸草的8次重複分別回接南農1138-2，2~3周後出現典型花葉症狀，然後通過雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析和SMV CP基因RT-PCR擴增均能檢測到大豆花葉病毒，證實菸草確實感染了 SMV。
7.按照權利要求1所述的方法獲得的感染菸草的大豆花葉病毒在驗證抗大豆花葉病毒抗性候選基因中的應用。
8.—種感染菸草的大豆花葉病毒的獲得方法及其應用，其特徵在於將大豆花葉病毒抗性候選基因構建到植物表達載體，利用植物表達載體侵染通過權利要求1所述的方法獲得的感染大豆花葉病毒的轉基因菸草，通過觀察菸草的感病情況，或者分析相關基因的表達從而驗證候選基因對大豆花葉病毒的抗性。
9.一種能夠侵染菸草的SMV分離物SMV-S9，於2013年12月4日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為C CTCC V201349。
【文檔編號】G01N33/569GK103756975SQ201310653591
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】智海劍, 高樂, 李凱, 任銳, 仲勇坤, 翟銳 申請人:南京農業大學