定量檢測腫瘤標誌物的試紙、製備方法及檢測方法與流程
2023-05-05 01:29:19 1
本發明涉及體外診斷檢測技術領域，特別涉及一種定量檢測腫瘤標誌物的試紙及其製備方法和定量檢測腫瘤標誌物的方法。
背景技術：
惡性腫瘤嚴重威脅著人類生命安全及身心健康，早期診斷是治癒腫瘤的關鍵。臨床上應用的x線檢查、超聲檢查、ct檢查、核磁共振檢查、內窺鏡檢查等手段都能從不同角度對腫瘤進行明確診斷，提高了腫瘤的診斷確診性，而其局限性也明顯，只有在腫瘤發展到一定階段形成明顯腫瘤灶才能被檢查到。臨床需要一種能夠在腫瘤還未發生而只是有發展趨勢的早期既可給予預警的方法，或者在腫瘤治療過程中對治療效果和發展趨勢給予指導的方法。腫瘤標誌物是指在腫瘤的發生和增值過程中，因腫瘤細胞的相關基因表達或機體對腫瘤產生反應而異常變化而一類物質，這些物質不存在於正常人體內或含量極低。人們通過檢測其含量，協助臨床對腫瘤的診斷、分析病情、指導治療、監測復發或轉移、及判斷預後有知道意義。臨床常用的腫瘤標誌物及其臨床意義見表：
理想的腫瘤標誌物應當是指在一種特異性的腫瘤中出現，但是實際上這些腫瘤標誌物特異性均有局限性，單一腫瘤標誌物監測診斷某一種惡性腫瘤的準確率不是很高，一般不會超過60％。不同類型的腫瘤釋放標誌物濃度不同，且在腫瘤發展的不同時期其釋放標誌物濃度也不一樣，因此在臨床上多採用多種腫瘤標誌物聯合診斷和動態觀察的方法，以達到提高腫瘤診斷陽性率的目的。目前臨床聯合診斷的腫瘤標誌物及診斷的腫瘤類型見表，並可根據臨床情況增加相應項目。
目前臨床上檢測腫瘤標誌物主要採用酶聯免疫分析(elisa)和化學發光免疫分析(clia)方法，其它如蛋白晶片和放射免疫方法等產品使用量較少。酶聯免疫分析(elisa)不需要特殊儀器裝置，簡便、容易掌握，一般檢測實驗室即可操作，但操作步驟和影響因素較多，容易造成假陰性和假陽性。化學發光免疫分析(clia)檢測靈敏度可達pg/ml，特異性高，可進行自動化分析，被廣泛用於腫瘤標誌物檢測，但該技術存在發光反應短，影響因素多，穩定性及重複性欠佳的問題，且檢測成本高，不適用於快速現場檢測。時間分辨免疫層析技術是最近幾年研究的新熱點技術，一般用鑭系稀土元素離子作為標記物，其螢光光譜發射光譜窄，特異性強，螢光光譜的stokes位移較大，發射壽命長，可採用延緩測量時間的方式來降低樣品和試劑的本地螢光幹擾。現有有針對afp、cea等蛋白腫瘤標誌物的膠體金或螢光微球免疫層析技術，其中膠體金技術(immunecolloidalgoldtechnique)是以膠體金作為示蹤標誌物應用於抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，英文縮寫為：gict。膠體金是由氯金酸(haucl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。螢光微球免疫層析技術是以功能化納米微球載體技術，結合螢光標記物探針，儀器直接檢測激發螢光信號而非傳統金標定量所採用的ccd表層光密度掃描技術，檢測信號具有較高的信噪比、更高的信號檢測量和檢測靈敏度，檢測範圍更寬：與傳統光度百分率分析及光密度掃描分析技術不同，螢光免疫層析技術採用螢光直接激發發光檢測手段，螢光信號強度與螢光微球數量呈直線相關，同時避免了酶催化發光技術存在的催化效率及底物量限制等問題，定量範圍與反應體系內參與反應的特異性蛋白量直接相關，根據目前已經在臨床應用的全自動化學發光檢測技術相比，現有螢光免疫層析技術靈敏度可達到0.05pg，線性範圍可達到200-1000倍，產品變異係數(cv％)低於10％，性能指標遠遠高於其它快速檢測技術，接近全自動化學發光檢測技術水平。但現有普通的螢光免疫層析技術，激發光與接收光波長相近，且所用的大部分材料本身具有螢光性質，導致背景幹擾，靈敏度不理想，且應用範圍窄，還不能應用於糖類抗原的檢測。
技術實現要素：
本發明旨在克服現有技術中的定量檢測腫瘤標誌物的產品成本高、靈敏度不理想且應用範圍窄的問題，提供一種成本低廉、操作簡便、靈敏度高、能快速準確的定量檢測腫瘤標誌物的試紙及其製備方法和定量檢測腫瘤標誌物的方法。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：
本發明提供了一種定量檢測腫瘤標誌物的試紙，包括依次連接的標記墊、層析膜及吸水紙；所述層析膜包括檢測區和質控區，所述檢測區與標記墊連接，所述質控區與吸水紙連接；所述檢測區包被有抗特異腫瘤標誌物的抗體，所述質控區包被有抗igg抗體；所述標記墊包括標記區，所述標記區與檢測區連接，所述標記區上負載有螢光乳膠標記的抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體。
本發明同時提供了上述試紙的製備方法，其步驟包括將第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體用螢光乳膠標記，並將螢光乳膠標記的第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體包被至標記墊上；將包被有螢光乳膠標記的第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體的標記墊、層析膜和吸水紙依次連接。
本發明同時提供了一種定量檢測腫瘤標誌物的方法，其包括將待測樣本附著於上述試紙上，後在螢光免疫分析儀下分析。
本發明的有益效果在於：
應用本發明的試紙檢測的原理為待測樣本中的腫瘤標誌物抗原與標記墊上的抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體標記用螢光乳膠特異性結合成複合物，該螢光乳膠複合物通過層析作用在層析膜上與檢測區的抗特異腫瘤標誌物的抗體特異性結合而使螢光大量聚集。在螢光免疫分析儀下，由光源激發的檢測區螢光信號，經過時間分辨控制和光電接受轉化為電信號，並由分析儀進行數據分析輸出最終定量結果。採用本發明的試紙來聯合檢測腫瘤標誌物，具有成本低廉、操作簡便、靈敏度高、快速、準確的優點，同時本發明建立針對多種不同腫瘤標誌物的試紙產品，可根據臨床聯合檢測需求靈活組合。
(1)本發明的試紙配合螢光定量檢測儀即可實現準確檢測，可實現手動、半自動或全自動的檢測，與酶聯免疫法和化學發光法相比，具有操作簡便快速、即可單項目檢測也可多項目隨機組合、檢測成本低、不需要大型儀器的優點，在基層社區醫院即可開展。
(2)本發明的試紙是一種基於時間分辨螢光免疫層析技術，在免疫層析法的基礎上，採用時間分辨技術，克服了膠體金試紙和普通螢光試紙的背景幹擾，且敏感度顯著提高(可達pg/l級別)。
(3)本發明試紙對待測樣品無要求，即可用於血清、血漿檢測，亦可用於全血樣本檢測。
附圖說明
圖1為本發明的實施例1的試紙結構示意圖；
圖2為本發明的實施例1的ca199標準曲線圖；
圖3為本發明的實施例1的相關性分析圖；
附圖標記：1、底板；2、硝酸纖維素包被膜；3、吸水紙；4.1、檢測區；4.2、質控區；5、樣品墊；6、標記墊。
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例，下面描述的具體實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
本發明提供了一種定量檢測腫瘤標誌物的試紙，包括依次連接的標記墊、層析膜及吸水紙；所述層析膜包括檢測區和質控區，所述檢測區與標記墊連接，所述質控區與吸水紙連接；所述檢測區包被有抗特異腫瘤標誌物的抗體，所述質控區包被有抗igg抗體；所述標記墊包括標記區，所述標記區與檢測區連接，所述標記區上負載有螢光乳膠標記的抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體。採用本發明的試紙來聯合檢測腫瘤標誌物，具有成本低廉、操作簡便、靈敏度高、快速、準確的優點，同時本發明建立針對多種不同腫瘤標誌物的試紙產品，可根據臨床聯合檢測需求靈活組合。
其中，質控區是檢驗該試紙是否正常，只要質控區的線出現了，則表示檢測區的結果是大致正常的，檢測區是反應試劑是否有反應。
其中，試紙一般還包括用於負載待測樣品的樣品區，樣品區可以位於標記墊的非標記區，也可以在標記墊上連接樣品墊，樣品墊與標記墊連接專門用於負載待測樣品。
一般試紙還可包括用於支撐上述標記墊、層析膜及吸水紙等的載體，上述樣品墊、標記墊、層析膜及吸水紙均位於載體表面，一般採用黏貼的方式附著在載體上，樣品墊、標記墊、層析膜及吸水紙沿載體的延伸方向依次連接。
一些實施例中，樣品墊、標記墊、層析膜及吸水紙順次搭接；優先，標記墊形成為z型結構，一端搭接在層析膜的一端上；所述樣品墊的一端具有臺階結構，此端與標記墊的z型結構適配，搭接在標記墊的z型結構上；所述吸水紙形成為z型結構，一端搭接在層析膜的另一端上。能夠更好的層析，便於高效準確的檢測。其中，搭接在標記墊的z型結構上可以全部或部分覆蓋標記墊的z型結構。
一些實施例中，標記墊上負載的螢光乳膠標記的抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，螢光乳膠為時間分辨螢光微球。優先，時間分辨螢光微球包括鑭系元素，即鑭系螢光微球；優先，時間分辨螢光微球的粒徑為50～300nm。
優先，檢測區包被的抗特異腫瘤標誌物的抗體與標記區上負載的螢光乳膠標記的抗特異腫瘤標誌物的抗體為針對同一腫瘤標誌物的不同抗體，即一般採用能抗同一特異腫瘤標誌物的不同抗體。
本發明試紙應用廣泛，可以應用於各種腫瘤標誌物的檢測，例如腫瘤標誌物包括蛋白類腫瘤標誌物或糖類抗原標誌物中的一種或幾種，所述蛋白類腫瘤標誌物選自癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)、游離前列腺特異抗原(f-psa)、總前列腺特異抗原(t-psa)中的一種或幾種；所述糖類抗原標誌物選自糖類抗原199(ca199)、糖類抗原125(ca125)、糖類抗原153(ca153)中的一種或幾種。可根據檢測的腫瘤標誌物的不同選擇標記區和層析膜上的抗特異腫瘤標誌物的抗體來製備針對不同腫瘤標誌物檢測的試紙產品，均可以實現準確快速的定量檢測。
本發明同時提供了上述試紙的製備方法，其步驟包括將第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體用螢光乳膠標記，並將螢光乳膠標記的第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體包被至標記墊上；將包被有螢光乳膠標記的第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體的標記墊、層析膜和吸水紙依次連接。其中，包被、連接的技術本發明沒有限制，可以採用常規技術。
一些實施例中，步驟包括
a、螢光乳膠標記抗體：將時間分辨螢光微球與偶聯劑例如碳二亞胺混合反應後；沉澱用硼酸鹽緩衝液重懸至濃度為0.1wt％-1wt％，與第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體混合反應；所述時間分辨螢光微球與偶聯劑混合反應起始時間分辨螢光微球的濃度為0.1wt％-1wt％；偶聯劑的濃度為0.2-0.6mg/ml；與第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體混合反應起始第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體的濃度為0.2-0.4mg/ml。一般先將時間分辨螢光微球分散後再與碳二亞胺混合反應，分散的方法本發明沒有限制，可以採用本領域技術人員公知的各種分散技術，例如超聲分散。優選，硼酸鹽緩衝液的濃度為10-50mm，ph為7.0-8.0。時間分辨螢光微球與偶聯劑反應的時間沒有特別限定。與第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體反應的時間也沒有特別限定。其中，與第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體混合反應是指沉澱的重懸液可以分別與第一抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體混合反應，最後再混合，也可以一起混合反應。一般可以將製得的沉澱用10-50mmtris緩衝液(三羥甲基氨基甲烷緩衝液)(ph8.0-9.0)重懸至0.1mg/ml，超聲波處理分散後放置在2-8℃條件下保存備用。其中，偶聯劑本發明沒有特別限定，可以為本領域技術人員公知的各種偶聯劑，例如碳二亞胺。
b、標記墊的製備：將步驟a製得的沉澱用三羥甲基氨基甲烷緩衝液重懸至濃度為0.01-0.1mg/ml，按2-10ul/cm的用量包被至標記墊上。優選，三羥甲基氨基甲烷緩衝液的濃度可以為10-50mm，ph8.0-9.0。一般可採用真空冷凍或37℃乾燥。
c、層析膜的製備：分別用磷酸緩衝鹽溶液將第二抗特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體調節至濃度為0.25-2mg/ml，將第二抗特異腫瘤標誌物的抗體包被至硝酸纖維素膜的檢測區，將抗igg抗體包被至硝酸纖維素膜的質控區製得硝酸纖維素包被膜。其中，優選，磷酸緩衝鹽溶液的濃度為10-50mm，ph7.4。其中，第二抗特異腫瘤標誌物的抗體可以為不同於第一抗特異腫瘤標誌物的抗體的另一種抗同一特異腫瘤標誌物的抗體。層析膜為免疫反應的發生處。
d、組裝：在載體上順次相互搭接粘貼樣品墊、標記墊、層析膜和吸水紙。
本發明的試紙的製備方法步驟具體可以為：a、螢光乳膠標記抗體：時間分辨螢光微球超聲波處理分散1min，調節時間分辨螢光微球濃度為0.1mg/ml，加入終濃度為0.2-0.6mg/ml的碳二亞胺，混勻，室溫反應15min後10000-15000g、離心5-15min，沉澱用10-50mm硼酸鹽緩衝液(ph7.0-8.0)重懸至0.1mg/ml，超聲波處理分散1min；加入終濃度為0.2-0.4mg/ml抗特異腫瘤標誌物的抗體或抗igg抗體，混勻，室溫反應3h後10000-15000g、離心5-15min，，沉澱用10-50mmtris緩衝液(三羥甲基氨基甲烷緩衝液)(ph8.0-9.0)重懸至0.1mg/ml，超聲波處理分散1min,放置在2-8℃條件下備用。
b、標記墊的製備：將上述製備的螢光乳膠標記抗體用10-50mmtris緩衝液(ph8.0-9.0，含1wt％bsa(牛血清白蛋白)和0.5wt％tweenn20(吐溫-20))調節至濃度為0.01-0.1mg/ml，按2-10ul/cm的用量包被至標記墊上，真空冷凍或37℃乾燥。
c、層析膜的製備：分別用10-50mmpbs緩衝液(磷酸緩衝鹽溶液)(ph7.4)將另一抗同一特異腫瘤標誌物的抗體和抗igg抗體調節至濃度為0.25-2mg/ml，將此抗特異腫瘤標誌物抗體包被至硝酸纖維素膜的檢測區，將抗igg抗體包被至硝酸纖維素膜的質控區，37℃乾燥。
d、組裝：在底板上順次相互搭接粘貼樣品墊、標記物墊、層析膜和吸水紙製得試紙，最後可以根據需要裁切成適當寬度的試紙條。
本發明同時還提供了一種定量檢測腫瘤標誌物的方法，其包括將待測樣本附著於上述試紙上，後在螢光免疫分析儀下分析。待測樣本中的腫瘤標誌物抗原與標記墊上的抗特異腫瘤標誌物的抗體和/或抗igg抗體標記用螢光乳膠特異性結合成複合物，該螢光乳膠複合物通過層析作用在層析膜上與檢測區的抗特異腫瘤標誌物的抗體特異性結合而使螢光大量聚集。在螢光免疫分析儀下，由光源激發的檢測區螢光信號，經過時間分辨控制和光電接受轉化為電信號，並由分析儀進行數據分析輸出最終定量結果。
以下是本發明提供的具體實施例，用以說明上述方案及其各種條件的選取。本發明實施例中所用試劑均採用市購分析純。
實施例1
以下結合實施例和附圖，以糖類抗原ca199為例，對本發明做進一步的說明，但並不對本發明造成任何限制。
以下實施例中：
ca199抗體1和ca199抗體2來源於美國meridian公司。
抗igg抗體來源於中國boson公司。
時間分辨螢光微球來源於bangslab公司
本實施例的ca199時間分辨免疫層析定量檢測試紙可通過如下方法製備：
a、抗體的預處理：將ca199抗體1用0.05mol/l、ph7.5～8.5的硼酸鹽緩衝液4℃透析過夜。
b、螢光微球標記：選用直徑為100～200nm鑭系螢光微球，用0.05mol/lph6.0的mes緩衝液(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩衝液)洗滌調節微球濃度為0.1mg/ml，超聲分散(200w處理，3/3s，1min)；加入碳化二亞胺(edc)終濃度為0.5mg/ml，室溫反應10～15min，12000g、離心15min；用0.05mol/l、ph7.5的硼酸鹽緩衝液復溶至濃度為0.1mg/ml，加入ca199抗體1，使ca199抗體1的終濃度為0.2mg/ml，室溫反應3小時；加入終止液(含有1～2wt％bsa的0.05mol/l、ph7.5的硼酸鹽緩衝液，室溫反應30min；離心洗滌微球，加入復溶液(含有0.2～1wt％bsa、0.05～0.1wt％tween-20的0.05mol/l、ph8.5的tris緩衝液)至原體積，超聲分散。
c、標記墊6的製備：螢光微球標記物用稀釋液稀釋至濃度為0.02mg/ml，使用定量噴膜儀器以8ul/cm的量將製備好的螢光微球標記物噴塗在聚酯纖維或玻璃纖維膜上形成標記墊6，避光37℃乾燥。
d、硝酸纖維素包被膜2的製備：使用0.01molph7.4的磷酸鹽緩衝液分別稀釋ca199抗體2和兔igg抗體至0.75mg/ml和1.5mg/ml，使用定量噴膜儀器，以1.0ul/cm的濃度，間距0.5cm的間隔包被檢測區4.1和質控區4.2，37℃乾燥。
d、組裝：組裝操作在溼度低於35％的房間進行，在底板1中間先粘貼硝酸纖維素包被膜2，然後在硝酸纖維素包被膜2與質控區4.2接近的一端粘貼吸水紙3，吸水紙3與硝酸纖維素包被膜2重疊接觸1-2mm，另一端粘帖標記墊6，同樣與硝酸纖維素包被膜2重疊接觸1-2mm，在標記墊6上部分覆蓋樣品墊5，樣品墊5的另一端粘貼在底板1上。最後切割成4mm寬的試紙條，裝入殼體中。
ca199的定量檢測
1.繪製標準曲線
在製備好的ca199的時間分辨免疫層析試紙的樣品墊的加樣區加入不同濃度的ca199校準品(濃度為0iu/ml、5iu/ml、20iu/ml、50iu/ml、200iu/ml、500iu/ml)20ul，並加入80ul稀釋液。膜層析反應15min後，儀器讀取檢測區和質控區信號，以檢測區對應的濃度值回執標準曲線，得到擬合方程，方程參數輸入讀數儀的id卡中。
2.樣品檢測
以製備的ca199的時間分辨免疫層析試紙與貝克曼的ca199化學發光檢測試劑同時檢測臨床樣本，以兩種試紙的檢測結果繪製相關曲線，回歸方程為：y＝1.044x-2.9611，r2＝0.9862，相關係數r＝0.993，p＜0.001，兩者具有良好的相關性。
本發明的試紙具有成本低廉、操作簡便、靈敏度高、快速、準確的優點，同時本發明建立針對多種不同腫瘤標誌物的試紙產品，可根據臨床聯合檢測需求靈活組合。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。