斜帶石斑魚鈣調蛋白基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用的製作方法

2023-05-04 16:16:36

專利名稱：斜帶石斑魚鈣調蛋白基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程研發技術領域，具體涉及斜帶石斑魚鈣調蛋白以及編碼該蛋白的基因，包含該基因的載體以及該蛋白的應用。
背景技術：
鈣調蛋白(CaM)是Ca2+信號通路中的重要調控蛋白之一。Ca2+作為細胞內的第二信使，在行使其傳遞信息流作用中，要依賴於鈣依賴性調節蛋白的相互作用，其中，鈣調蛋白是在真核細胞中廣泛分布的。於1964年，美籍華人張槐耀對胞內cAMP的相關研究工作中發現鈣調蛋白的存在。鈣調蛋白具有特殊的結構，是一種酸性的單鏈蛋白，兩端各包含有兩個高度保守的Ca2+結合區域，每個Ca2+結合區域能夠結合一分子的Ca2+，中間由α螺旋結構相連，其分子量一般在1.7KDa，約由149個胺基酸組成。在其胺基酸組成當中，酸性胺基酸佔了約30%，從而能夠提供羧基(-C00H)與鈣離子結合。在功能上，鈣調蛋白單體一般以非活性狀態存在於細胞內 ，當細胞受到外界刺激以後，能夠迅速捕獲胞質內的Ca2+，從而引起自身的構象發生改變，形成具有高度活性的Ca2+-CaM複合物，由於在其胺基酸組成中不包含有羥脯胺基酸，從而保證了肽鏈的高靈活性，作用於靶酶的激活位點，引起其空間結構發生變化，促使後者從非活性態轉變成活性態。靶酶被激活後，又會作用於下遊的關鍵因子，進一步在逆境中調節細胞的代謝，在增強魚類自身免疫能力的方面，對機體的免疫防禦發揮出重要的作用。斜帶石斑jMXEpinepheluscoioides)屬於 S盧形目(Perciformess),鯧科(Serranidae),石斑魚亞科iBpinepheIinae),石斑魚屬{Epinephelus、,是暖水性的礁棲魚類，在印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域廣泛分布。石斑魚屬於名貴海產魚類之一，其肉質鮮美，倍受各地消費者的喜愛，經濟價值巨大。但是，由於面對著目前的急劇的氣候變化災害和嚴重汙染的水質問題，從而導致了其致病率和死亡率居高不下，對石斑魚的人工養殖造成嚴重的經濟打擊，也是一個難以解決的問題。如何增強石斑魚的抗逆能力，提高養殖存活率，是目前亟待解決的難題。

發明內容
針對現有問題，本發明的目的在於提供一種斜帶石斑魚鈣調蛋白、該蛋白的編碼基因、以及該蛋白的應用。本發明所採取的技術方案是:
斜帶石斑魚鈣調蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個胺基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。編碼上述斜帶石斑魚鈣調蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。—種克隆載體，其含有斜帶石斑魚鈣調蛋白基因。一種表達載體，其含有斜帶石斑魚鈣調蛋白基因。
生產斜帶石斑魚鈣調蛋白的方法，包括將含有斜帶石斑魚鈣調蛋白基因的表達載體導入宿主細胞中，表達得到斜帶石斑魚鈣調蛋白。所述宿主細胞為畢赤酵母。斜帶石斑魚鈣調蛋白在製備水產動物免疫增強劑中的應用。本發明的有益效果是:
(1)本發明首次獲得了斜帶石斑魚的鈣調蛋白CaM基因序列，可以應用於製備重組蛋白、魚類免疫製劑和飼料添加劑，為斜帶石斑魚的生理免疫研究提供了新的實踐基礎；
(2)本發明所提供的斜帶石斑魚CaM重組蛋白，經實驗證明可以提高石斑魚抗應激能力，可以應用於製備與魚類相關的免疫製劑或飼料添加劑，具有廣闊的應用潛力；
(3)將斜帶石斑魚CaM核苷酸序列在巴斯德畢赤酵母重組菌株中表達，可以應用於產業化生存，降低了成本的投入，具有較高的經濟·價值。


圖1是斜帶石斑魚CaM基因ORF的PCR擴增產物的電泳鑑定 圖2是石斑魚CaM基因ORF連接酶切接頭(McoRI ,XbaI)的PCR擴增產物的電泳鑑定
圖3是克隆載體pMD18-T-CaM雙酶切, XbaI)和表達載體pPICZaA雙酶切iEcoRI 'XbaD的電泳鑑定 圖4是pPICZaA表達載體和所構建的pPICZaA_CaM表達載體單酶切iSacl)的電泳鑑定 圖5是重組菌株pPICZaA-CaM-X-33表達產物CaM重組蛋白的Tricine-SDS-Page電泳分析 圖6是重組菌株pPICZaA-CaM-X-33表達產物CaM重組蛋白的western blot鑑定圖； 圖7是pPICZaA-CaM畢赤酵母表達載體構建示意 圖8是斜帶石斑魚CaM蛋白的胺基酸序列和人CaM蛋白的胺基酸序列對比 圖9是斜帶石斑魚CaM蛋白抗原表位預測分析結果；
圖10是重組菌株pPICZaA-CaM-X-33高密度發酵產物CaM重組蛋白的SDS-Page電泳分析 圖11是在低溫應激中的，A，B, C三組魚血細胞數目隨應激時間的變化情況；
圖12是在低溫應激中A、B、C三組魚血細胞呼吸爆發水平隨應激時間的變化情況；
圖13是在低溫應激中A、B、C三組魚血細胞凋亡情況隨應激時間的變化情況。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。以下實施例中所採用的分子生物學實驗技術包括PCR擴增、質粒提取、質粒轉化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學出版社)，或按照製造廠商所建議的條件。一、通過設計兼併引物獲得斜帶石斑魚CaM基因的ORF依據CaM蛋白胺基酸序列在各個物種中的保守性，設計兼併引物。第一條引物為 CAMS1，5』 -GACATGGCTGACCAACTAACA(SEQ ID NO:3)，第二條引物為 CAMA1，5， -AGTTCATTTGGCGGTCATAA
(SEQ ID N0:4),以 M-MLV reverse transcriptase kit(Promega, Madison, WI, USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經過touchdownPCR技術，獲得PCR擴增產物，對其進行測序並比對，確定為CaM基因，其長度為468bp (SEQID NO:1 )，並推測出其胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。PCR反應條件為:94°C預變性4分鐘；
(I)94°C變性30s，退火72°C 30s，共5個循環；(2) 94°C變性30s，退火70°C 30s，延伸72°C，共5個循環；(3)94°C變性30s，退火53°C 30s，延伸72°C，共30個循環；最後72°C繼續延伸10分鐘。PCR擴增產物的電泳圖見圖1，其中:M為DS2000 Marker ;1，2為PCR擴增產物。PCR產物送去華大基因公司測序，測序結果和比對結果一致。二、生物信息學方法分析斜帶石斑魚CaM蛋白序列
使用clustal-X和GeneDoc兩個序列分析軟體，將斜帶石斑魚CaM基因的胺基酸序列和人CaM基因的胺基酸序列進行序列比對，發現斜帶石斑魚CaM蛋白序列和人類CaM蛋白序列有較高的同源性(圖8)，並通過DNAstar軟體分析斜帶石斑魚CaM蛋白的抗原表位(圖9)。三、斜帶石斑魚CaM基因序列的 合成
根據分析好的斜帶石斑魚CaM基因的cDNA序列，設計合成上下遊兩端的引物。上遊引物是CAMSP，在該片段第一位鹼基起前加入的限制酶切位點以及其保護鹼基5』 -CCGGAATTCATGGCTGATCAGCTTACAGA(SEQ ID NO: 5);下遊引物是 CAMAP1M，在該片段後插入XbaI的限制酶切位點以及該酶切位點的保護鹼基、6Xhis標籤、終止密碼子5』 - TGCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGCTTCGCCGTCATCATTTGT] (SEQ ID NO:6)。以反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經PCR方法擴增石斑魚的CaM基因，PCR反應條件為:94°C預變性
3分鐘；下邊為40個循環:94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30分鐘；最後72°C延伸10分鐘。PCR擴增產物的電泳鑑定圖見圖2，其中，M:DS 2000 marker ;1，2:PCR擴增產物。從圖2可見PCR擴增後獲得一段約460bp的序列。四、含斜帶石斑魚CaM序列的克隆載體pMD18-T_CaM的構建
將上述所獲得的基因片段分離純化，然後與PMD18-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系4°C連接過夜(13h)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a，經Amp+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆；通過質粒小提試劑盒(Omega，USA)提取質粒，質粒經過雙酶切驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚CaM序列克隆到載體中，命名為pMD18-T-CaM，克隆載體轉化大腸桿菌DH5 α所得到的重組菌株命名為pMD18-T-CaM_DH5 α。使用EcoR1、XbaI對克隆載體pMD18-T-CaM進行雙酶切，酶切圖譜見圖3所示:M為DS 5000 Marker ；1:為pMD18_T_CaM的,XbaI雙酶切產物；2:pPICZaA表達載體的、XbaI雙酶切產物。五、含斜帶石斑魚CaM序列的表達載體pPICZaA- CaM的構建
克隆載體pMD18-T-CaM經小提質粒試劑盒(Omega，USA)抽提後，用限制性內切酶及和油<3J進行雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，產物用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit回收，分離純化約460bp的斜帶石斑魚CaM序列；
載體質粒pPICZaA經限制性內切酶及和油a/雙酶切後分離純化3.6kb的大片段，與約460bp的斜帶石斑魚CaM的基因片段以1:3比例混合，用T4連接酶於16°C過夜連接(約15h)。然後,用CaCl2法將質粒轉入大腸桿菌DH5a中，於低鹽LB平板篩選出具Zeocin抗性的轉化子。以標準方法提取質粒，篩選大小約4.0 kb的重組質粒,經送往Invitrogen公司測序，對測序結果進行比對，為斜帶石斑魚CaM的基因序列，並正確插入到畢赤酵母表達載體pPICZaA中，重組質粒命名為PICZaA-CaM。質粒構建流程見圖7。使用J對表達載體PPICZaA-CaM進行雙酶切，酶切分析圖見圖4，其中M:DS5000 Marker ；1:pPICZaA載體；2:pPICZaA載體的酶切產物；3:表達載體pPICZaA-CaM ；4:pPICZaA-CaM表達載體的Sacl酶切產物。六、能高效表達斜帶石斑魚CaM蛋白的畢赤酵母重組菌株pPICZaA-CaM _X_33構
建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect Pichia Expression Kit 說明書製備畢赤酵母X-33感受態細胞，重組質粒pP I CZaA-CaM用fee J線形化後凝膠回收，用電擊法將重組質粒pPICZaA-CaM轉化到畢赤酵母X-33感受態細胞中，在含有Zeocin 350 μ g/ml的YPDS平板上28°C進行培養。約3d後長出單克隆菌株。挑取單克隆經誘導培養與鑑定篩選出能高效表達斜帶石斑魚CaM重組蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- CaM _X_33。七、利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA- CaM _X_33生產重組斜帶石斑魚CaM蛋白 分別挑取各單克隆工程菌，接種於BMGY中，28°C，200rpm培養0D600至2_6，離心換等
體積培養基BMMY，稀釋0D600至1.0，每隔24h向培養基中補加0.5%甲醇，培養約96h後，5000rpm離心2min,4°C收集上清。取約Iml上清,用DOC-TCA-丙酮沉澱法對蛋白進行濃縮後，加入5X電泳上樣緩衝液，煮沸10分鐘後按標準方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣方法處理後電泳。陰性對照為空載質粒PPICZaA轉化X-33後長出的單克隆培養後的上清蛋白。結果見圖5，其中:M:蛋白分子量標準；NC:重組菌株pPICZaA-X-33表達產物；1:重組菌株pPICZaA- CaM_X_33表達產物。NC作為陰性對照，位於17Kd和26Kd之間出現一條新的蛋白條帶,而陰性對照不出現此蛋白帶。

八、斜帶石斑魚CaM蛋白抗原活性鑑定實驗
採用蛋白印跡方法(western blot)對重組斜帶石斑魚CaM蛋白進行免疫鑑定。其中，一抗採用鼠源his單克隆抗體(Novagen), 二抗採用馬抗小鼠IgG-AP (鼎國生物公司)。結果如圖6所示。其中，M:蛋白分子量標準；NC:重組菌株pPICZaA-X-33表達產物Westernblot鑑定圖譜；1:重組菌株pPICZaA- CaM-X-33表達產物Western blot鑑定圖譜。NC作為陰性對照，說明鼠源his單克隆抗體能夠識別帶有6Xhis標籤的重組斜帶石斑魚CaM蛋白，證明得到的蛋白為斜帶石斑魚CaM蛋白。九、畢赤酵母工程菌pPICZaA- CaM -X-33的高密度發酵
發酵過程參照 Invitrogen 公司的Pichia Fermentation Process Guidelines,具體步驟如下:
1.分別在 YPDS(Zeocin+)提取單克隆菌株，pPICZ a A-CaM-X-33 和 pPICZ α Α-Χ-33，其中pPICZa Α-Χ-33菌株作為空載對照。加入200ml MGY液體培養基到IL的錐形瓶中，30°C，200rpm 振蕩培養至 0D600=2-6 (約 16_24h)。2.組裝好發酵罐，加入3L含有4%甘油的發酵基礎培養基(配方見PichiaFermentation Process Guidelines),然後121°C,滅菌15min,待冷卻後,用流加瓶加入氨水，調pH到5。
3.在火焰圈保護下，將步驟1.1中搖好的菌種接種於發酵罐中。調節通氣量，灌壓，轉速來維持溶氧，使其高於20%。設定發酵溫度為28°C，自動流加氨水控制pH 5±0.05。4.當發酵罐中的甘油耗盡後(約接種後20個小時)，用流加瓶流加每升含12mlPTMl (配方見 Pichia Fermentation Process Guideline),設置流加速度為 54.45ml/h,直到細胞溼重為200 g/liter結束(流加大約4個小時)。5.甘油消耗盡後，開始添加每升含12ml PTMl的甲醇，設定流加速度為10.8 ml/h，兩個小時，設定流加速度為21.9 ml/h;兩個小時後，設定流加速度為32.7 ml/h，保持這個速度直到發酵結束。這個階段需要60個小時，總共添加約1.2L的甲醇。此時的細胞溼重約為 290 g/liter ο6.分別取 pPICZ a A-CaM_X_33 與 pPICZ α Α-Χ-33 發酵的菌液各 Iml，上清用DOC-TCA-丙酮沉澱法濃縮後，加5Χ電泳上樣緩衝液，煮沸10分鐘後按標準方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，pPICZ α Α-Χ-33發酵的菌液做為陰性對照組，結果見圖10。其中，M:蛋白分子量標準；NC:空載菌株pPICZaA-X-33表達產物；1:重組菌株pPICZaA-CaM-X-33表達產物。顯示pPICZaA- CaM _X_33在17Kd和26Kd之間出現一條蛋白條帶，而陰性對照不出現此帶。結果說明，PPICZaA- rC3B _X_33菌種發酵產生了高濃度的重組蛋白。7.把發酵液用噴霧乾燥器處理，得到粉末，PPICZaA-CaM -X-33菌種的發酵液粉末做為飼料添加劑，pPICZ α Α-Χ-33菌種的發酵液粉末做為對照，用於飼養實驗。十、動物實驗 I實驗條件 選取同一批次、體質健康、規格相近的斜帶石斑魚放養在養殖桶中。水溫25 30°C,水體鹽度28 32%。，pH值8.1 8.3，溶解氧值大於5.0 mg/L,並且水體持續循環。2飼料配置
飼料共分為3種，A為商品料，B為商品料十lwt% pPICZ α Α_Χ_33菌種的發酵液粉末，C為商品料+ lwt%pPICZaA- CaM_X_33菌種的發酵液粉末。(分別將各組粉料攪拌均勻，每天投餵前準確稱量，用水稀釋後製備成溼顆粒飼料投餵)。3實驗魚飼養
本試驗設3個實驗組，每組30條魚。分別投餵A、B、C組飼料。試驗魚平均體重
0.90±0.03g，長度為3±0.6cm。養殖水不斷充氣，水溫29土 2°C，水體pH值8.1 8.3，水體鹽度28 32%。。上午和下午按照魚體重的8%左右各投餵一次，雨天少量投喂。每天及時清理殘餌，觀察記錄，飼養時間7周。實驗前禁食一天。4.應激實驗 4.1實驗計劃
取用飼餵的斜帶石斑魚做溫度應激實驗，應激溫度為10土 0.5°C。實驗準備1.0mX0.5 mX 0.5 m的儲物箱3個，在每個儲物箱先裝滿40L的海水，並將裝有海水的儲物箱置於氣候箱中並放入水溫計來測定水溫，待水溫穩定在10±0.5°C，然後每個儲物箱分別放A，B，C三組魚各30條魚，將做低溫應激實驗的儲物箱置於氣候箱中並放入水溫計來測定水溫。應激12小時，分別在O小時、3小時、6小時、12小時取樣，每組取6尾。4.2血細胞計數以及滲透壓的測定用I ml—次性無菌注射器臀鰭下方尾靜脈或尾動脈抽血，取完血後，拔下針頭，將血液注入玻璃採血管中，4°C下靜置，取血清。血細胞計數板的計數血細胞方法按照WHO手冊進行計數，分別計數血細胞3次，取3次結果的平均值為計數結果。4.2.1血細胞計數的測定原理
細胞的計數一般使用血球計數板。每塊計數板由H形凹槽分為2個同樣的計數池，計數池高0.1mm0計數池分為9個大方格,每個大格面積為1.0mm.容積為0.1mm3C μ I),其中，中央大方格分成25個中方格，位於正中及四角5個中方格是紅細胞計數區域。四角的4個大方格是白細胞計數區域。在計數血細胞時，要計算位於中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數目，再根據公式細胞數/ml=五個中方格內的細胞個數/5 X 25 X 10000X稀釋倍數。4.2.2血細胞計數的測定方法
視待測血細胞的濃度，加抗凝劑適當稀釋(一般稀釋100倍)，然後取潔淨的血球計數板一塊，並在計數區內蓋上一塊蓋玻片。將血細胞輕輕吹打混勻，用移液槍吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生。靜置片刻後，把血球計數板放在顯微鏡的載物臺上然後觀察並計數中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數目。在計數時，要遵循原則:數上線不數下線，數左線不數右線。測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板衝洗乾淨。每個血樣分別計數血細胞3次，取3次結果的平均值為計數結果。結果顯示:應激過程中，在10±0.5°C應激O小時，三種飼料餵養的魚血細胞數目並沒有明顯差異。應激3小時後，A，B，C三組的血細胞數目均有下降，但是C組的血細胞數目高於A、B組。應激6小時後，A，B，C三組的血細胞數目進一步下降，但是C組的血細胞數目下降較A、B組少，數目明顯高於A、B組。應激12小時後，A，B, C三組的血細胞數目均有上升，C組的血細胞數目略高於A，B組，沒有明顯差異(見圖11)。4.3呼吸爆發的測定
4.3.1細胞呼吸爆發的測定原理
活性氧(Reactive oxygen species, R0S)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下遊產物過氧化物和羥化物等，是機體進行正常細胞生長增殖、發育分化過程中產生，參與了機體衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。2，7-二氯氫化螢光素二脂(2，7-dichlorof Iuoresceindiacetate, DCFH-DA)是迄今為止最常用、最靈敏的細胞內活性氧檢探針。本身沒有螢光的DCFH-DA可穿過細胞膜進入細胞，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成螢光物質DCF，綠色螢光強度與細胞內活性氧水平成正比。在激發波長502nm，發射波長530nm附近，使用流式細胞儀的FLl通道檢測DCF螢光，從而測定細胞內活性氧水平。4.3.2血細胞呼吸爆發的測定方法
取200 μ I的血細胞懸液，加入200 μ I PBS緩衝液(MAS抗凝劑進行稀釋)，混勻，調整細胞的濃度為I X IO6個/ml左右，使用螢光染料2，7-二氯氫化螢光素二脂(DCFH-DA)(終濃度10 μ Μ) 25°C下避光染色30min。然後使用200目的篩網過濾將細胞懸液轉移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測，並用Cellquest軟體分析DCF平均螢光強度的變化。結果顯示:A，B, C三組魚 受到低溫10±0.5°C應激後，應激O小時，三種飼料餵養的魚血細胞的活性氧(呼吸爆發)並沒有明顯差異。隨著應激時間的延長，血細胞的活性氧(呼吸爆發)水平不斷升高，在6小時達到最大值，並且A，B組的活性氧含量明顯高於C組。應激12小時後，A，B, C三組的血細胞的活性氧(呼吸爆發)均有下降，但是C組的血細胞的活性氧(呼吸爆發)明顯低於A，B組(見圖12)。4.4細胞凋亡測定
4.4.1血細胞凋亡的測定原理
細胞凋亡是細胞程序性死亡，當細胞發生凋亡時候，細胞膜的通透性增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液用螢光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞螢光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。血淋巴細胞凋亡的測定原理:在正常細胞中，磷脂醯絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂 醯絲氨酸(PS)由膜脂內側翻向外側。Annexin V是一種依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。用標記了FITC的Annexin V作為螢光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。碘化丙唳(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠細胞膜與細胞核結合呈現紅色。將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。在雙參數流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FIT C — / PI—)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FIT C + / PI + );而右下象限為凋亡細胞，顯現(FITC + / PI —)。4.4.2血淋巴細胞凋亡的測定方法
使用Annexin V/PI apoptosis kit,購自聯科生物。具體步驟:
收集血細胞，用MAS抗凝劑進行稀釋，調整血細胞濃度大約為IXlO6 -5X IO6 cells/ml，取200μ I稀釋的血細胞，在細胞懸浮液中加入5μ I Annexin V-FITC和10 μ I PI後輕輕混勻，在黑暗環境下靜置5分鐘，然後使用200目的篩網過濾將細胞懸液轉移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測。結果表明:Α，B, C三組魚受到低溫10±0.5°C應激後，應激O小時，三種飼料餵養的魚血細胞的細胞凋亡數目並沒有明顯差異。隨著應激時間的延長,血細胞的細胞凋亡數目不斷增加，A、B組血細胞的細胞凋亡數目增加比C組多，在6小時達到最大值，並且A、B組的細胞凋亡數目明顯高於C組。應激12小時後，A、B、C三組的血細胞的細胞凋亡數目均有下降，但是C組的血細胞的細胞凋亡數目明顯少於A、B組，並且差異顯著(見圖13)。以上實驗表明:實驗組C組，食用了含有重組蛋白CaM的飼料後，在低溫應激過程中，其抗應激能力明顯優於對照組A、B。由此可見，重組蛋白CaM能夠提高魚類尤其是石斑魚的免疫力，可用於製備水產動物免疫製劑或飼料添加劑。以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對於本領域技術人員來說，在不背離本發明精神的範圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。
權利要求
1.斜帶石斑魚鈣調蛋白，其胺基酸序列如SEQID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個胺基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.一種克隆載體，含有權利要求2或3所述的基因。
5.—種表達載體,含有權利要求2或3所述的基因。
6.生產斜帶石斑魚鈣調蛋白的方法，包括將權利要求5所述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到斜帶石斑魚鈣調蛋白。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞為畢赤酵母。
8.權利要求1所述的蛋白在製備水產動物免疫增強劑中的應用。
9.一種免疫增強劑，含有權利要求1所述的蛋白。
全文摘要
本發明公開了斜帶石斑魚鈣調蛋白基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用。本發明首次獲得了斜帶石斑魚的鈣調蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個胺基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質。經實驗證明，斜帶石斑魚鈣調蛋白可以提高石斑魚抗應激能力，可以應用於製備與水產動物相關的免疫製劑或飼料添加劑，具有廣闊的應用潛力。
文檔編號C07K14/46GK103172722SQ201310073460
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者王維娜, 羅盛偉, 祁增華 申請人:華南師範大學