用於人多能細胞培養的簡化基礎培養基的製作方法
2023-05-04 10:14:51 4
專利名稱：用於人多能細胞培養的簡化基礎培養基的製作方法
用於人多能細胞培養的簡化基礎培養基相關申請的交叉引用不適用。關於聯邦政府資助的研究或開發的聲明本發明受到政府支持，在國立衛生研究院授予的ES017166支持下完成。政府在本發明中有一定權利。
背景技術：
多能細胞，例如胚胎幹(ES)細胞和誘導性多能幹(iPS)細胞，具有分化為所有三種原胚層細胞的潛力(Thomson等，Science282，1145-1147 (1998))。已證實多能細胞的巨大發展潛力可用於基礎研究和臨床應用。人多能細胞培養的許多基礎方法，例如生長培養基、鋪板和其它條件，已得到開發與改進(Ludwig等，Nat.Biotechnol24, 185-187(2006)；Ludwig等，Nat.Methods3，637-646 (2006))。例如，當在含有胎牛血清(FBS)的培養基中，在鼠胚胎成纖維細胞(murine embryonic fibroblast, MEF)飼養細胞上起始培養人ES細胞時，現可獲得完全限定培養基(fully defined media)和限定的蛋白質基質(Ludwig等，Nat.Biotechnol24, 185-187(2006))。在過去的十年，多能細胞培養方法有顯著進展。開發了若干生長培養基，其為多能細胞的生存和擴增提供基礎營養物質和生長因子，並直接決定細胞如何生長與分化。TeSR 是首批限定培養基中的一種，其在無飼養細胞或條件培養基時，支持多能細胞經多次培養傳代仍保持在未分化狀態(Ludwig等，Nat.Methods3，637-646 (2006);美國專利號7，449，334，各文件通過引用納入本文並如其完整形式)。TeSR 除本身包含52種成分的基礎培養基DMEM/F12外，還包含18種成分(表I)。可用於多能細胞培養的不同生長培養基的多樣性造成了研究結果不一致。現用於多能細胞衍生和生長的培養基(包括完全限定培養基)含有會以不同方式影響多能細胞的成分。在本文描述的本發明之前，仍然未知各培養基成分在細胞培養中如何(單獨地還是與其它成分聯合)影響不同多能細胞的功能，如活力、多能性或分化。例如，在大多數培養基中含量最豐富的蛋白質——白蛋白，是一種脂質載體，並且同樣可以通過其聯合的脂質來影響多能性的分化或保持。白蛋白及其聯合的脂質的質量決定它是否能用於人多能細胞培養。然而，白蛋白的質量隨其來源而定，差異很大，甚至產自重組遺傳材料時差異也很大，造成在不同等效實驗條件下進行的實驗之間的差異。同樣，雖然可獲得克隆的人血清白蛋白，但由於其價格相對昂貴而很少用於常規實驗。從培養基中去除白蛋白的努力已被證實是不成功的。去除白蛋白或TeSR中存在的任何其它生長因子都會導致人ESC培養性能顯著下降，例如細胞活力、增殖和多能性的減少(Ludwig 等，Nat.Biotechnol24, 185-187 (2006))。為充分開發多能細胞用於藥物發現、測試和移植治療的潛力，需要使這些細胞在完全限定且理想的無異源條件下衍生和生長。因此，本領域中存在對不含引起不一致性的成分的培養基的未被滿足的需求 ，以保持對多能細胞培養條件的控制。本技術領域中特別需要多能細胞培養基，其僅包含支持對特定培養目標而言有重要性的多能細胞功能的那些成分。簡述本發明一般涉及用於衍生和培養多能細胞的培養基、組合物和方法，更具體地涉及用於多能細胞的完全限定培養基。本發明的第一方面概括為支持多能細胞的活力、生長和多能性的無白蛋白培養基。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基包含硒。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基包含NODAL。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基包含轉鐵蛋白。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基包含轉化生長因子-P (TGF-3 )。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基僅包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素和成纖維細胞生長因子(FGF)，各所述成分的量足以支持多能幹細胞的活力。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基僅包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞的增殖。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基支持多能細胞在傳代、冷凍、增殖、多能性、衍生和克隆化後的存活。在所述第一方面的一些實施方式中，所述培養基是無異源的。本發明的第二方面概括為用於在限定培養基中培養多能幹細胞的方法。在所述第二方面的一些實施方式中，用於培養多能細胞的所述培養基僅包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素和FGF，各所述成分的量足以支持多能細胞的活力。在所述第二方面的一些實施方式中，用於培養多能細胞的所述培養基僅包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF- ^和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞的增殖。在所述第二方面的一些實施方式中，所述培養基包含支持多能細胞的擴大生長、多能性、克隆化、冷凍或衍生的限定的因子。在所述第二方面的一些實施方式中，所述用於培養多能細胞的培養基是無異源的。本發明的第三方面針對在基本不含￠-巰基乙醇和白蛋白的培養基中培養多能細胞的體外細胞培養組合物。在所述第三方面的一些實施方式中，所述培養組合物不含成纖維細胞飼養細胞、條件培養基和異源汙染物。本發明的第四方面概括為用於在完全限定的條件下從成熟個體衍生iPS細胞的方法。所述方法包括以下步驟:在培養基中培養來自成熟個體的體細胞，所述培養基包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素和FGF，所述成分的量皆足以保持活力，以及在限定條件(例如用來衍生iPS細胞的條 件)中重編程所述細胞。在所述第四方面的一些實施方式中，所述培養基在部分或全部所述重編程步驟中包含TGF- 3。在所述第四方面的一些實施方式中，所述培養基包含丁酸鹽。在所述第四方 面的一些實施方式中，所述培養基包含氫化可的松。在所述第四方面的一些實施方式中，所述培養基是無異源的。
本發明的第五方面概括為用於在無白蛋白培養基中克隆多能幹細胞的方法。所述方法包括以下步驟:將多能幹細胞以克隆密度在支持多能幹細胞克隆化的無白蛋白培養基中鋪板。在所述第五方面的一些實施方式中，所述培養基包含ROCK抑制劑。在所述第五方面的一些實施方式中，所述培養基包含肌球蛋白抑素(blebbis tatin)。在所述第五方面的一些實施方式中，所述培養基僅包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞的克隆化。本發明的第六方面概括為在無白蛋白培養基中凍存保存多能幹細胞的方法。所述方法包括以下步驟:在無白蛋白培養基中冷凍多能幹細胞。在所述第六方面的一些實施方式中，所述培養基僅包含水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、TGF-P和NODAL 二者之一、以及二甲亞碸(DMSO)。本發明的第七方面概括為在無白蛋白條件下衍生的iPS細胞。在無白蛋白存在時衍生的iPS細胞不受內源白蛋白的汙染。本文中描述的方法和組合物可用於各種應用以衍生、培養和使用多能細胞。本發明的一個目的是為多能細胞限定短期和長期培養條件，所述多能細胞受限於支持所需培養目標的因子。本發明的另一個目的是為多能細胞提供培養條件，在所述培養條件下，處於未分化狀態的培養細胞的百分比最大化。本發明的另一個目的是提供培養基，所述培養基可作為必要平臺用以檢測各種條件如何影響多能細胞，並用於比較先前報導的在不同培養基背景下的實驗。本發明的這些及其它特徵、目的和優勢將從以下的說明中得到更好的理解。在該說明中，以附圖作為參考，這些附圖是本文的一部分，這一部分僅以說明方式呈現，而並非對本發明的限制或者實施方式。優選實施方式的說明並非限制本發明以概括所有變化形式、等價形式和可選形式。因此，應參考本文列舉的權利要求來理解本發明的範圍。附圖簡要說明考慮以下詳細描述將更好地理解本發明，並且除以上所述之外的特徵、方面和優勢將會更加明顯。所述詳細的說明參考以下附圖，其中:
圖1A-E顯示在培養中使人ES細胞存活和自我更新的培養基成分。圖1A顯示鋪板在不同培養基中的個體化細胞的24小時存活指數。培養基縮寫列於表I中。胰島素和成纖維細胞生長因子(IF)、牛血清白蛋白(BSA)、0_巰基乙醇(BME)的存在以「 + 」表示，不存在以表示。圖1B顯示鋪板在不同培養基中的個體化細胞的24小時或96小時存活指數。胰島素和成纖維生長因子(FGF)的添加以「 + 」表示，去除以表示。圖1C顯示培養在有維生素C的TeSR 培養基(TeSR)、無維生素C的TeSR 培養基(TeSR _LAA)或DF5培養基中的個體化細胞的24小時或129小時存活指數。圖1D顯示各在DF5、添加硒的DF5 (DF5+硒)、DF12或已去除硒的DF12(DF12-硒)中傳三代後的細胞增殖。圖1E顯示十二種不同基礎培養基的對比分析。圖2A-F顯示人ES細胞和iPS細胞使用DF5S的培養條件的優化。圖2A顯示在DF5S(下圖)或TeSR (上圖)中以低密度(約1，500個細胞/cm2)接種，並於不同O2和CO2 濃度(015C5:15%02 和 5%C02 ；015C10:15%02 和 10%C02 ；05C10:5%02 和 10%C02)培養的個體化細胞的存活指數。在24小時和124小時檢測細胞存活。圖2B顯示培養在存在小分子HA100 (+HA100)或不存在小分子撤100化11100:含100叩/1111 FGF的條件培養基)的不同培養基中的Hl細胞的克隆率(cloning efficiency)。圖2C顯示不同培養基中Hl細胞和衍生自包皮成纖維細胞的iPS細胞的克隆率。圖2D顯示不同培養基中衍生自包皮成纖維細胞的iPS細胞的克隆率。DF5StrFe代表其中加入了全轉鐵蛋白的DF5S培養基。圖2E顯示在存在HA100 (10 u M，24小時)、肌球蛋白抑素(10 y M，4小時)、或Y27632 (10 u M，24小時)的不同培養基中培養的Hl細胞的克隆率，與不存在這些因子(對照)時的克隆率做比較。星號代表P〈0.05。圖2F顯示在條件培養基(CM)、含有ROCK抑制劑(HA100)的CM、含有ROCK抑制劑的TeSR和含有ROCK抑制劑的E8中，在含氧量正常(深灰柱)和低氧(淺灰柱)條件中的Hl細胞的克隆率。誤差柱代表均值的標準誤差；星號代表P〈0.05。圖3A-B顯示補充了胰島素、轉鐵蛋白、硒、L-抗壞血酸、FGF2和TGF-P或NODAL的DMEM/F12 (在本文中分別稱為「E8 (TGF- ^ ) 」和「E8 (NODAL) 」 )中的多能細胞生長和基因表達。圖3A顯示在TeSR (深灰線)或E8 (TGF-P)(淺灰線)中保持的HlES細胞(上圖)和iPS細胞(下圖)的倍數擴增。圖3B顯示在E8 (TGF-P)中生長的HlES細胞和在TeSR 中生長的HlES細胞的全基因表達。通過用伊魯米那基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)GAIIX(全基因表達相關係數R=0.954(斯皮爾曼相關(Spearman Correlation)))進行RNA-測序，分析在TeSR或E8 (TGF ^ )培養基中保持三代的Hl細胞的RNA。圖4A-F顯示在多種限 定條件下的iPS細胞衍生。圖4A顯示添加了各種成纖維細胞生長因子(FGF)的基於DF5SFe培養基中的包皮成纖維細胞增殖，與在含有FBS的培養基中的增殖做比較。圖4B顯示補充了氫化可的松的不同培養基中的成纖維細胞生長。圖4C顯示多能性標記物0CT4(左圖)和SSEA4(右圖)的表達。圖4D顯示由包皮成纖維細胞、hES細胞、在飼養細胞上衍生的iPS細胞(iPS細胞(飼養細胞))以及在E8培養基中衍生的iPS細胞(iPS細胞(E8))的所選基因表達。在RNA分析之前，除了成纖維細胞被保持在含有氫化可的松的E8中，所有細胞都保持在E8 (TGF ^ )培養基中。圖4E顯示在E8 (TGF ^ )培養基中衍生的人ES和iPS細胞的全基因表達(R=0.955)。圖4F是在MEF上衍生的iPS細胞和在E8 (TGF ^ )培養基中衍生的iPS細胞的全基因表達。圖5A-C顯示用於iPS細胞衍生的培養基的改進。圖5A顯示補充了 TGF-P、氫化可的松、TGF- ^和氫化可的松、或TGF- ^和氫化可的松但不含FGF的DF5SFe培養基中的包皮(深灰柱)和PRPF8-2成熟成纖維細胞(淺灰柱)增殖。圖5B顯示TGF- ^和丁酸鹽對包皮成纖維細胞重編程的影響。在重編程轉染開始後的四 五周，對轉化細胞和真iPS細胞的克隆數進行評分，並計算iPS克隆與非iPS細胞克隆的比率。圖6A-B顯示在未經二次傳代的完全限定條件下，從成熟成纖維細胞衍生iPS細胞。圖6A顯示重編程方案的一個示例。圖6B顯示通過流式細胞術分析在補充了胰島素、轉鐵蛋白、硒、L-抗壞血酸、FGF2以及TGF-P或N0DAL( 「E8」)的DMEM/F12傳代20次維持的iPSC細胞系所測定的多能性標記物0CT4和SSEA4的表達。陰影峰:由0CT4 (左)和SSEA4(右)特異性抗體染色；非陰影峰:小鼠IgG對照抗體。圖7A-C顯示不同培養基中的人成纖維細胞重編程效率。圖7A顯示使用小鼠成纖維細胞飼養細胞(MEF)或在基於E8的培養基中經重編程處理的每80，OOO個成纖維細胞的iPS細胞克隆數。為提高效率，向兩種條件中都添加了 IOOii M 丁酸鈉。圖7B顯示在TeSR 中或在基於E8的培養基中經重編程處理的每80，000個成纖維細胞的iPS細胞克隆數。圖7C顯示與TGF-P和丁酸鹽的接觸時間對完全限定條件下的包皮成纖維細胞重編程效率的影響。成纖維細胞在補充了胰島素、轉鐵蛋白、硒、L-抗壞血酸和FGF2的DMEM/F12(E8無TGF-￠)或在E8中(存在或不存在100 PM 丁酸鹽)重編程。在重編程30天後檢測所有條件下的重編程效率。星號代表P〈0.05。由於本發明易受不同變化和選擇形式的影響，因此通過附圖中實施例的方式顯示示例性實施方式，並在本文中詳細描述。但是應理解，對示例性實施方式的說明不是為了將本發明限制於所公開的特定形式，而與之相反，本發明適用於如所附權利要求所限定的所有落入本發明的精神和範圍內的變化形式、等量形式和可選形式。實施方式的示例性說明本發明涉及本發明人的如下觀察:曾被認為是培養多能細胞所必需的某些培養基成分可從多能細胞培養基配方中去除以達到某種的培養目的。本文中所用術語「多能細胞(pluripotent cell) 」指的是有能力分化為所有三種胚層細胞的細胞。多能細胞的例子包括胚胎幹細胞和誘導性多能幹(iPS)細胞。本文中所用術語「 iPS細胞」指的是在遺傳上與其各自分化的來源體細胞基本上相同，並顯示與較高潛能細胞(比如本文所述的ES細胞)相似特性的細胞。所述細胞可通過非多能細胞(例如專能(multipotent)細胞或體細胞)的重編程而獲得。本發明涉及不含對特定培養目標非必需的因子的新培養基。培養目標的實施例包括但不限於:細胞存活、傳代、增殖、多能性、克隆化和iPS細胞衍生。本發明特別涉及無白
蛋白培養基。澄清一點:「傳代」和「克隆化」是不同的方法。「傳代」描述的是將培養容器中已培養至一定密度的細胞分成團塊，然後將其放入新培養容器中的過程。這些團塊可包含任意數量的細胞，一般在100 1，000個細胞之間，其易起始在培養基中的生長。相反，「克隆化」指的是通過從單個個體ES細胞生長人ES細胞克隆來創建純系集落。本文所用的術語「克隆率」指的是形成新細胞集落的個體化細胞的數量除以在培養物中鋪板的個體化細胞的數量。克隆率根據培養條件的不同具有很大差異。例如，在限定且無異源的條件下，
MATR1GEL/上的人ES細胞的克隆率很低(即少於約0.1%),而用成纖維細胞-條件培養基培養的這些細胞的克隆率儘管仍然低(即少於約2%)，但就創建純系ES細胞集落而言已足夠高了。現有所用的某些培養基成分會對培養`的細胞或誘導性分化有害。例如，^ -巰基乙醇會損傷或甚至殺死培養的多能細胞。血清培養基添加劑，如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(FCS)，會誘導培養的多能細胞分化。市售可得的血清成分在其組成上也可有顯著差異(甚至當其由同一來源供應)，引起不可預期的培養可變性。本文所述的培養基基本不含在大多數傳統多能細胞培養基中存在的損傷性、有差異、不確定的因子。所公開的培養基已成功用於各種培養目的，比如支持短期多能細胞活力(例如24小時)、短期增殖(例如4 5天)、在延長的培養周期(例如在3個月內傳代多於25次)中維持多能細胞以及用慢病毒和附加型載體從胎兒和成人成纖維細胞衍生iPS細胞。
開發了為某些細胞培養目的而特別定製的新型最簡培養基。測試單一或聯合的各種培養基成分，例如鹽、維生素、葡萄糖源、礦物質和胺基酸，以測定它們對於活力、增殖或多能性的單獨影響。開發了新的存活分析方法，並將其用於測定哪些成分對解離(dissociation)後多能細胞的存活是必需的。測試了新型培養基支持增殖和保持多能性的能力。這些培養基也用於克隆分析，以測定各培養基如何影響單個細胞及其克隆率。表I列出了本文所述的各新型培養基的完整成分列表(淺色和深色陰影區域代表該培養基中存在該成分，格紋區域表示可互換的成分，無色區域表示該培養基中不存在該成分)。表1.培養基成分
權利要求
1.一種無白蛋白培養基，所述培養基支持多能幹細胞增殖。
2.如權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述培養基包含: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞增殖。
3.一種用於培養 多能幹細胞的方法，所述方法包括以下步驟: 將多能幹細胞置於基質上；以及 使所述細胞接觸無白蛋白培養基，所述培養基支持多能幹細胞增殖。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞增殖。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述基質包含層粘連蛋白。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述基質包含玻連蛋白。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，使所述細胞在低氧條件下接觸所述培養基。
8.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述多能幹細胞是胚胎幹細胞。
9.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述多能幹細胞是誘導性多能幹細胞。
10.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述多能幹細胞是人細胞。
11.一種用於克隆多能幹細胞的方法，所述方法包括以下步驟: 在無白蛋白培養基中以克隆密度將多能幹細胞鋪板，所述培養基支持多能幹細胞克隆。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞克隆。
13.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述培養基還包含ROCK抑制劑。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述ROCK抑制劑選自HA100和Y27632。
15.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述培養基還包含肌球蛋白抑素。
16.一種凍存多能幹細胞的方法，所述方法包括以下步驟: 在無白蛋白培養基中冷凍多能幹細胞。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞增殖。
18.一種用於在限定條件下衍生誘導性多能幹(iPS)細胞的方法，所述方法包括以下步驟: 在無白蛋白培養基中重編程體細胞，所述培養基支持體細胞的重編程以衍生iPS細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持iPS細胞衍生。
20.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述重編程步驟包括使所述細胞接觸TGF-3 5 10 天。
21.如權利要求20所述的方法，其還包括以下步驟: 在5 10天後移除TGF- P ；以及 使所述細胞接觸培養基，所述培養基基本由以下成分組成: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒和轉鐵蛋白。
22.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述重編程步驟包括使所述細胞接觸氫化可的松。
23.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述重編程步驟包括使所述細胞接觸丁酸鹽。
24.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，在無異源條件下衍生所述iPS細胞。
25.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述體細胞是成熟體細胞。
26.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述重編程步驟包括使用病毒載體。
27.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述重編程步驟包括使用附加型載體。
28.一種無白蛋白生長培養基，所述培養基支持多能幹細胞的長期培養，所述培養基基本由以下成分組成:水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF-3和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞的長期培養。
29.一種用於培養多能幹細胞的方法，所述方法包括以下步驟: 將多能幹細胞置於基質上；以及 使所述細胞接觸無白蛋白培養基，所述培養基基本由以下成分組成: 水、鹽、胺基酸、維生素、碳源、胰島素、FGF、硒、轉鐵蛋白、以及TGF- ^和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能幹細胞的長期培養。
全文摘要
描述了支持多能幹細胞活力、增殖、克隆和衍生的完全限定培養基，以及包括這些培養基的方法和組合物。還描述了用於在限定的、無異源條件下，從成熟個體衍生iPS細胞的方法。
文檔編號C12N5/00GK103180434SQ201180038596
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者J·A·託馬森, 陳國凱 申請人:威斯康星校友研究基金會