多發性骨髓瘤的rna幹擾靶點序列及其應用的製作方法
2023-05-04 23:59:46 1
專利名稱：多發性骨髓瘤的rna幹擾靶點序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於RNA幹擾技術領域，具體涉及一種多發性骨髓瘤的RNA幹擾靶點序列及其應用。
背景技術：
多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是漿細胞異常增生的惡性腫瘤，是一種進行性的腫瘤性疾病。其特徵為骨髓漿細胞瘤和一株完整性的單克隆免疫球蛋白(IgG，IgA， IgD或IgE)或Bence Jones蛋白質(游離的單克隆性κ或Y輕鏈)過度增生。多發性骨髓瘤常伴有多發性溶骨性損害、高鈣血症、貧血、腎臟損害，而且對細菌性感染的易感性增高，正常免疫球蛋白的生成受抑。發病率估計為2 3/10萬，男女比例為1.6 1，大多患者年齡> 40歲，黑人患者是白人的2倍。在絕大部分多發性骨髓瘤(MM)病人中，無論採用標準或是大劑量化療仍然無法被完全抑制，而且在治療後表現出多種疾病的復發和惡性程度加重。不幸的是，MM耐藥性產生和病情加重的分子機理仍然不清楚。本發明因此而來。
發明內容
本發明目的在於提供一種抑制多發性骨髓瘤轉錄因子ISCAN3表達水平的RNA幹擾靶點序列，提供了一種新的治療或輔助治療多發性骨髓瘤的方法。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種抑制多發性骨髓瘤轉錄因子ZKSCAN3表達水平的RNA幹擾靶點序列，其特徵在於所述RNA幹擾靶點序列是SEQ No 1的序列。本發明的另一目的在於提供一種RNA幹擾片段的表達載體，其特徵在於所述表達載體克隆有所述的RNA幹擾靶點序列。本發明的另一目的在於提供一種RNA幹擾靶點序列在製備抗腫瘤藥物中的應用。本發明人經長期試驗研究發現了一個新型的轉錄因子3(SCAN3在大部分多發性骨髓瘤(MM)細胞和病人材料中高表達，但在良性漿細胞中卻不表達。本發明人還發現 ISCAN3結合到cyclin D2基因的啟動子誘導其表達，從而促進了匪細胞的增殖。進一步的基因表達譜分析顯示ISCAN3調控一個基因表達程序，包括增強cyclin Dl, Cdk-6, HSP-70，c-myc和VEGF，並抑制Bax的表達。抑制ISCAN3表達明顯減緩MM細胞的增值並導致對化療藥物的敏感。因此，本發明人意識到ZKSCAN3可以代表一個重要的MM病理發生相關基因，可以作為一個多發性骨髓瘤(MM)治療的新靶點。本發明的目的是提供MM治療的新靶點，為未來的臨床治療手段提供新的選擇。本發明人根據一個對骨髓瘤發生具有重要促進作用的轉錄因子3(SCAN3的發現，確定了一個可以特異、高效抑制ISCAN3表達的小分子RNA(命名為sh3(3-#l)。應用該小分子RNA到骨髓瘤細胞上，不僅可以抑制骨髓瘤細胞的生長，還可以增加骨髓瘤細胞對化療藥物的敏感性，因此可以作為骨髓瘤臨床治療的靶點，通過RNA幹擾技術抑制其表達後獲得對骨髓瘤的治療效果。為了直接測定ZKSCAN3基因的表達，本發明人對9個代表性的骨髓瘤細胞系以及兩種正常漿細胞和B淋巴細胞對照組進行了實時定量PCR(qPCR)的研究(圖la)。觀察到 ZKSCAN3在所有細胞系中都測得有所表達，其中更是高表達在H擬9、KAS-6/1、RPMI8226等細胞中。然而，ZKSCAN3在⑶19+的B細胞和⑶138+的漿細胞中沒有檢測到表達，從而揭示多發性骨髓瘤細胞中ISCAN3高表達的現象，顯示出ZKSCAN3基因在骨髓瘤發生中的重要價值。另外，本發明人對包含正常對照的和骨髓瘤的切片組織陣列進行了免疫組織化學研究。通過抗ISCAN3抗體的免疫組化進行檢測，代表這個陣列的十個骨髓瘤患者樣品中的八個顯示強烈的ISCAN3陽性染色結果(圖2，上面和中間組)。正常的對照切片顯示沒有明顯的ISCAN3表達(圖2，下面組)，進一步強烈支持了 ZKSCAN3基因的重要性。。本發明通過骨髓瘤細胞轉染病毒液，包括sh3(3-#l病毒、非特異靶向RNA幹擾對照病毒、以及沒有轉染病毒的親本細胞對照組試驗。結果證實，感染非特異靶向RNA幹擾對照病毒的RPMI 8226細胞(該細胞高表達ISCAB3基因)，生長速率與親本細胞相同。相反，感染shI3-#l病毒的細胞，細胞生長明顯受到抑制(圖4)，其細胞內ISCAN3的表達水平出現明顯降低(圖3)。另外，為了更好的了解骨髓瘤細胞被sh3(3-#lRNA幹擾抑制的機制，本發明人還對sh3(3-#l病毒轉染的RPMI 8226細胞的細胞周期進行了分析。在高表達內源性ISCAN3 基因的RPMI 8226細胞中(圖1)，與非特異靶向RNA幹擾對照病毒轉染的RPMI 8226細胞相比，shZK3-#l轉染的RPMI 82 細胞顯示出Gl期數量有明顯的增長(圖5)，但是在S期和G2期數量減少，更加支持針對S(SCAN3基因的RNA幹擾在抑制骨髓瘤細胞增殖方面的作用。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為ISCAN3在骨髓瘤細胞系及正常漿細胞和B細胞對照中的表達結果；圖2為ISCAN3在骨髓瘤病人樣本中的表達結果；圖3為多個RNA幹擾小分子抑制ISCAN3的表達的結果；圖4為WST檢測法測定細胞的增殖速率的結果；圖5為細胞的生長周期測定結果；圖6為RPMI 8226細胞後地塞米松對細胞相對增殖速率的影響比較；圖7為RPMI 8226細胞後順鉬對細胞相對增殖速率的影響比較；圖8為shRNA抑制與shRNA不抑制對RPMI 8226細胞周期的影響；圖9為採用的pLVTHM載體的結構圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
實施例1 RT-PCR定量確定ZKSCAN3基因在腫瘤細胞中的表達。本實施例採用定量PCR來確定3(SCAN3在骨髓瘤細胞中的表達水平，具體步驟如下採用QIAGEN RNeasy試劑盒(產品目錄號74104)從骨髓瘤細胞製備總RNA，製備步驟嚴格按照產品說明書執行。其中，組織和細胞的勻漿採用QIAGEN的QIAshredder (產品目錄號79654)來進行。應用分光光度法測定所製備的RNA濃度和質量，取Iyg RNA進行cDNA合成。cDNA 合成試齊[J 盒採用 Invitrogen 公司的 SuperScript III First-Strand Synthesis Super Mix(產品目錄號18080-400)進行，合成步驟嚴格按照產品說明書執行。進行定量PCR反應時，將所合成的cDNA用無核酸酶去離子水作5倍稀釋，取1 μ 1 稀釋的 cDNA 於 0. 2ml MicroAmp Optical 反應管中，加入 1 μ 1 ZKSCAN3 TaqMan 探針、 10 μ 1 TaqMan Gene Expression Master Mix、以及 8 μ 1 無核酸酶去離子水。GAPDH 基因被作為對照物同時進行定量PCR反應。反應被置於Applied Biosystems的7900HT Fast Real-Time PCR System 中進行。應用此建立的定量PCR方法對代表性骨髓瘤細胞株中S(SCAN3的表達進行了測定，結果顯示ZKSCAN3在9個匪細胞系中都有表達，但在正常⑶19+B淋巴細胞以及正常 ⑶138+漿細胞中都無表達(圖1)。如圖1所示為ISCAN3在骨髓瘤細胞系中的表達。實施例2免疫組織化學確定ISCAN3基因在骨髓瘤病人中的表達本實施例通過SP法來確定ISCAN3在骨髓瘤病人中的表達。具體實驗步驟包括1)脫蠟、水化；2)PBS 洗 2 3 次各 5 分鐘；PBS 緩衝液(ρΗ7· 2 7. 4) =NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 1. 4mmol/L。3) 3 %甲醇- 溶液(用30 % H2O2和80 %甲醇溶液配製)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4) PBS洗2 3次各5分鐘；5)抗原修復，用於福馬林固定的石蠟包埋組織晶片。6) PBS洗2 3次各5分鐘；7)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多餘液體。8)滴加I抗50 μ 1，室溫靜置1小時或者4°C過夜或者37°C 1小時。9) 4°C過夜後需在37 °C復溫45分鐘。10) PBS洗3次各5分鐘；11)滴加II抗40 50 μ 1，室溫靜置，或37°C 1小時；12)11 抗中可加入 0. 05% 的 tween—20。13) PBS洗3次各5分鐘；14) DAB顯色5 10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15) PBS或自來水衝洗10分鐘；16)蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；結果發現80%的MM病人高表達ISCAN3，與此同時，正常骨髓細胞和組織均無可見的ISCAN3蛋白表達。這些結果支持了 ISCAN3在匪病理生物學中可能起重要作用的中心假設(圖2)。如圖2所示為ZKSCAN3在骨髓瘤病人樣本中的表達。本實施例為了進一步確證ISCAN3的表達，對MM病人的正常組織和MM癌變組織的組織晶片用抗ISCAN3抗體進行免疫組化染色，結果發現80%的MM病人高表達ISCAN3 (圖2上圖和中間圖)，與此同時，正常骨髓細胞和組織均無可見的ISCAN3蛋白表達(圖2下圖)。這些結果支持了 ZKSCAN3在MM病理生物學中可能起重要作用的中心假設。
實施例3 RNA幹擾序列的設計和製備方法(1) RNA幹擾序列的設計ZKSCAN3 基因的 RNA幹擾序列是利用 Dharmacon Custom siRNA Design iTool 進行設計的。該設計軟體提供的前6個序列中
權利要求
1.一種抑制多發性骨髓瘤轉錄因子ZKSCAN3表達水平的RNA幹擾靶點序列，其特徵在於所述RNA幹擾靶點序列是SEQ No 1的序列。
2.—種RNA幹擾片段的表達載體，其特徵在於所述表達載體克隆有權利要求1所述的 RNA幹擾靶點序列。
3.—種權利要求1所述的RNA幹擾靶點序列在製備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制多發性骨髓瘤轉錄因子ZKSCAN3表達水平的RNA幹擾靶點序列，其特徵在於所述RNA幹擾靶點序列是SEQNo1的序列。該RNA幹擾靶點序列提供了多發性骨髓瘤治療的新靶點，為未來的臨床治療手段提供新的選擇。
文檔編號A61P35/00GK102409054SQ20111035985
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者楊林 申請人:博生吉醫藥科技(蘇州)有限公司, 西安交通大學蘇州研究院