一種抗菌肽的製作方法

2023-05-04 08:02:26

本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種抗菌肽。
背景技術：
：抗生素作為一類重要的臨床用藥，自被應用以來已拯救了無數人的生命。但近年來，抗生素濫用及耐藥菌的層出不窮，特別是多藥耐藥菌(超級細菌)的出現成為當今世界醫療領域面臨的主要難題之一，也使得越來越多的國家開始尋求抗生素替代品。多肽類抗菌藥物因其抗菌活性高，不易產生耐藥性等原因，被認為將會在醫藥工業上有著廣闊的應用前景，也是人們解決耐藥菌、促進人類健康的希望所在。抗菌肽又稱抗微生物肽(antimicrobialpeptide)或肽抗生素(peptideantibiotics)，在動植物體內分布廣泛，是天然免疫防禦系統的一部分。抗菌肽和常規的抗生素不同，它是某個特定基因編碼的蛋白產物，因此具有獨特的抗菌機制。抗菌肽來源於多種生物,如哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌、細菌等,目前已發現的抗菌肽有2000多種。抗菌肽具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、螺旋體、寄生蟲的活性,而且具有不易產生耐藥的特性。近年來,抗生素的廣泛使用造成了多藥耐藥菌感染在臨床的蔓延,因而抗菌肽低耐藥性在預防與治療耐藥菌感染方面具有廣闊的應用前景,其研究及應用已成為當前生物製藥的熱點。同時作為最具潛力的抗生素替代品之一，抗菌肽在新型食品、藥品、護膚品以及化妝品防腐劑中的應用也越來越廣泛，具有良好的發展前景。雖然天然抗菌肽具有普遍的優點，但也存在著某些明顯的不足。例如，相當一部分天然的抗菌肽抑菌活性較低、穩定性較差、毒性較高，例如導致真核細胞發生溶血等；另外，部分天然抗菌肽對耐藥菌的抑制效果差，不能滿足實際應用的要求。技術實現要素：本發明針對上述問題，提供一種抗菌肽，該抗菌肽的序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X1-X2-Arg-Arg-Leu-Trp-Gly-Ala，其中，X1選自Lys、Arg、Trp、Leu、Phe、Tyr；X2選自Trp、Arg、Lys、Phe、Ser、His。實驗結果表明，本發明的抗菌肽對耐甲氧青黴素金葡菌(MRSA)、耐萬古黴素腸球菌(VRE)、耐碳青黴烯銅綠假單胞菌(CRPA)、耐藥肺炎克雷伯桿菌(KPN)有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，穩定性好，抗菌活性強，具有高效廣譜抑菌作用。根據本發明的一個方面，本發明提供了一種抗菌肽，其序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X1-X2-Arg-Arg-Leu-Trp-Gly-Ala，其中，X1選自Lys、Arg、Trp、Leu、Phe、Tyr；X2選自Trp、Arg、Lys、Phe、Ser、His；優選，X1為Arg；優選，X2為Lys。根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種組合物，含有本發明的抗菌肽。在本發明中，該組合物包括但不限於洗面奶、洗手液、沐浴液、洗髮香波、漱口水、牙膏、香皂、化妝品、女性護理洗液、洗衣皂、洗衣液、洗衣粉、洗滌靈、消毒液或潔廁液等。根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種織物，含有本發明的抗菌肽。在本發明中，織物包括但不限於衣物、床上用品、消毒紙巾、輔料或繃帶等。根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種食品或飼料，含有本發明的抗菌肽。根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種衛生巾、衛生護墊、尿不溼或尿墊，含有本發明的抗菌肽。根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，含有本發明的抗菌肽。根據本發明的另一個方面，本發明提供了本發明的抗菌肽在製備具有抑菌和或殺菌性能的產品中的應用。這些產品包括但不限於洗面奶、洗手液、沐浴液、洗髮香波、漱口水、牙膏、香皂、化妝品、女性護理洗液、洗衣皂、洗衣液、洗衣粉、洗滌靈、消毒液、潔廁液、衣物、床上用品、消毒紙巾、輔料、繃帶、衛生巾、衛生護墊、尿不溼、尿墊、食品、飼料等。根據本發明的另一個方面，本發明提供了本發明的抗菌肽在製備用於預防和/或治療感染的藥物中的應用。優選，所述感染由細菌、真菌、病毒、螺旋體或寄生蟲引起。根據本發明的另一個方面，本發明提供了本發明的抗菌肽用作防腐劑的應用。在本發明的上述組合物、食品或飼料、藥物組合物中，抗菌肽可以是使其具有抑菌和/或殺菌性能的活性成分，也可以僅用作防腐劑。如果抗菌肽為具有抑菌和/或殺菌性能的活性成分，其含量應當是抑菌和/或殺菌有效量的；如果抗菌肽用作防腐劑，其含量應當是防腐有效量的。本領域技術人員具有能力確定上述組合物、食品或飼料、藥物組合物中抗菌肽的合適含量。在本發明的上述織物、衛生巾、衛生護墊、尿不溼或尿墊中，抗菌肽為提供抑菌和/或殺菌性能的活性成分。本領域技術人員具有能力確定抗菌肽的合適含量。本領域技術人員知曉，在本發明的各種組合物、食品或飼料、藥物組合物中，可進一步含有常規的各種輔料和/或活性成分，並且能夠根據本領域的常規方法確定本發明的抗菌肽、各種輔料和火星成分的合適含量。本領域技術人員同樣知曉如何製備含有本發明的抗菌肽的織物、衛生巾、衛生護墊、尿不溼、尿墊，包括但不限於將織物、衛生巾、衛生護墊、尿不溼、尿墊，或者製造織物、衛生巾、衛生護墊、尿不溼、尿墊的材料在含有本發明抗菌肽的溶液中浸漬。本發明的抗菌肽可以採用本領域技術人員已知的方法(例如固相合成方法)製備得到，以及可以採用本領域已知的分離純化方法(例如高效液相色譜法)分離純化。附圖說明圖1為抗菌肽BT315的溶血活性圖2為抗菌肽BT315的質譜鑑定圖圖3為抗菌肽BT315的HPLC純度鑑定圖具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外，應理解，在閱讀了本發明所記載的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本發明所限定的範圍。實施例1.抗菌肽的合成與純化1.按照Fmoc固相多肽合成法合成X1為Arg、X2為Lys的抗菌肽BT315，合成步驟如下所示：1.1為保證多肽C-端為-CONH2結構，選用RinkAmide樹脂類作為高分子固相載體。1.2去Fmoc保護基團：1.2.1將所需高分子固相載體放入合成柱中，加入有機溶劑DMF(二甲基甲醯胺)浸泡10分鐘後排放；通入20％的哌啶/DMF溶液蓋過樹脂表面，通N2反應10分鐘後排放；重複一遍通入20％哌啶/DMF、通N2反應10分鐘後排放。1.2.2N2保護下，通入DMF溶劑5遍，以徹底洗滌上述樹脂。1.3縮合反應:胺基酸活化：稱取所需摩爾量3倍的Fmoc-保護胺基酸，溶解於DMF溶劑中，配製成其飽和溶液，加入等摩爾量1-羥基苯並三唑(HOBT)及二異丙基碳二亞胺(DIC)，如果需要再加入DMF直至完全溶解，形成胺基酸活化液。在N2環境下，胺基酸活化液通入合成柱中，與其中高分子樹脂充分接觸，使高分子樹脂上活性基團與活化的胺基酸發生(脫水)縮合反應生成肽鍵；室溫下縮合反應時間為30分鐘至1小時；反應後排放廢液；1.4按照多肽序列，重複步驟1.2至1.3操作直至完成整個肽鏈的合成。1.5裂解及側鏈保護基團的移除：1.5.1配製三氟乙酸(TFA)混合裂解液「K」，配方如下：三氟乙酸(TFA)(82.5％v/v)苯酚(phenol)(5％v/v)水(water)(5％v/v)苯基甲基硫醚(thioanisole)(5％v/v)1,2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)(2.5％v/v)1.5.2實施步驟：1.5.2.1按照步驟1.2所敘，先除去與固相載體相連的多肽N-端的Fmoc保護基團，用二氯甲烷洗去殘餘DMF，乾燥，轉入一乾燥玻璃容器中；1.5.2.2導入上述TFA裂解液「K」(30ml/克樹脂)，在室溫下溫和攪拌反應4小時。1.5.2.3反應完畢後，將樹脂濾出，裂解液直接進入事先(-20℃)冷卻的甲基異丁基醚中(30ml:5mlv/v)沉澱；1.5.2.4高速離心(4000rmp，4℃)5分鐘，棄去清液，用95％TFA溶解瓶底沉澱，再倒入冷卻的甲基異丁基醚中(30ml:5mlv/v)沉澱；1.5.2.5棄去清液，通入N2至甲基異丁基醚基本揮發，用少量的去離子水溶解沉澱物，經-80℃冷凍，在冷凍乾燥機上乾燥後，得到粉狀微黃色粗肽。2.多肽的分析和純化：由島津LC-10ATVP型輸液泵、島津DGU-14A型脫氣機、島津SPD-10A型紫外檢測器、Rheodyne7725I進樣閥、PhenomenexNucleosilC18色譜柱(250×4.6mmI.D.)、WDL-95型色譜工作站構成HPLC分離系統。樣品進樣後以1.0mL/min的流速0-30分鐘內，含0.1％三氟乙酸的5％乙腈水溶液至含0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液線性梯度淋洗，UV220nm檢測的色譜條件，進行分離監測。色譜峰流出液收集於離心管留待隨後的質譜分析。質譜所用儀器為BrukerDaltonics公司BIFLEX型MALDI-TOF質譜儀，氮雷射器，雷射波長337nm，採用延時(引出Delayedextraction)和反射(Reflection)的工作方式，加速電壓19.5kV,反射電壓20kV，延時引出電壓14.5kV，延時時間為50～200ns，正離子檢測。將色譜峰收集液與適量的基質溶液混合後取約1微升溶液，滴加在樣品靶上，待溶劑揮發樣品結晶後，送入質譜儀進行質譜分析，累加30次單次掃描信號得到質譜圖。圖2為其質譜鑑定圖，圖3為其HPLC純度鑑定圖。抗菌肽BT315的純度大於98％，含19個胺基酸，分子量2584Da，等電點是12.55。按照上述相同的方法製備得到了X1為Arg、X2為Arg；X1為Phe、X2為Trp的多肽。上述抗菌肽由寧波康貝生化有限公司合成。實施例2.抗菌肽BT315的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定用無菌培養液將實施例1製備得到的抗菌肽BT315倍比稀釋製成1mL濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL的抗菌肽溶液。將受試菌株接種至2mL培養液中，37℃培養8h，用無菌培養液稀釋成菌落數約為5×105CFU/mL左右的菌液。取1mL的菌液分別加至上述製備好的抗菌肽溶液中，此時，各溶液中抗菌肽濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。同樣的方法製備抗生素萬古黴素及亞胺培南溶液，作為陽性對照；另設不含藥組作為陰性對照。置37℃普通空氣孵箱中孵育16～20h,觀察抗菌效果，無細菌生長的最低抗菌肽濃度為最小抑菌濃度MIC值；依次將未見細菌生長各管培養物分別吸取0.1mL傾倒於營養瓊脂平皿上，37℃再培養18h，平皿上菌落小於5個的最低抗菌肽濃度即為最小殺菌濃度MBC值。結果見下表1。表1抗菌肽BT315的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)其中，MRSA為耐甲氧青黴素金葡菌，VRE為耐萬古黴素腸球菌，這兩種為革蘭氏陽性菌；CRPA為耐碳青黴烯銅綠假單胞菌，KPN為耐藥肺炎克雷伯桿菌，這兩種為革蘭氏陰性菌。從上表可以看出，抗菌肽BT315對革蘭氏陰性和陽性菌都有較好的抑菌和殺菌效果，其中對耐藥金黃色葡萄球菌的效果最好。實施例3.pH值對抗菌肽BT315的MIC值的影響分別將含有不同樣品濃度的培養基的pH調整至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,室溫靜置1h後，調節pH值至7.0，再用無菌培養基將其體積調整一致，按實施例2所述方法測定MIC值。結果見下表2。表2抗菌肽BT315在不同pH下的最小抑菌濃度(MIC)從上表可以看出抗菌肽BT315在不同pH值時抗菌活性比較穩定，其中在pH中性時活性最高。這表明抗菌肽BT315穩定性較好。實施例4.抗菌肽BT315的溶血活性檢測按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄92頁製備2％紅細胞混懸液。取新鮮兔全血約20ml，加入含玻璃珠的錐形瓶中振搖10分鐘，或用玻璃攪動血液，除去纖維蛋白，使成脫纖血液。加入0.9％氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，以每分鐘1500～2000轉離心5分鐘，除去上清液，沉澱的紅細胞再用0.9％氯化鈉溶液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9％氯化鈉溶液配成2％的紅細胞混懸液。取1mL紅細胞混懸液分別加入7種不同濃度的抗菌肽BT315溶液，輕混後置37℃的恆溫箱中溫浴。陰性對照組用生理鹽水，陽性對照組用蒸餾水，處理同上。3h後離心，取上清，測545nm處吸光值，計算溶血率(％)＝(試驗管吸光度-陰性對照管吸光度)/(陽性對照管吸光度-陰性對照管吸光度)×100％，以抗菌肽BT315樣品濃度為橫坐標、溶血率為縱坐標作曲線。表3不同濃度BT-315的溶血率樣品濃度3ug/ml10ug/ml30ug/ml100ug/ml300ug/ml600ug/ml1000ug/ml溶血率0.00％0.14％0.69％2.76％14.23％48.20％66.85％由表3和圖1可見，抗菌肽BT315的溶血活性比較低，在樣品濃度遠超樣品MIC及MBC濃度的情況下，溶血率依舊很低，表明其具有較好的安全性。以上，對本發明的實施方式進行了說明。但是，本發明不限定於上述實施方式。凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp