一種判斷曲妥珠單抗輔助治療乳腺癌療效的試劑盒及應用的製作方法

2023-04-23 12:58:56 6

一種判斷曲妥珠單抗輔助治療乳腺癌療效的試劑盒及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種判斷曲妥珠單抗輔助治療乳腺癌療效的試劑盒及應用，該試劑盒包括能夠用於檢測HER2基因中rs1058808位點和/或rs2517954位點的基因型的試劑。發明人通過對患者進行基因分型，分析SNP位點基因型同曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的相關性，發現根據rs1058808和/或rs2517954位點的基因型，可以判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效。本發明的試劑盒的開發為HER2陽性乳腺癌患者治療方案的確定提供了一種可靠、靈敏的方式。
【專利說明】一種判斷曲妥珠單抗輔助治療乳腺癌療效的試劑盒及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫學領域，涉及一種判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌 患者的療效的試劑盒以及SNP在製備該試劑盒中的用途。

【背景技術】
[0002] 乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，大多數國家在過去20年中乳腺癌發病率 持續增長。據世界衛生組織國際癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC)統計，2008年全球女性乳腺癌新發病例達138萬，佔全部女性惡性腫瘤發病 的22. 9% ;46萬女性因乳腺癌死亡，佔所有女性惡性腫瘤死亡的13. 7%，佔所有女性死亡 的1. 7%。中國女性乳腺癌世界標準人口調整發病率為21. 6/10萬，死亡率為5. 7/10萬。 我國2003-2007年全國32個腫瘤登記點女性乳腺癌合計發病率為41. 64/10萬，居女性癌 症發病的第1位；合計死亡率為9. 63/10萬，居女性癌症死因的第6位。研究和了解中國女 性乳腺癌的流行因素和遺傳規律，並採取相應的幹預措施，對降低乳腺癌的發病率具有重 要意義。
[0003] 乳腺癌是一種高度異質性疾病，在組織形態、分子表型、臨床表現、治療效果及預 後等各方面都存在很大的差異。人類基因組計劃的研究結果表明，不同個體的基因99. 9% 是相同的，僅僅在序列上有極小（〇. 1% )的遺傳差異。單核苷酸多態（SNP)是指在基因組 DNA序列中單個核苷酸的變異，一般指頻率大於1 %的單核苷酸變異，是最常見的遺傳變異 類型。SNP在人類基因組中廣泛存在，佔所有已知多態性的90%以上，人類基因組中SNP總 量約為3*10 6個，大概每1000個鹼基就有一個SNP。研究SNP可以幫助解釋不同群體和個 體疾病易感性、個體間表型、對藥物的耐受性及對環境因子的反應的差異。因此乳腺癌SNP 導致的遺傳變異如何決定了乳腺癌的表型及轉歸值得我們深入研究。
[0004] 在乳腺癌患者中，有20%-30%存在人表皮生長因子受體2(human印idermal growth factor receptor 2, HER2)基因的擴增及其編碼蛋白的過度表達[Slamon DJ et al.，1987]，且HER2過度表達常提示乳腺癌預後不良[Tandon AK et al.，1989]。曲妥珠單 抗是人源化抗HER2單克隆抗體，已廣泛用於HER2陽性乳腺癌的臨床治療，單藥治療HER2 陽性轉移性乳腺癌的有效率為35%。曲妥珠單抗單藥或聯合化療可延長HER2陽性轉移性 乳腺癌病人的總生存期，改善這類病人的預後。NSABP B-31、NCCTG N983UBCIRG 006和 HERA 4個大型隨機III期臨床研究的結果顯示，曲妥珠單抗可使HER2陽性早期乳腺癌患者 輔助化療後的復發風險降低52 %，死亡風險降低33 %。2006年FDA批准曲妥珠單抗輔助治 療HER2陽性早期乳腺癌。
[0005] 本發明通過SNP分析，從基因表型分型上分析其與曲妥珠單抗治療的HER2陽性早 期乳腺癌的臨床特徵及預後是否相關。採用病例-對照研究的方法，深入研究這些關鍵基 因的多態性與乳腺癌病理分型及治療之間的關係，尋找有意義的分子標記物，為判斷預後、 篩選高危復發人群、選擇個體化治療提供依據，從而最終指導臨床。


【發明內容】

[0006] 發明人發現了 rsl058808位點和/或rs2517954位點與曲妥珠單抗輔助治療HER2 陽性乳腺癌患者的療效的相關性，並據此開發了能夠判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性 乳腺癌患者療效的試劑盒，和rsl058808位點和/或rs2517954位點在製備曲妥珠單抗輔 助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的試劑盒中的應用。
[0007] -方面，本發明提供了用於判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療 效的兩個SNP位點，所述的SNP位點是rsl058808位點和rs2517954,當rsl058808位點基 因型是CC時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效差，應改變患者的治療方 案，當rsl058808位點基因型為CG或GG時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的 療效好，患者不易復發；當rs2517954位點基因型是CC時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性 乳腺癌患者的療效好，患者不易復發，當rs2517954位點基因型是CT或TT時，曲妥珠單抗 輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效差，應改變患者的治療方案。
[0008] 另一方面，本發明提供了用於檢測SNP位點基因型的試劑，所述試劑可以為採用 本領域已知的任何技術檢測SNP所需的試劑，只要其能夠檢測樣本中rsl058808位點和/ 或rs2517954位點的基因型即可。
[0009] 本領域技術人員已知，可以用多種技術在DNA水平上體外檢測CETP基因序列的多 態性位點。可以經與用放射性標記的反義RNA或DNA探針與擴增後的DNA序列雜交，以鑑 別位點多態性。也可以基於已知的核苷酸順序的改變，合成正常的和具有特定多態性的PCR 引物，在聚合酶鏈式反應（PCR反應）的底物中加入螢光標記的核苷酸，根據反應產物中有 無螢光出現，確定在擴增所用的引物中有無鹼基變化，從而檢測特定多態性。通過DNA直接 測序可以直接揭示對照基因和攜帶具有特定多態性基因之間的序列差異。當與PCR結合使 用時，這種方法的靈敏性大大提高。各種DNA及DNA片段的核苷酸序列的測定也可用常規方 法如雙脫氧鏈終止法。此外，核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒或自動測序儀等。常 規的自動測序法用放射性標記或螢光標記來確定核酸序列。也可以採用限制性片段多態性 分析（RFLP)來體外檢測CETP基因序列的多態性位點。
[0010] 本發明提供的用於檢測SNP位點基因型的試劑，包括用於擴增SNP位點在內的核 苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測SNP位點基因型的單鹼基擴展 引物。對於rsl058808位點來說，用於擴增rsl058808位點在內的核苷酸序列的引物序列 如下：正向引物 5' -ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3' ；反向引物 5' -ACGTTGGATGAAAACG TCTTTGACGACCCC-3' ；對於rs2517954位點來說，所述用於擴增所述rs2517954位點在內的 核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5' -ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3' ；反向引 物 5'-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3'。對於 rsl058808 位點來說，所述單鹼基擴展 引物序列為：5' -GCCACTCTGGAAAGG-3' ；對於rs2517954位點來說，所述單鹼基擴展引物序 列為：5' -aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3'。
[0011] 又一方面，本發明提供了用於檢測SNP位點基因型的試劑盒，該試劑盒包括採用 本領域已知的任何技術檢測SNP所需的試劑，只要其能夠檢測樣本中rsl058808位點和/ 或rs2517954位點的基因型。
[0012] 本發明提供的用於檢測SNP位點基因型的試劑盒包括用於擴增SNP位點在內的核 苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測SNP位點基因型的單鹼基擴展 引物。對於rsl058808位點來說，用於擴增rsl058808位點在內的核苷酸序列的引物序列 如下：正向引物 5' -ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3' ；反向引物 5' -ACGTTGGATGAAAACG TCTTTGACGACCCC-3' ；對於rs2517954位點來說，所述用於擴增所述rs2517954位點在內的 核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5' -ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3' ；反向引 物 5'-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3'。對於 rsl058808 位點來說，所述單鹼基擴展 引物序列為：5' -GCCACTCTGGAAAGG-3' ；對於rs2517954位點來說，所述單鹼基擴展引物序 列為：5' -aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3'。
[0013] 本發明提供了用於判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的試劑 盒，該試劑盒的判斷原理是利用試劑盒中的試劑檢測rsl058808位點和/或rs2517954位 點的基因型，根據所測患者的上述SNP位點的基因型判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳 腺癌患者的療效。當rsl058808位點基因型是CC時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺 癌患者的療效差，應改變患者的治療方案，當rsl058808位點基因型為CG或GG時，曲妥珠 單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效好，患者不易復發；當rs2517954位點基因型是 CC時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效好，患者不易復發，當rs2517954位 點基因型是CT或TT時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效差，應改變患者 的治療方案。
[0014] 該試劑盒中包括採用本領域已知的任何技術檢測SNP基因型所需的試劑，只要其 能夠檢測樣本中rsl058808位點和/或rs2517954位點的基因型即可。本發明提供的用於 判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的試劑盒包括用於擴增SNP位點在 內的核苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測SNP位點基因型的單鹼 基擴展引物。對於rsl058808位點來說，用於擴增rsl058808位點在內的核苷酸序列的引 物序列如下：正向引物 5' -ACGTTGGATGACCTGCTGGTGCCACTCTG-3' ；反向引物 5' -ACGTTGGATG AAAACGTCTTTGACGACCCC-3 ' ；對於rs2517954位點來說，所述用於擴增所述rs2517954位點 在內的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5' -ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3' ； 反向引物 5' - ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC-3'。對於 rsl058808 位點來說，所述單 鹼基擴展引物序列為：5' -GCCACTCTGGAAAGG-3' ；對於rs2517954位點來說，所述單鹼基擴 展引物序列為：5' -aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3'。
[0015] 本發明還提供了 rsl058808位點和/或rs2517954位點在製備檢測SNP位點基因 型的試劑中的應用。所述試劑可以為採用本領域已知的任何技術檢測SNP基因型所需的試 齊U，只要其能夠檢測樣本中rsl058808位點和/或rs2517954位點的基因型即可。
[0016] 本發明還提供了 rsl058808位點和/或rs2517954位點在製備檢測SNP位點基因 型的試劑盒中的應用。所述試劑盒中包括能夠檢測SNP位點基因型的試劑。在一個具體 的實施方案中，所述試劑包括用於擴增SNP位點在內的核苷酸序列的引物和/或能夠使用 MassARRAY Sequenom檢測SNP位點基因型的單鹼基擴展引物。對於rsl058808位點來說，用 於擴增rs 1058808位點在內的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5'-ACGTTGGATGACCTG CTGGTGCCACTCTG-3' ；反向引物 5' -ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3' ；對於 rs2517954 位點來說，所述用於擴增所述rs2517954位點在內的核苷酸序列的引物序列如下：正向引 物 5 ' -ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3 ' ；反向引物 5 ' -ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGT GAC-3'。對於rsl058808位點來說，所述單鹼基擴展引物序列為：5'-GCCACTCTGGMAGG-3';對 於rs2517954位點來說，所述單鹼基擴展引物序列為：5' -aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3'。
[0017] 本發明還提供了 rsl058808位點和/或rs2517954位點在製備用於判斷曲妥珠 單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的試劑盒中的應用。所述試劑盒的判斷原理 是利用試劑盒中的試劑檢測rsl058808位點和/或rs2517954位點的基因型，根據所測患 者的上述SNP位點的基因型判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效。當 rsl058808位點基因型是CC時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效差，應改 變患者的治療方案，當rsl058808位點基因型為CG或GG時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽 性乳腺癌患者的療效好，患者不易復發；當rs2517954位點基因型是CC時，曲妥珠單抗輔助 治療HER2陽性乳腺癌患者的療效好，患者不易復發，當rs2517954位點基因型是CT或TT 時，曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效差，應改變患者的治療方案。
[0018] 本發明還提供了用於檢測rsl058808位點和/或rs2517954位點基因型的試劑在 製備用於檢測rsl058808位點和/或rs2517954位點基因型的試劑盒中的應用。
[0019] 本發明還提供了用於檢測rsl058808位點和/或rs2517954位點基因型的試劑在 製備用於判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的試劑盒中的應用。
[0020] 本發明優點和有益效果如下：首次發現HER2基因中rs 1058808位點和/或 rs2517954位點與曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的相關性，通過檢測上 述SNP位點的基因型即可判斷HER2陽性乳腺癌患者對曲妥珠單抗輔助治療的敏感性，為醫 生確定患者的治療方案提供一種可靠、靈敏的方法。
[0021] 具體的實施方式
[0022] 下面通過具體的實施例進一步說明本發明，應注意，如無特別指出，本發明的實施 例僅用於解釋本發明，並不意味著限定本發明的保護範圍。
[0023] 1.研究對象：研究納入的對象為中國漢族女性，中國醫學科學院腫瘤醫院內科收 治的經曲妥珠單抗治療的HER2陽性早期乳腺癌患者，且收集有血液標本的患者共190例。 所有研究對象均有可供病理組織學或細胞學診斷的標本，並經我院病理科醫生閱片診斷， 無第二原發腫瘤。HER2陽性定義為免疫組化3+或螢光原位雜交（FISH)方法檢測HER2基 因擴增。ER和PR根據免疫組化進行判斷。腫瘤分期按照2002年美國腫瘤研究聯合委員會 (AJCC)乳腺癌分期標準（第6版）進行。回顧性查閱患者在醫院收治的病歷記錄，詳細記 錄患者腫瘤類型、分期、術後化療方案、復發及轉移情況，採用門診隨訪及電話隨訪的方式 對入組患者進行隨訪。
[0024] 2.用藥方法：曲妥珠單抗的應用為3周方案（首次8mg/kg，以後每次6mg/kg)或 與化療同時進行時採用每周方案（首次4mg/kg，以後每次2mg/kg)，曲妥珠單抗用藥時間為 1年。
[0025] 3. HER2基因 SNP位點的選擇：在國際人類基因組單體型圖計劃提供的SNP公共數 據庫（http://hapmap:ncbL· nlm· nih. gov/)中檢索HER2基因，首先選取已知漢族人群中信 息的SNP位點，再以其中的標籤SNP作為進一步分型的候選多態位點，然後結合最小基因頻 率（MAF)以及哈迪-溫伯格平衡P值（HWPval)等統計特徵對候選標籤SNP進行篩選以 得出最佳的標籤SNP。選取要求：MAF>0. 1且HWPval>0. 1。針對HER2基因進行了基於標籤 SNP為主體的全面SNP位點選擇，並且將與之關聯的部分功能SNP替換進去，HER2基因的候 選SNP位點信息如表1所示：
[0026] 表1 HER2基因候選SNP位點信息
[0027]

【權利要求】
1. 一種檢測用於判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者療效的SNP marker的 基因型的試劑，其特徵在於，所述SNP marker是rsl058808位點和/或rs2517954位點。
2. 根據權利要求1所述的試劑，其特徵在於，對於rsl058808位點來說，所述試劑包括 用於擴增所述rsl058808位點在內的核苷酸序列的引物；對於rs2517954位點來說，所述試 劑包括用於擴增所述rs2517954位點在內的核苷酸序列的引物。
3. 根據權利要求2所述的試劑，其特徵在於，對於rsl058808位點來說，所述用於擴增 所述rs 1058808位點在內的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5 '-ACGTTGGATGACCTGCT GGTGCCACTCTG-3' ；反向引物 5' -ACGTTGGATGAAAACGTCTTTGACGACCCC-3' ；對於 rs2517954 位 點來說，所述用於擴增所述rs2517954位點在內的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5 ' -ACGTTGGATGCCCCATCTGTAAAACTGGGA-3，；反向引物 5，-ACGTTGGATGTTGAGCACTCACTGTGTGAC -3，。
4. 根據權利要求2所述的試劑，其特徵在於，對於rsl058808位點來說，所述試劑還 包括能夠使用MassARRAY Sequenom檢測rsl058808位點基因型的單鹼基擴展引物；對於 rs2517954位點來說，所述試劑還包括能夠使用MassARRAY Sequenom檢測rs2517954位點 基因型的單鹼基擴展引物。
5. 根據權利要求4所述的試劑，其特徵在於，對於rsl058808位點來說，所述單鹼基擴 展引物序列為：5' -GCCACTCTGGAAAGG-3' ；對於rs2517954位點來說，所述單鹼基擴展引物 序列為：5' -aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3'。
6. 根據權利要求1所述的試劑，其特徵在於，對於rsl058808位點來說，所述試劑包 括能夠使用MassARRAY Sequenom檢測rsl058808位點基因型的單鹼基擴展引物；對於 rs2517954位點來說，所述試劑包括能夠使用MassARRAY Sequenom檢測rs2517954位點基 因型的單鹼基擴展引物。
7. 根據權利要求6所述的試劑，其特徵在於，對於rsl058808位點來說，所述單鹼基擴 展引物序列為：5' -GCCACTCTGGAAAGG-3' ；對於rs2517954位點來說，所述單鹼基擴展引物 序列為：5' -aTCAAAGGGTGTGATAAAAATTAC-3'。
8. -種檢測權利要求1所述的SNP marker基因型的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒 包括權利要求2所述的試劑和/或權利要求6所述的試劑。
9. 一種用於判斷曲妥珠單抗輔助治療HER2陽性乳腺癌患者的療效的試劑盒，其特徵 在於，所述試劑盒包括權利要求2所述的試劑和/或權利要求6所述的試劑。
10. 權利要求1所述的SNP marker在製備權利要求2和/或權利要求6所述的試劑、 和/或權利要求8或權利要求9所述的試劑盒中的用途，權利要求2至7中任一項所述的 試劑在製備權利要求8或權利要求9所述的試劑盒中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152556SQ201410386781
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】徐兵河, 馬飛, 郭繼紅 申請人:中國醫學科學院腫瘤醫院