一種檢測轉綠色螢光蛋白基因及啟動子的pcr方法

2023-04-24 05:04:01

專利名稱:一種檢測轉綠色螢光蛋白基因及啟動子的pcr方法
技術領域：
本發明涉及一次同時檢測轉基因羊兩種基因結構的PCR方法，特別針對攜帶兩種外源基因的轉基因羊的檢測，與常規方法相比，雙重PCR方法不僅可節約樣本材料，而且可以降低檢測成本。
背景技術：
轉基因動物是指人工地把外源基因導入動物的受精卵(或早期胚胎細胞)，使之與動物本身的基因組整合在一起，因而外源基因能隨細胞的分裂而增殖，並能穩定地遺傳給下一代的一類動物。開展家畜轉基因新品種培育，需高度重視轉基因家畜的生物安全性。因此，對轉基因羊外源基因結構的檢測是進行安全評價必不可少的。轉基因羊外源基因結構檢測包括調控元件如啟動子、增強子、標記基因、報告基因等的檢測和目的基因檢測。
綠色突光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一類存在於腔腸動物體內的生物發光蛋白，其內源性螢光基團在受到紫外或藍光激發時可發現清晰可見的綠光；由於檢測方便，對生物體基本沒有毒性，在很多領域已有取代LacZ，螢光素酶等傳統標記方法的趨勢，在製作轉基因動物過程中更是如此。由於直接檢測外源基因在動物體內的表達和分布常常是困難的，因此在製作轉基因動物時，一般在目的基因旁邊加上一段表達產物易於檢測的標記基因(如GFP)，由於GFP發光時不需底物，能對活體進行檢測等優點，已作為一種報告基因得到廣泛應用。
啟動子是指位於轉錄起始位點上遊、確保轉錄精確而有效起始的DNA序列，是結合RNA聚合酶並形成轉錄起始複合物的區域，通常還包括促進這一過程的調節蛋白質結合位點。CMV啟動子可在多數動物細胞和組織中高效表達，在轉基因上已被用於多種功能蛋白或標記基因的啟動子，因此對轉基因羊進行標記基因GFP和CMV啟動子的檢測非常必要。
文獻檢索披露；①馮湘玲等在《生命科學研究》2001，5 (4):339-341.)發表的「一種快速檢測啟動子特異性的方法」的論文，揭示了利用綠色螢光蛋白(GFP)的特性，與不同的基因啟動子連接，並運用顯微注射技術製備轉基因蟾。根據GFP表達情況，可初步判斷啟動子的特異性。②紀喜文等在《化學與生物工程》2010，27(9).)上發表的「一種新型轉基因斑馬魚毒物檢測系統的建立」的論文，揭示了利用轉基因技術成功建立一套綠色螢光蛋白(GFP)轉基因斑馬魚毒物檢測系統。選用芳香烴反應元件AH RDtk片段和pFRMwg+plasmid載體，通過酶切、連接和PCR鑑定等程序成功構建載體DNA，然後通過顯微注射轉入斑馬魚，經不斷傳代和篩選得到穩定的、受芳香烴反應元件AHRDtk控制的轉基因斑馬魚。③王趁芳等在《畜牧獸醫學報》.2009，40 (2):185-190.)上發表的「轉基因小鼠的多重PCR快速檢測技術「的論文，揭示了採用鹼裂解法快速提取鼠尾基因組DNA，用PCR方法檢測其中的外源基因結構如cytomegalovirus (CMV)啟動子、hGH polyA終止子及目的基因跨膜蛋白66 ( Transmembrane protein 66,Tmem66),篩選到陽性樣品。優化了多重PCR引物退火溫度及緩衝液濃度，並探討了擴增速率對多重PCR的影響。④專利名稱為《轉紅色螢光蛋白基因唐魚聚合酶鏈式反應檢測方法》，公開號為CN 101906477A的發明，公開了它根據轉紅色螢光蛋白基因唐魚外源紅色螢光蛋白基因序列設計引物，建立了快速、有效的能特異性檢測轉紅色螢光蛋白基因唐魚的PCR方法。披露的已有技術與本發明有顯著差異。[0006]本發明通過慢病毒卵周隙注射，製備了轉綠色螢光蛋白基因綿羊，採用苯酚氯仿抽提法快速提取羊尾基因組DNA，用雙重PCR方法同時檢測標記基因GFP和其中的CMV啟動子，得到很好的擴增效果；此轉基因檢測技術的標準化也將為我國轉基因羊的檢測、生物安全評價、相關法律法規的制定提供科學依據和技術支撐。

發明內容
本發明的目在於:提供檢測轉基因羊的PCR方法，特別針對GFP基因及CMV啟動子的特異檢測；雙重PCR方法為我國轉基因羊和轉基因羊生物安全評價提供科學依據。
本發明的目的是這樣實現的:一種檢測轉基因羊綠色螢光蛋白基因及啟動子的PCR方法，針對轉基因羊，依據GFP基因序列和pLEX載體CMV啟動子序列，設計兩對特異性引物，其一為GFP-上遊引物:TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ；GFP-下遊引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二為 CMV-上遊引物:TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV_ 下遊引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ;以轉基因羊基因組DNA為模板，擴增的GFP基因的片段為595bp ;擴增的CMV基因的片段為421bp ；
其中DNA模板的提取:
1)取羊臍帶組織的碎塊lOOPg，依次加入0.5mL的裂解液；10mmol/LTriS-Cl，pH7.5 ；lmmol/L EDTA, pH7.5 ；0.1% (m/V) SDS ;消化前加入 l00mg/mLRNA 酶 15μ1、lOmg/mL 蛋白酶K 15μ1，不停地搖動，在55°C下消化58_63分鐘待用；其中裂解液的配方:取10mmol/LTris-Cl,pH7.5 ；lmmol/L EDTA，pH7.5 ；0.1% (m/V) SDS ;lOOmg/mLRNA 酶；10mg/mL 蛋白酶K，置於試劑瓶中混合均勻即可；
2)取上步消化物，加入0.5mL的酚、氯仿、異戊醇的混合液，其混合比為25:24:1，混合均勻後置於室溫下靜置4-5分鐘，12000轉/分鐘、離心8-10分鐘，取上清液，用0.5mL氯仿抽提一次，室溫下靜置5-6分鐘，12000轉/分鐘、離心10-12分鐘待用；
3)取上步上清液加入兩倍體積的無水乙醇，室溫靜置7-10分鐘，沉澱DNA；經12000轉/分鐘、離心9-11分鐘，用ImL 70%乙醇洗滌I次；12000轉/分鐘、離心1.5-2.0分鐘，棄上清，室溫靜置乾燥7-12分鐘；加入50μ1 TE，即為10mmol/L Tris-Cl, pH7.4 ；1 mmol/L EDTA, pH 8.0 ;溶解 DNA，4°C貯存備用；
其中PCR反應體系:
50μ1 反應體系為:10XPCR Taq Buffer 5μ1 ; 25mM MgCl24μ1
;dNTP Mix (2.5mM each ) 5μ1 ;引物(10ρΜ/μ1)各 0.5μ1; DNA模板 lOOPg/mL 6μ1 ;TaqDNA Polymerse 1.25Μ-1 ; Nuclease-free Water 26.75M-1;總體積為 50μ1 ；
其中PCR反應條件:
94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個循環；72°C延伸7分鐘；
其中瓊脂糖凝膠電泳檢測:
PCR擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80V，電泳結束、凝膠成像，在595bp和421bp處出現清晰條帶。
本發明提供的雙重PCR檢測方法:包括(I)引物設計根據綠色螢光蛋白(GFP)基因序列和PLEX載體的CMV啟動子序列設計兩對特異性引物GFP-上遊引物、GFP-下遊引物；CMV-上遊引物、CMV-下遊引物:以轉基因羊基因組DNA為模板，擴增GFP基因，片段為595bp ;擴增CMV基因，片段為421bp ; (2)模板DNA的提取；(3)PCR反應體系及反應條件設計；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為80V，凝膠成像等技術特徵。
本發明的構思是將單一的PCR方法設計為雙重的PCR方法，針對GFP基因及CMV啟動子的特異檢測，十分高效精準，具有重要的實用價值，彰顯技術進步。


本發明結合附圖作進一步的說明。
附圖為GFP檢測結果的對照基因片段圖；
如圖所述:M: 150bp Marker;水:陰性對照；+:非轉基因羊陽性對照；1，2, 4, 6, 8為轉GFP基因陽性羊；3，5，7為轉GFP基因陰性羊。
具體實施方式
實施例
對轉基因羊體內綠色螢光 蛋白基因及啟動子同時進行檢測的雙重PCR方法分步實施:
(一)引物設計
根據綠色螢光蛋白(GFP)基因序列和pLEX載體的CMV啟動子序列設計特異性引物GFP-上遊引物、GFP-下遊引物；CMV-上遊引物、CMV-下遊引物:
GFP-上遊引物:TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC GFP-下遊引物 AGGACCATGTGATCGCGCTTCT CMV-上遊引物:TCCCATAGTAACGCCAATAG CMV-下遊引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA
以轉基因羊基因組DNA為模板擴增GFP基因，以轉基因羊基因組DNA為模板擴增CMV基因，非轉基因羊基因組DNA為模板無擴增片段出現。
(二)模板DNA的提取
(I)取待檢測的轉基因羊臍帶組織約IOOPg剪碎後(同時以非轉基因羊臍帶組織做對照)，加入0.5mL的裂解液，其配方為10mmol/LTris-Cl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)，pH7.5 ;lmmol/L EDTA (乙二胺四乙酸);,pH7.5,0.1% (m/V) SDS(十二烷基磺酸鈉);臨用前加入lOOmg/mLRNA酶15μ1 ;10mg/mL蛋白酶K 15微升，在55°C下消化I小時，其間不時輕輕搖動；
(2)取上述消化物，加入0.5mL的按25:24:1比例混合的酚、氯仿、異戊醇混合物，顛倒混勻，室溫下靜置5分鐘後，12000轉/分鐘、離心10分鐘，取上清液，再用0.5mL氯仿抽提一次，室溫下靜置5分鐘後，12000轉/分鐘、離心10分鐘，取上清液；
(3)取上部上清液加入兩倍體積的無水乙醇，室溫靜置10分鐘沉澱DNA，12000轉/分鐘、離心10分鐘；
(4)用lmL70%乙醇洗滌I次，12000轉/分鐘離心2分鐘，吸去上清，室溫靜置乾燥10分鐘，加入50μ1 TE (10mmol/L Tris-Cl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)，pH7.4 ；1 mmol/LEDTA (乙二胺四乙酸)，pH 8.0)溶解DNA，4°C貯存備用。
(三)PCR反應體系
50μ1 反應體系為:10XPCR Taq Buffer 5μ1 ; 25mM MgCl24μ1
;dNTP Mix(2.5mM each ) 5μ1 ;引物(10ρΜ/μ1)各 0.5μ1;模板DNA(lOOPg/mL) 6μ1 ;TaqDNA Polymerse 1.25Μ-1 ; Nuclease-free Water 26.75M-1;總體積為 50μ1。
(四)PCR反應條件
94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個循環；72°C延伸7分鐘。
(五)瓊脂糖凝膠電泳檢測
PCR擴增產物在2 %的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80V，電泳結束後，凝膠成像顯示在595bp和421bp處出現清晰條帶。
所述的方法，選用的Tris-Cl為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，EDTA為乙二胺四乙酸，SDS為十二烷基磺酸鈉，GFP為綠色螢光蛋白，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；RNA酶購自上海生工生 物工程有限公司；蛋白酶K購自Amerisco公司。
權利要求
1.一種檢測轉基因羊綠色螢光蛋白基因及啟動子的PCR方法，其特徵在於:針對轉基因羊，依據GFP基因序列和pLEX載體CMV啟動子序列，設計兩對特異性引物，其一為GFP-上遊引物:TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ;GFP-下遊引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二為 CMV-上遊引物:TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下遊引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ；以轉基因羊基因組DNA為模板，擴增的GFP基因的片段為595bp ;擴增的CMV基因的片段為421bp ； 其中DNA模板的提取: O取羊臍帶組織的碎塊lOOPg，依次加入0.5mL的裂解液；10mmol/LTriS-Cl，pH7.5 ；lmmol/L EDTA, pH7.5 ；0.1 % (m/V) SDS ;消化前加入 lOOmg/mLRNA 酶 15μ1、lOmg/mL 蛋白酶K 15μ1，不停地搖動，在55°C下消化58_63分鐘待用；其中裂解液的配方:取10mmol/LTris-Cl,pH7.5 ；lmmol/L EDTA，pH7.5 ；0.1% (m/V) SDS ；lOOmg/mLRNA 酶；10mg/mL 蛋白酶K，置於試劑瓶中混合均勻即可； 2)取上步消化物，加入0.5mL的酚、氯仿、異戊醇的混合液，其混合比為25:24:1，混合均勻後置於室溫下靜置4-5分鐘，12000轉/分鐘、離心8-10分鐘，取上清液，用0.5mL氯仿抽提一次，室溫下靜置5-6分鐘，12000轉/分鐘、離心10-12分鐘待用； 3)取上步上清液加入兩倍體積的無水乙醇，室溫靜置7-10分鐘，沉澱DNA；經12000轉/分鐘、離心9-11分鐘，用ImL 70%乙醇洗滌I次；12000轉/分鐘、離心1.5-2.0分鐘，棄上清，室溫靜置乾燥7-12分鐘；加入50μ1 TE，即為IOmmoI/L Tris-Cl, ρΗ7.4 ；1 mmol/L EDTA, pH 8.0 ;溶解 DNA，4°C貯存備用； 其中PCR反應體系: 50μ1 反應體系為:10XPCR Taq Buffer 5μ1 ; 25mM MgCl24μ1 ;dNTP Mix (2.5mM each ) 5μ1 ;引物(10ρΜ/μ1)各 0.5μ1; DNA模板 lOOPg/mL 6μ1 ;TaqDNA Polymerse 1.25Μ-1 ; Nuclease-free Water 26.75M-1;總體積為 50μ1 ； 其中PCR反應條件: 94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30秒，35個循環；72°C延伸7分鐘； 其中瓊脂糖凝膠電泳檢測: PCR擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80V，電泳結束、凝膠成像，在595bp和421bp處出現清晰條帶。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於:選用的Tris-Cl為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，EDTA為乙二胺四乙酸，SDS為十二烷基磺酸鈉，GFP為綠色螢光蛋白，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；RNA酶購自上海生物工程有限公司；蛋白酶K購自Amerisco 公司。
專利摘要
本發明提供了一種檢測轉基因羊轉綠色螢光蛋白基因及啟動子的PCR方法，針對轉基因羊，依據GFP基因序列和pLEX載體CMV啟動子序列，設計的兩對特異性引物分別為GFP-上遊引物TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC；GFP-下遊引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;CMV-上遊引物TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下遊引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA；以轉基因羊基因組DNA為模板，擴增GFP基因，其片段為595bp；擴增CMV基因，其片段為421bp。本發明將單一的PCR方法設計為雙重的PCR方法，可一次檢測兩種基因結構有獨到之處，具有重要的實用價值。
文檔編號C12Q1/68GKCN103088114SQ201110345398
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月4日
發明者張雪梅, 李文蓉, 張寧, 賀三剛, 劉明軍 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan