殺菌通透性增強蛋白基因作為豬大腸桿菌病的抗性遺傳標記的應用的製作方法

2023-04-23 22:11:26 1

專利名稱：殺菌通透性增強蛋白基因作為豬大腸桿菌病的抗性遺傳標記的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於豬遺傳育種及分子標記輔助選擇技術領域，具體涉及豬大腸桿菌病抗 性遺傳標記的篩選和應用。
背景技術：
隨著我國規模化養豬業的迅猛發展，豬病對規模化養豬生產的危害也日趨加重， 並成為當前我國養豬業健康發展的主要瓶頸。疾病給養豬業造成的直接經濟損失約佔總產 值的12% 15%。仔豬腹瀉和水腫病是規模化豬場最常見的一類疾病，對哺乳仔豬的危害 尤為嚴重。據有關資料的統計數字表明，許多豬群仔豬腹瀉性疾病發病率高達50%以上，病 死率高達15% 20%左右，由腹瀉和水腫引起的仔豬死亡數佔仔豬死亡總數39. 8%。(何維 明等，2001 ；單玉平，2005)。產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)是初生仔豬和斷奶仔豬腹瀉和水 腫病最常見和最重要的病原菌，是養豬業中的重要威脅因素(Boldin B，2008)。儘管當前 對仔豬腹瀉和水腫病的一些預防性措施(如提高管理水平、改善衛生環境、注射藥物以及亞 單位疫苗接種等)，在一定程度上減少了該病的發生，但並沒有從根本上消除斷奶仔豬腹瀉 和水腫病的發生與流行，從長遠發展考慮，尋求一種全新的預防與控制策略，採用遺傳學方 法，培育出抗病新品種(品系)，從遺傳素質上永久性地提高仔豬對大腸桿菌病的抵抗能力， 是現代育種學家共同追求的目標。ETEC定居在小腸上皮細胞的能力是由菌體表面的宿主特異性腸吸附菌毛介導的， 這種特異性菌毛通稱定居因子抗原或黏附素，確切地說，黏附素存在於菌毛頂端。ETEC中的 大腸桿菌FlSab和FlSac菌毛在豬體內、外均可黏附小腸上皮細胞微絨毛和刷狀緣，產F18 菌毛的大腸桿菌可利用F18菌毛介導的細菌在腸道內定居而大量繁殖，產生腸毒素和志賀 氏樣毒素，從而出現腹瀉、水腫和神經症狀。F18大腸桿菌是目前在養豬業中發生最普遍、危 害最大的大腸桿菌病原之一(Van den Broeck W, et al. 2000)。鑑於ETEC F18是引起斷 奶仔豬腹瀉的主要病原菌之一，而ETEC F18受體基因又是決定病原菌配體分子特異結合吸 附到宿主組織細胞上的功能基因，ETEC F18受體基因的突變會引起其編碼的菌毛受體蛋白 結構和功能的改變或喪失，從而使病原菌和配體分子不能結合上去，表現對病原菌的遺傳 抗性。因此，對ETEC F18受體基因等抗性相關基因的篩選及功能的深入研究將成為抗病育 種的重要基礎儲備。殺菌通透個生±曾強蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI )是人和哺乳動物的內源性陽離子蛋白質，主要存在於多形核白細胞(Ploymorphneclear leukocytes, PMNs)的嗜苯胺藍顆粒中。BPI除了能殺滅G-菌，中和內毒素或脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)的活性外，還有調理功能、促進補體活化，增強吞噬的調理功 能、抑制血管生成、抑制炎性介質釋放、抗真菌和原蟲等一系列生物學功能，在動物機體天 然防禦中起到了很重要的作用。國內外關於豬BPI基因的多態性及其對疾病的抗性/易感性相關的研究鮮見報導，在美國專利網中有一段關於豬BPI基因的序列，長1 452 bp，沒有清楚的注釋， 現將其命名為專利 BPI 序列(United States, Kind Code: Al, Patent Application: 20040234980)。在此專利的公開信息中，Christopher等在約克、漢普夏、杜洛克、長白、大 白、野豬和眉山豬中，檢測到BPI基因外顯子4和10分別存在Jva II和II酶切多態性， 通過攻毒試驗表明其基因型與豬沙門氏菌的易感性有關，並把BPI基因確立為抗病育種候 選基因。腸毒素性大腸桿菌為豬腸道中主要的革蘭氏陰性菌，本發明利用課題組前期在蘇 太豬群體中建立了 F18大腸桿菌病抗性和敏感性資源家系群體以及大白豬作為試驗材料， 利用PCR-RFLP技術分析BPI基因第10外顯子Hpa II多態性，通過仔豬小腸上皮細胞分別 與表達FlSab菌毛的野生型大腸桿菌、表達FlSac菌毛含fed操縱子全基因的重組大腸杆 菌及表面分泌表達FlSab菌毛!^edF亞單位的重組大腸桿菌進行體外黏附試驗，分析BPI基 因第10外顯子///7a II多態性F18大腸桿菌感染間的關係，探討豬BPI基因對腸毒素性大 腸桿菌F18(ECF18)菌株的作用機理，發現本發明BPI基因外顯子IWpa II酶切位點的遺 傳標記與腸毒素性大腸桿菌菌株的抗性有關。

發明內容
本發明是用BPI基因外顯子\Mpei II酶切位點作為豬腸毒素性大腸桿菌菌株抗 性的分子標記及其檢測方法與應用，檢測該分子標記的方法包括待測樣品的豬基因組DNA 的提取及其PCR擴增，PCR產物經限制性內切酶Hpa II的酶切，當待測豬個體基因型為AA 型045 bp)，則為抗大腸桿菌病個體。本發明為從遺傳素質上永久性地提高仔豬對大腸杆 菌病的抵抗能力提供了有效的分子標記。本發明的優點
1)本發明為豬抗病育種工作的分子標記輔助選擇提供一個更加高效準確、簡便易行 的分子遺傳標記，為提高仔豬對大腸桿菌病的抵抗能力提供了一種有效的分子標記育種手 段。用該遺傳標記對豬的大腸桿菌抗性進行標記輔助選擇，可有效地緩解實際生產中的仔 豬腹瀉和水腫病問題，提高經濟效益，並為加速改善仔豬抗病能力的分子育種奠定了基礎， 將加快育種進程。2)本發明的檢測方法操作簡單，費用較為低廉，準確度高，並可實現自動化的直接 檢測，本發明將在豬的育種中發揮巨大作用。所述的殺菌通透性增強蛋白(BPI )基因作為豬大腸桿菌病的抗性遺傳標記及應 用包括
1.豬基因組DNA的提取
2.豬BPI基因第10外顯子的引物設計和PCR擴增
3.PCR- RFLP 分析
4.仔豬小腸上皮細胞的黏附試驗確定個體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性
5.BPI基因第10外顯子Hpa II多態性與F18大腸桿菌抗性間的關係分析，確定抗性 遺傳標記。


圖1為BPI基因第10外顯子PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為BPI基因第10外顯子酶切後3種基因型的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖， 其中 M 為 pUC19 mk/Msp I Qbp II ) marker，第 2、6、8、11、12 泳道為 AA 基因型；第
4、10泳道為BB基因型，第1、3、5、7、10泳道為AB基因型。圖3為斷奶仔豬小腸上皮細胞黏附能力的照片
A 標準菌株107/86 ；B :rE. colil534 ；C :pnirBMisL-fedF (照片均使用油鏡鏡頭，以 1000倍放大比例拍攝)。圖4為斷奶仔豬小腸上皮細胞黏附能力喪失的照片
A 標準菌株107/86 ；B :rE. colil534 ；C :pnirBMisL-fedF (照片均使用油鏡鏡頭，以 1000倍放大比例拍攝)。
具體實施例方式本發明中所涉及的生物材料，由申請人實驗室構建和保存的，均自申請日起向公 眾提供20年。一、利用BPI基因第10外顯子漢識II酶切位點標記對蘇太豬和大白豬核心群全面 檢測基因型。每個個體採耳組織塊約1. 0 g,放入1. 5 mL的Eppendoff管內於冰盒中取回揚州 大學動物遺傳育種與繁殖重點學科實驗室備用。按常規酚-氯仿法提取DNA。提取的DNA 用核酸蛋白測定儀測定其含量和純度，-20 °C保存備用。根據已公布的豬專利BPI基因序 列並參考人(Genebank 登錄號NM_ 001725 )、牛(Genebank 登錄號NM_ 173895)BPI 基因 序列的注釋，設計引物擴增BPI基因第10外顯子，上遊引物為5' -CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3' (SEQ ID NO. 1)，下遊引物為5'-CAATGAATCAATGAGCACACC -3' (SEQ ID NO. 2), PCR 產物大小為44^p (圖1)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，7 ^ DNA polymerase、dNTP購自大連寶生物公司。PCR 反應體系為10 X PCR 緩衝液 2. 5 μ L,2. 5 mmol/L dNTP 1. 5 μ L, 10 μ mol/ L 弓丨物(上遊)1 μ L，10 μ mol/L 引物(下遊)1 μ L，T^ 酶(5 U/μ L) 0. 2 μ L，100 ng/ μ L DNA模板1 μ L，ddH20 17. 8 μ L，總體積25 μ L。PCR擴增程序為94 °C預變性4 min ；94 "C 變性 30 s，57°C退火 30 s，72 °C延伸 30 s，32 個循環；72 "C 延伸 7 min ；4°C保存。酶切反應體系為10 μ L，包括PCR產物3 μ L，限制性內切酶漢識II (5 U/ μ L) 0. 2 μ L, IOXbuffer 1 μ L，ddH20 5. 8 μ L，置 37°C恆溫反應 3 h 後，經 10% 的聚丙烯醯胺 凝膠電泳銀染分析，BPI基因第10外顯子經限制性內切酶/fe/7 II消化後能被完全酶切，產生 AA 型(445 bp)，BB 型(304bp /142bp)，AB 型(445 bp/304 bp/142 bp) 3 種條帶(圖 2)。二、仔豬小腸上皮細胞的黏附試驗確定個體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性。1)仔豬小腸上皮細胞的製備
在仔豬斷奶前後，也是最易感染大腸桿菌F18菌株而表現出腹瀉症狀的35日齡階段屠 宰取十二指腸、空腸腸段15cm用於小腸上皮細胞的製備。將仔豬剖殺後，各取十二指腸、空 腸腸段15cm立即放入預冷的PBR溶液中，每段腸管用PBR溶液輕柔衝洗三遍後，再用30ml預冷IPBR衝洗一遍，將腸道外翻後短暫地在IPBR溶液中清洗一下，然後轉移到盛有200ml IPBR溶液的燒杯中，於室溫下以lOOr/min的速度勻速攪拌lOmin。棄腸段，將燒杯中液體 轉移至離心管，在0°C下，200g，離心lOmin。沉澱重新懸浮在PBR溶液中輕輕洗滌一次，再 次離心，用預冷的MEM重新懸浮沉澱的細胞，將細胞濃度調整到IO6— IO7個細胞/mL。2)細菌的準備
產FlSab菌毛標準菌株107/86 (0139:K12:H1)由美國賓夕法尼亞大學獸醫學院微生 物實驗室惠贈。能誘導表達FlSac菌毛含fed操縱子全基因的重組大腸菌rE. colil534 由本實驗室構建並保存(吳聖龍，原志偉，鞠慧萍，黃雪根，華金弟，沈家林，周冠月，王建業， 謝愷舟，陳國宏，朱國強.蘇太仔豬FUTl基因M307位點多態性與大腸桿菌F18抗病相關 性的體外鑑定.中國預防獸醫學報，2007, 29(10): 783 - 787.)，能表面分泌表達FlSab 菌毛!^edF亞單位的重組大腸桿菌pnirBMisL-fedF也由本實驗室構建(吳聖龍，原志偉，鞠 慧萍，黃雪根，華金弟，沈家林，周冠月，王建業，謝愷舟，陳國宏，朱國強.蘇太仔豬FUTl基 因M307位點多態性與大腸桿菌F18抗病相關性的體外鑑定.中國預防獸醫學報，2007， 29(10) 783 - 787.)。將107/86標準株大腸桿菌的單個菌落分別接種到3 5ml LB培養基，37°C振蕩培 養過夜(16 18h)，次日將細菌用PBS反覆離心洗滌3次，調整細菌濃度至約IX 109CFU/ml。將重組菌rE. colil534的單個菌落首先接種於含lOOPg/ml氨苄青黴素的3飛ml LB培養基，37°C振蕩培養過夜，次日取出50μ1再接種於5ml含lOOPg/ml氨苄青黴素的LB 培養基，37°C振蕩培養約2h，使細菌處於大約對數生長中期，OD600=O. 5-0. 7時，加入誘導劑 100mmol/L IPTG至終濃度為0. 2mmol/L，37°C繼續培養汕後終止誘導，然後將細菌用PBS 反覆離心洗滌3次，調整細菌濃度至約1 X 109CFU/ml。將重組菌pnirBMisL-fedF的單個菌落接種於含lOOPg/ml氨苄青黴素的5ml LB 培養基，於37°C首先在有氧的環境中振蕩培養過夜，再置於厭氧罐中誘導表達6h，然後將 細菌用PBS反覆離心洗滌3次，調整細菌濃度至約IX 109CFU/ml。上述培養的野生型大腸桿菌及誘導表達後的重組菌與相應單克隆抗體或抗血清 作玻板凝集試驗，在確認凝集試驗陽性，而陰性對照不凝集後，將上述細菌用於黏附試驗。3)仔豬小腸上皮細胞的黏附試驗
分別取上述野生菌或誘導表達的重組菌菌液0. 5ml，在其中添加終濃度為1%甘露糖於 37°C作用30min後和0. 5ml小腸上皮細胞混合，再於37°C孵育30min，1000r/min離心5min， 用PBR溶液懸浮後取50μ1滴於潔淨玻片上，自然乾燥，火焰固定，用美蘭染色3-5min，油鏡 觀察結果。4)抗性型和敏感型的判定
斷奶仔豬的小腸上皮細胞如均能與表達FlSab菌毛標準菌株107/86、誘導表達的重組 大腸桿菌rE. colil534及誘導表達的重組大腸桿菌pnirBMisL-fedF發生黏附作用(圖3)， 將其定義為大腸桿菌F18菌株敏感型；而如果仔豬小腸上皮細胞對上述3株大腸桿菌的黏 附能力幾乎為零(圖4)，則將其定義為抗性型。三、BPI基因第10外顯子II多態性及其與F18大腸桿菌感染間的關係分析 及抗性標記的確定
對BPI基因第10外顯子///7a II的3種基因型個體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性進行分析，3種基因型個體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性的頻率見表1 ；對抗性/易感性的 頻率進行獨立性χ 2檢驗，結果見表2，由表2，3可見，AA基因型中大腸桿菌F18菌株抗性型 個體的頻率為90%，顯著或極顯著地高於AB基因型(57. 1%)和BB基因型(17. 4%)的個體。 可以將BPI基因第10外顯子II AA基因型確定為抗大腸桿菌的分子遺傳標記。
表1 BPI基因第10外顯子Hpa 113種基因型個體大腸桿菌F18菌株抗性/
易感性的頻率表
權利要求
1.殺菌通透性增強蛋白基因第10外顯子作為豬大腸桿菌病的抗性遺傳標記的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於具體包括以下步驟(1)提取待測樣本的組織DNA，備用；(2)PCR擴增以步驟(1)的DNA為模板，用下述引物進行PCR擴增，上遊弓I 物為5'-CCCAACATGGAGATGCAGTTC _3'，下遊弓| 物為 5'-CAATGAATCAATGAGCACACC -3'；(3 )PCR擴增產物用限制性內切酶/fe/7 #酶切後經聚丙烯醯胺凝膠電泳銀染分析，只出 現445 bp條帶的樣本為豬大腸桿菌病抗性。
全文摘要
本發明涉及篩選一種豬大腸桿菌病抗性BPI基因第10外顯子HpaII多態位點的遺傳標記。本發明是用BPI基因外顯子10HpaII酶切位點作為豬腸毒素性大腸桿菌菌株抗性的分子標記及其檢測方法與應用，檢測該分子標記的方法包括待測樣品的豬基因組DNA的提取及其PCR擴增，PCR產物經限制性內切酶HpaII的酶切，當待測豬個體基因型為AA型(445bp)，則為抗大腸桿菌病個體。本發明為豬抗病育種工作的分子標記輔助選擇提供一個更加高效準確、簡便易行的分子遺傳標記，可有效地緩解實際生產中的仔豬腹瀉和水腫病問題，提高經濟效益，加快育種進程。本發明的檢測方法操作簡單，費用較為低廉，準確度高。
文檔編號C12N15/65GK102071252SQ201010578028
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者侯小亮, 劉璐, 包文斌, 華金第, 葉蘭, 吳聖龍, 孫壽永, 曹永忠, 朱國強, 朱璟, 潘章源, 訾臣, 黃小國, 黃雪根 申請人:揚州大學