一種新型泥鰍蛋白降壓肽及其製備方法
2023-06-18 17:09:31 2
專利名稱：一種新型泥鰍蛋白降壓肽及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種從泥鰍肉的酶解產物中分離純化出具有新的胺基酸序列的降壓肽及其製備方法與應用，將現代生物技術應用於淡水水產品深加工，屬於淡水水產品深加工技術領域。
背景技術：
食源性蛋白經酶解得到的水解產物大部分是幾個胺基酸殘基組成的短肽，這些短肽以完整的形式被吸收進入循環系統而被組織利用，具有許多生理活性抗氧化，提高免疫力，抗菌消炎，促進微量元素的被動轉運過程及在體內儲存、抗高血壓活性等。血管緊張素轉換酶(ACE)是一種含鋅的二肽羧酸基肽酶，對調節血壓起著關鍵性的作用，血管緊張素I(AngiotensinI)不具有活性，但是AI在ACE的作用下可以轉變為具有活性的血管緊張素II，AII具有收縮血管平滑肌的活性功能，從而引起血壓升高。ACE 抑制肽是對ACE活性區域親和力較強的競爭性抑制劑，它們與ACE的活性中心的親和力比 AngI或舒緩激肽對ACE的親和力更強，並且降血壓肽一旦和ACE活性中心結合，就難以釋放出來，從而阻礙AngI轉化為AngII以及催化水解舒緩激肽成為失活片段，起降血壓作用。 人工合成的ACE抑制劑具有明顯的降壓效果，但是副作用太大。食源性蛋白通過不同的酶進行酶解，在其酶解物中發現了許多ACE抑制肽，這些ACE抑制肽安全、新穎、高效。目前報導的ACE抑制肽主要來源於牛奶、大豆、乳酪、雞蛋、蛇毒、玉米、食用菌等， 水產動物蛋白也陸續報導，如馬氏珠母貝、鯊魚、草魚等。泥鰍藥用價值高，《本草綱目》記載泥鰍「暖中益氣、醒酒、解消渴」。中醫認為，泥鰍性味甘平，具有補中益氣，祛溼邪之功效，經常食之、可防血管硬化，對高血壓、貧血等心血管疾病患者都有輔助治療作用。目前對泥鰍的研究和應用只限於泥鰍蛋白的抗氧化肽和粘液多糖的抗菌及免疫調節活性方面研究，但是泥鰍蛋白降血壓肽研究未見報導。
發明內容
發明目的本發明的目的是為提供一種將泥鰍蛋白酶解及純化得到的ACE活性較高的、易於消化吸收的新型降壓肽。針對現有技術的不足，提供一種泥鰍蛋白降壓肽的製備方法與應用。本發明所述的泥鰍蛋白降壓肽Leu-Glu-Tyr，為白色粉末狀，易溶於水，具有較高的血管緊張素轉換酶(ACE)抑制活性，IC5tl值為0. 10;3mg/mL。技術方案本發明所述的泥鰍蛋白降壓肽的製備方法酶解泥鰍蛋白製備酶解液、酶解液中降血壓肽的分離純化和序列測定，具體步驟如下(一)酶解泥鰍蛋白製備酶解液將泥鰍肉絞成肉糜，加水打漿，然後加入3% 0(w/w)菠蘿蛋白酶(活力3X105U/g)，調節pH值到5. 5-6. 0，溫度55-600C，攪拌酶解6小時，滅酶，轉速3000rpm離心20min,
取上清液，即酶解液。( 二 )從酶解液中分離純化降血壓肽酶解液2%活性碳脫色20min，然後過2500Da的超濾膜超濾，將超濾小於2500Da 的超濾液過kphadex G-15柱，流速1. OmL/min，用蛋白質核酸檢測儀，在^Onm處進行檢測，自動部分收集儀收集洗脫液，凍幹秤重後，測定ACE抑制活性，將抑制活性高的組分多次收集，然後進一步用反相高效液相色譜分離；半製備柱ZORBAX SB-C18，流速0.8mL/min， 流動相=A 水(含0. 1 % TFA, ν/ν) ；B 乙腈(含0. 1 % TFA, ν/ν)。紫外洗脫液在波長280nm 下進行檢測，同一峰下的組分收集混合，冷凍乾燥，測定ACE抑制活性，得到高活性的ACE抑制肽。(三)降血壓肽的序列測定將分離純化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110°C全水解M小時， 用胺基酸自動測定儀測定胺基酸組成。同時，通過質譜儀分析肽的分子量和肽段的分布，然後進行肽的胺基酸序列分析。所述的(二)中測定肽的ACE抑制活性方法優選的是以N-[3_(2-呋喃)丙烯醇醯]-2-苯丙氨醯甘氨醯甘氨酸(FAPGG)為AngI模擬物的分光光度法，在酶標儀 (LB941Tristar, BertholdTechnologies, Bad ffilbad, Germany)上測定。FAPGG 在 ACE 的水解下生成N-[3-(2-呋喃)丙烯醇醯]-2-苯丙氨酸(FAP)和雙甘肽(GG)，FAPGG的水解使340nm吸光度降低，降低速率與樣品的ACE活性成正比。具體步驟如下將10 μ L的ACE溶液(0. 25U/mL)和10 μ L的蛋白酶解液加入微孔板的微孔中但不混合，然後加入150 μ L經過預熱的ImM FAPGG(溶劑為50mM Tris-HCl緩衝液，pH 7. 5， 含0. 3M NaCl)，使其開始反應。同時，迅速將微孔板放入酶標儀中並加熱到37°C，每Imin 紀錄一次在;MOnm下的吸光值，共記錄20min。空白對照用10 μ L緩衝液(50mM Tris-HCl, PH7.5，含0.3MNaCl)代替蛋白酶解液。以吸光值對時間做出曲線，計算出斜率(通常取 10-20min的斜率來計算)。ACE抑制活性(％ ) = (1- Δ A抑制劑/ Δ A空白)X 100Δ Amm 樣品的吸光值對時間曲線的斜率，Δ Ase 空白的吸光值對時間曲線的斜率。IC50值定義為抑制50%的ACE活力的ACE抑制劑的濃度。上述反應試劑和實驗操作，如未作特別說明的，均為本領域常規反應試劑及實驗操作。本發明的優點及有益效果在於本發明泥鰍蛋白降血壓肽具有較高的ACE抑制活性，降血壓效果好。本發明所得的短肽產品乾燥處理後為白色粉末，易溶於水，可用於製備降壓藥物。同時，本發明將生物酶工程技術應用於泥鰍的深層次開發。具體表現在1.泥鰍屬淡水產低值魚類，食品安全性高，藥用價值好。泥鰍繁殖力強，價格低廉， 來源穩定，易於實現產業化。2.集酶工程和肽的純化鑑定技術於一體，對泥鰍蛋白進行了深入的開發利用，發現了新的胺基酸序列組成的ACE抑制肽Leu-Glu-Tyr。
3.本發明的短肽IC5tl值為0. 10;3mg/mL，具有較高的ACE抑制活性，在消化道內很難被進一步酶解，可被直接吸收利用，推測在體內也會發揮較好的降壓活性，為降壓藥物的開發奠定基礎。
四
圖1是經過2500Da的膜超濾的泥鰍蛋白酶解液經過kphadex G_15柱分離的色譜圖。圖2是kphadex G_15柱分離的A組分樣品在反相高效液相C18柱上分離得到的色譜圖。圖3是反相高效液相C18柱上分離得到的色譜峰中的高活性組分All的純度鑑定。圖4、圖5分別是高活性組分All的一級質譜圖和二級質譜圖。證明All樣品的分子量為423Da，胺基酸序列Leu-Glu-Tyr。
五具體實施例方式實施例1.從泥鰍蛋白酶解物中分離純化得到高活力的ACE抑制肽Leu-Glu-Tyr。(1)酶解泥鰍蛋白製備酶解液將泥鰍肉絞成肉糜，加水打漿，然後加入3%。(w/w)菠蘿蛋白酶(活力3X105U/g)， 調節PH值到5. 5，溫度55°C，攪拌酶解6小時，滅酶，轉速3000rpm離心20min，上清液即酶解液。(2)從酶解液中分離純化降血壓肽將酶解液用2 % (w/v)活性碳脫色20min，然後過2500Da的超濾膜超濾，將超濾小於 2500Da 的超濾液過 S印hadex G-15 柱(1. 6 X 100cm，Amersham Pharmacia Biotech, PiSCataWay，NJ，USA)，流速1. OmL/min，分離得到5個峰，自動部分收集儀收集洗脫液，測定 ACE抑制活性，得到A號峰具有較高的ACE抑制活性(見圖1)，將A組分反覆收集，進一步用反相高效液相色譜柱(9. 4 X 250mm，AKTA，Agi lent Technologies Co. ,Ltd. ,USA)分離， 得到12個色譜峰(見圖幻，其中5號峰具有較高的ACE抑制活性，將5號峰多次收集，冷凍乾燥(EYELAFDU-1200，Tokyo Rikakikai Co.，Ltd.，Japan)，再次上反相高效液相色譜柱， 鑑定純度(見圖3)。(3)降血壓肽的序列測定將步驟(3)分離純化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110°C全水解M小時，用胺基酸自動測定儀測定胺基酸組成為Leu、Glu和Tyr。同時，通過質譜儀 (TSQQuantum-LC/MS/MS，Finnigan，USA)，分析肽的分子量和肽段的分布，如圖4、圖5所示， 分析出該肽的胺基酸序列為Leu-Glu-Tyr，IC5tl值為0. 10;3mg/mL，泥鰍蛋白酶解液中分離純化的降血壓短肽具有較高的ACE抑制活性。
權利要求
1.一種新型泥鰍蛋白降壓肽Leu-Glu-Tyr。
2.如權利要求1所述的泥鰍蛋白降壓肽，其特徵在於，所述的泥鰍蛋白降壓肽具有較高的血管緊張索轉換酶(ACE)抑制活性，IC5tl值為0. 10;3mg/mL。所述的泥鰍蛋白降壓肽為白色粉末，易溶於水。
3.—種權利要求1所述的泥鰍蛋白降壓肽的製備方法酶解泥鰍蛋白製備酶解液、酶解液中降血壓肽的分離純化和序列測定。具體步驟如下(1)酶解泥鰍蛋白製備酶解液將泥鰍肉絞成肉糜，加水打漿，然後加入3% 0(w/w)菠蘿蛋白酶(活力3X105U/g)，調節pH值到5. 5-6. 0，溫度55-60°C，攪拌酶解5小時，滅酶，轉速3000rpm離心20min，取上清液，即酶解液。(2)從酶解液中分離純化降血壓肽酶解液經2%活性碳脫色20min，然後過2500Da的超濾膜超濾，將超濾小於2500Da的超濾液過kphadex G-15柱，流速1. OmL/min，用蛋白質核酸檢測儀，在^Onm處進行檢測， 自動部分收集儀收集洗脫液，凍幹秤重後，測定ACE抑制活性，將抑制活性高的組分多次收集，然後進一步用反相高效液相色譜分離；半製備柱ZORBAX SB-C 18，流速0.8mL/min，流動相=A 水(含0. TFA, ν/ν) ；B 乙腈(含0. TFA, ν/ν)。紫外洗脫液在波長280nm 下進行檢測，同一峰下的組分收集混合，冷凍乾燥，測定ACE抑制活性，得到高活性的ACE抑制肽。(3)降血壓肽的序列測定將分離純化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110°C全水解M小時，用胺基酸自動測定儀測定胺基酸組成。同時，通過質譜儀分析肽的分子量和肽段的分布，進行肽的胺基酸序列分析。
4.如權利要求3所述的泥鰍蛋白降壓肽的製備方法，其特徵在於，所述步驟( 中測定肽的ACE抑制活性方法是以N-[3-(2-呋哺)丙烯醇醯]-2-苯丙氨醯甘氨醯甘氨酸(FAPGG) 為AngI模擬物的分光光度法。
全文摘要
本發明提供了一種新型泥鰍蛋白降壓肽及其製備方法，屬於生物技術領域。從泥鰍的蛋白酶解產物中分離純化出新的降血壓短肽，具有較高的血管緊張索轉換酶(ACE)抑制活性。製備步驟包括酶解泥鰍蛋白製備酶解液、從酶解液中分離純化降血壓肽和降血壓肽序列的測定。本發明集現代酶工程技術與肽的純化鑑定技術於一體，對泥鰍蛋白進行了深入的開發利用，發現了ACE抑制活性較高的新序列短肽Leu-Glu-Tyr，具有較高的ACE抑制活性，IC50值為0.103mg/mL。
文檔編號C12P21/06GK102190706SQ201110085378
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月7日 優先權日2011年4月7日
發明者周劍忠, 張麗霞, 曾曉雄, 李瑩, 王英, 馬豔弘, 黃開紅 申請人:江蘇省農業科學院