利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法

2023-04-23 22:20:21

利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟：採用矽膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，設計包含目標位點的檢測引物，根據HRM分析技術對PCR擴增後的基因序列進行位點分型。本發明靈敏度高、特異性好，檢測速度快，可用於為華法林的臨床用藥劑量提供參考，從而達到合理有效地個體化用藥。
【專利說明】利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及華法林個體化用藥相關基因多態性的檢測方法，屬於分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]華法林是臨床上常用的抗凝藥物，通過抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的擴大和延展，抑制血栓脫落和栓塞的發生，有利於血栓的清除。臨床上主要用於治療房顫、心瓣膜修復術、再發性的中風、深靜脈血栓以及肺動脈栓塞。華法林藥理學作用比較複雜，即使很小的劑量-反應變化也可能導致血栓或出血。臨床用藥劑量可以相差20倍左右，如何正確使用華法林，合理監測調整劑量，已成為困擾臨床醫生的難題。華法林主要由肝細胞微粒體細胞色素P450 2C9酶羥基化後，由腎臟排出體外。另一方面華法林通過抑制維生素K環氧化物還原酶，阻止維生素K還原形式KH2的形成。KH2通過對維生素K依賴性凝血因子I1、Vn、IX、X氨基末端穀氨酸殘基的Y -羧化作用，使其具有生物活性，促進凝血因子結合於磷脂表面，加速凝血過程。研究發現CYP2C9和VKORCl是華法林代謝個體差異最主要的兩個遺傳學方面的影響因素，其基因多態性變量約佔香豆素類藥初始劑量和維持劑量的35%~50%。
[0003]細胞色素氧化酶Ρ450是一類參與內源性和外源性化合物代謝的單加氧酶，與大部分藥物及毒物的代謝有關。甲CYP2C9在人肝臟微粒體中含量豐富，約佔總CYP蛋白量的20%，有多種突變等位基因，構成了藥物代謝個體差異的基礎。影響CYP2C9酶催化功能的突變體主要有兩種:CYP2C9*2和CYP2C9*3。研究發現攜帶CYP2C9*2等位基因的個體與野生型個體華法林的臨床用藥劑量相比要降低14%~20%，攜帶CYP2C9*3等位基因的個體與野生型個體華法林的臨床用藥劑 量相比要降低21%~49%。突變型可以使華法林的代謝減慢，血藥濃度增高，引起出血等不良反應的發生。
[0004]維生素K環氧化物還原酶l(vitamin K epoxide reductase I, VK0RC1)可激活維生素K環氧化物還原酶複合體，主導維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林主要作用靶點。VKORCl基因位於內含子區的1173 C>T多態性能更多顯示華法林個體劑量的差異。一項研究發現攜帶VK0RC1(1173CC+CT)基因型的病人每天華法林的用藥劑量(3.33±1.04mg/d)比攜帶1173TT基因型所需要的華法林的用藥劑量(1.81 ±0.63 mg/d )高(P< 0.001)。
[0005]目前普遍應用的基因分型檢測方法為Taqman探針法和DNA直接測序法。Taqman螢光探針兩端分別標記報告基團和淬滅基團，探針在未與目標序列結合保持完整時，螢光報告基團和淬滅基團沒有分離，螢光信號被淬滅基團吸收，不能受激發出螢光；PCR擴增時，完全互補配對後由Taq酶所具有的5』_3』外切酶活性將探針酶切降解，螢光報告基團和淬滅基團分離，螢光檢測系統可以接到螢光信號，實現螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。如果探針與目標序列存在錯配鹼基，就會大大減少探針與目標序列結合的緊密度及Taq酶5』端外切酶的活性，影響探針的螢光釋放量，使帶有不同鹼基的DNA序列得以鑑定。這種方法步驟少，不易汙染，便於對大樣本進行分型；但對引物設計有一定的限制，對於SNP附近的序列有一定要求，受突變鹼基位點與類型局限。DNA直接測序法能直接提供準確的鹼基信息，被當成突變檢測的金標準，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用於對大量樣本進行檢測等缺點。
[0006]本發明應用一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線(High resolution melting, HRM)分析技術。通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA突光染料與PCR產物的結合情況，SNP位點鹼基不同會使雙鏈DNA的TM值發生變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先後解開，形成不同的熔解曲線形狀，螢光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從螢光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。HRM不受突變鹼基位點與類型局限，無需序列特異性探針，採用新型飽和染料更易於檢測單鹼基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點，結果準確，且實現了真正的閉管操作。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種簡單易行的華法林個體化用藥相關基因多態性的檢測方法。
[0008]為了達到上述目的，本發明提供一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因(細胞色素P450 2C9酶、維生素K環氧化物還原酶I)多態性的方法，其特徵在於，具體步驟為:
第一步:採用矽膠吸附法抽 提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，採用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul。
[0009]第二步:採用在線軟體Primer 3設計HRM引物，確定最佳引物為18_25bp大小，PCR產物長度80-150bp。相關引物信息如下:
CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)引物序列: rsl799853-F:AATTTTGGGATGGGGAAGAG rsl799853-R:CCACCCTTGGTTTTTCTCAA CYP2C9 A1075C (rsl057910)引物序列: rsl057910-F:CCACATGCCCTACACAGATG rsl057910-R:TGTCACAGGTCACTGCATGG VKORCl C1173T (rs9934438)引物序列: rs9934438-F:CCGAGAAAGGTGATTTCCAA rs9934438-R:TGACATGGAATCCTGACGTG
第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul(10umol/L)，檢測樣品2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92-97°C變性5-15分鐘，92_97°C變性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50個循環；HRM反應條件:92_97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監測螢光信號，30-50次每秒。
[0010]第四步:應用Rotor-Gene Q軟體分析HRM結果，通過標準曲線基於曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現不同的基因型。定義已知樣本基因型後，軟體會自動調出所有檢測樣本的基因型。
[0011]本發明對細胞色素P450 2C9酶及維生素K環氧化物還原酶I的三個位點的基因型進行檢測，為華法林的臨床用藥劑量提供參考，從而達到合理有效地個體化用藥。
[0012]本發明基於HRM分析技術，無需序列特異性探針，採用新型飽和染料，操作簡單，不僅具有靈敏度高、特異性好、成本低、檢測速度快、高通量等優點，而且解析度高，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉汙染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發明實施例大樣本的HRM標準曲線圖；
圖2為本發明實施例大樣本的HRM差異曲線圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例
[0015]1、採用矽膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到lOng/ul ；
陰性對照DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑑定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為CC ;
陽性對照I DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑑定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為CT ；
陽性對照2 DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑑定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為TT。
[0016]2、採用在線軟體Primer 3設計引物，確定最佳引物為18_24bp大小，PCR產物長度70-150bp，目標位點周邊位置避免其他SNP位點(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用無菌水配製濃度為10umol/L的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)正向引物溶液以及濃度為10umol/L的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)反向引物溶液；正向引物的序列為:5' - AATTTTGGGATGGGGAAGAG -3'，反向引物的序列為:5' - CCACCCTTGGTTTTTCTCAA_3' ο
[0017]3、在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生產，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?緩衝液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步驟2所得的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)基因正向引物溶液0.5ul、反向引物溶液0.5ul，然後在不同的PCR反應孔中分別加入步驟I得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul,用滅菌重蒸懼水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應,PCR反應條件為95°C變性10分鐘，95°C變性10秒，57°C退火10秒，72°C延伸10秒，40個循環；HRM反應條件:95°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監測螢光信號，40次每秒。
[0018]4、應用Rotor-Gene Q軟體分析HRM結果，如圖1、圖2所示，在8例口腔黏膜上皮細胞提取的DNA檢測中，有6例CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為CC，I例基因型為CT，I例基因型為TT。
【權利要求】
1.一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測華法林個體化用藥相關基因多態性的方法，其特徵在於，具體步驟為: 第一步:採用矽膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul; 第二步:採用在線軟體Primer 3設計HRM引物，確定最佳引物為18_25bp大小，PCR產物長度80-150bp，相關引物信息如下: CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)引物序列: rsl799853-F:AATTTTGGGATGGGGAAGAG rsl799853-R:CCACCCTTGGTTTTTCTCAA CYP2C9 A1075C (rsl057910)引物序列: rsl057910-F:CCACATGCCCTACACAGATG rsl057910-R:TGTCACAGGTCACTGCATGG VKORCl C1173T (rs9934438)引物序列: rs9934438-F:CCGAGAAAGGTGATTTCCAA rs9934438-R:TGACATGGAATCCTGACGTG 第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0. 5ul(10umol/L)，檢測樣品2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92-97°C變性5-15分鐘，92_97°C變性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50個循環；HRM反應條件:92_97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65 °C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監測螢光信號，30-50次每秒； 第四步:應用Rotor-Gene Q軟體分析HRM結果，通過標準曲線基於曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現不同的基因型；定義已知樣本基因型後，軟體會自動調出所有檢測樣本的基因型。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525911SQ201310431123
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】吳迪, 傅詠南, 張奕, 王校, 毛丹丹, 卞雪蓮 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司