在包含植物蛋白水解產物的無血清細胞培養液中生產多肽的製作方法

2023-04-23 16:20:11 1

專利名稱：：在包含植物蛋白水解產物的無血清細胞培養液中生產多肽的製作方法在包含植物蛋白水解產物的無血清細胞培養液中生產多肽發明領域本發明涉及用於在無血清培養液中於真核細胞中生產目的多肽的改進方法。發明背景用於在真核細胞中大規模生產多肽例如凝血因子VII多肽的方法是本領域已知的，參見例如WO02/29083、WO02/29084和WO03/29442。在多肽例如凝血因子VII多肽的大規模生產中，出於經濟原因希益。此外，設想在較長的時間段內更均勻的多肽生產速率將致使多肽批次更均一，因為認為對於"非應激的"細胞培養，翻譯後過程(例如糖基化和Y-羧酸的形成)可更精確地進行。WO01/23527公開了用於無蛋白質和無血清細胞培養的細胞培養基。該培養基包含一定比例的大豆水解產物(大豆蛋白腖)。發明簡述本發明涉及在培養過程中改變細胞培養液中的植物蛋白水解產物組分的濃度，以便，同時，1)在繁殖階段期間實現最佳細胞生長，和2)在生產階段中實現最佳的、長期的、關於性能的培養穩定性，並且從而增加所考慮的多肽例如凝血因子VII多肽的總產率。本發明的第一個方面涉及用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，並且其中第一種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(d)和第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5:1(C1:C2)。本發明的第二個方面涉及用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(U)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，例如大豆蛋白水解產物，並且其中所述第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)為0.7-3.0g/L。附圖簡述圖1舉例說明了培養過程的流程圖。圖2的圖表顯示了來自在20L發酵罐中的微載體培養的結果，參照實施例1。圖3的圖表顯示了來自在500L發酵罐中的微載體培養的結果，參照實施例2。發明詳述如上所述，本發明的一個主要方面涉及用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，並且其中第一種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(d)和第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5:1(C1:C2)。術語"大規模生產"指涉及至少IOOL的培養容器的生產。然而，在優選實施方案中，規模一般為至少250L，例如至少500L，例如至少1000L或甚至5000L或更大。術語"大規模，，可以與術語"工業規模"和"生產規模"互換使用。用於大規模生產多肽的方法一般在至少120小時例如1-26周的時間段內進行。本發明應被理解為迄今已知的用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產多肽的方法的改進。已知在此類方法中使用植物蛋白水解產物，但本發明提供了用於改進此類方法的結果的指導。本發明主要方面的方法的特徵是，以使得繁殖階段以及生產階段最優化的方式控制細胞培養液中植物蛋白水解產物的含量。這是通過確保第一種細胞培養液(用於繁殖階段)中植物蛋白水解產物的濃度(d)和第二種細胞培養液(用於生產階段)中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5:1(d:C2)來完成的。通常，細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度為0.01-10.0g/L。在某些實施方案中，在繁殖階段期間可以使用約5.Og/L的濃度(d)，然後減少濃度從而使得第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)在生產階段開始時是例如l.Og/L。隨後，在生產階段期間，濃度可以維持在基本上固定的水平，或可以備選地在低和高值之間例如在l.Og/L和2.0g/L之間增加和減少，以便維持穩定的培養。這也就是說，比例d:C2優選為2:1-10:1,例如2.5:1-8:1或3:1-6:1。此外，濃度C2—般為0.2-3.5g/L，例如0.7-3.0g/L，例如0.9-2.5g/L,例如0.9-2.2g/L，和濃度C！一般為4.0-10.0g/L,例如4.5-8.0g/L。如上所述，在生產階段過程中略微改變植物蛋白水解產物的濃度有時是有利的，例如，通過改變在上文給出的範圍之一內的濃度，例如在O.2-3.5g/L的範圍內，例如在O.7-3.0g/L的範圍內，例如在O.9-2.5g/L的範圍內，例如在O.9-2.2g/L的範圍內的濃度。備選地，濃度保持在基本上固定的水平。植物蛋白水解產物可以從各種來源之一獲得，例如商業來源。水解產物的一般類型是大豆蛋白水解產物、小麥蛋白水解產物、豌豆蛋白水解產物、水稻蛋白水解產物等。引入本文作為參考的W001/23527Al公開了大豆蛋白水解產物的製備和一般用途。優選地，植物蛋白水解產物是大豆蛋白水解產物。本發明一般不限於生產特定的多肽或使用特定的真核細胞。但是，下文還是提供了相關多肽和有用的真核細胞的舉例說明性的實例。然而，在某些本發明的當前最令人感興趣和優選的實施方案中，所述多肽是凝血因子VII多肽。此外，在此類實施方案中，真核細胞通常選自CH0、BHK、HEK293、骨髓瘤細胞等。因此，本發明主要方面的一個優選實施方案涉及用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述第一種細胞培養液包含濃度為4.0-10.0g/L的大豆蛋白水解產物，所述第二種細胞培養液包含濃度為0.2-3.5g/L的大豆蛋白水解產物，並且其中所述第一種細胞培養液中大豆蛋白水解產物的濃度(d)和所述第二種細胞培養液中大豆蛋白水解產物的濃度(c2)之比為至少1.5:1(d:C2)。本發明的另一方面涉及用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，例如大豆蛋白水解產物，並且其中所述第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)為0.7-3.0g/L。優選地，濃度C2為0.9-2.5g/L，例如0.9-2.2g/L。在一個實施方案中，所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，並且其中第一種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(d)和第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5:1,例如2:1-10:1，例如2.5:1-8:1或3:1-6:1。優選地，濃度C!為4.0-10.0g/L，例如4.5-8.0g/L。到目前為止獲得的結果表明，在生產階段中植物蛋白水解產物濃度太高將不可逆地損害培養，從而導致相當短的有效生產階段(參見，例如圖2,,5.0g/L水解產物)，而植物蛋白水解產物濃度太低將不利於培養，但為可逆方式。在生產階段中植物蛋白水解產物濃度太低可能導致細胞數目減少，從而減少產物濃度，但已顯示這可以通過略微升高植物蛋白水解產物濃度來克服。不希望束縛於任何特定理論，認為植物蛋白水解產物濃度的特性有利地具有下列特性在所述繁殖階段中的高濃度(d);在所述生產階段中的低濃度-低水平A(C2A);在所述生產階段中的低濃度-低水平B(C2B);在所述生產階段中的低濃度-低水平A(C2A);在所述生產階段中的低濃度-低水平B(C2B);等，其中C,〉C2B〉Cu，並且濃度C"和C2B在對於C2而指定的濃度範圍內，並且其中當在例如2-5天內已觀察到細胞數目逐漸減少時，進行從低水平A(C2A)至低水平B(C2B)的首次轉換，和當細胞數目已恢復至大約相應於減少前水平的水平時，進行從低水平B(C2B)至低水平A(C2A)的後續轉換。優選地，濃度Cu為0.2-2.0g/L，例如0.7-1.5g/L，例如0.9-1.3g/L,例如0.9-1.2g/L，和濃度C2B優選為1.0-3.5g/L,例如1.1-3.0g/L,.例如1.2-2.5g/L，例如1.2-2.2g/L。術語"培養液"意指在合適的液體介質中包含真核細胞培養物的液體。在一個重要的實施方案中，通過附著在固體微載體表面上或通過附著至或物理包載在大孔微栽體的內部結構中來固定細胞。這將在下文中進一步詳細解釋。^於義魂模政產^多農如上所述，本發明涉及與改進的真核細胞大規模培養有關的方法，所述真核細胞表達一種或多種目的蛋白，所述目的蛋白來自外源基因或在將編碼該蛋白質的重組基因導入此類細胞中之後產生。這樣的蛋白質包括，但不限於，凝血因子VII多肽；凝血因子VIII;凝血因子IX;凝血因子X;蛋白C;組織因子；凝乳酶；生長激素，包括人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；曱狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；心房鈉尿肽；肺表面活性物質；纖溶酶原激活劑，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-a和-P;腦啡肽酶；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-a);血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒抑制物質(mullerian-inhibitingsubstance);鬆弛素A-鏈；鬆弛素B-鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，例如P-內醯胺酶；DM酶；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；整合素；蛋白A或D;類風溼因子；神經營養因子例如骨源性神經營養因子(BDNF),神經營養蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經生長因子例如NGF-P，血小板衍生生長因子(PDGF);成纖維細胞生長因子例如a-FGF和P-FGF;表皮生長因子(EGF);轉化生長因子(TGF)例如TGF-a和TGF-P，胰島素樣生長因子-1和-II(IGF-I和IGF-II);CD蛋白例如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19;促紅細胞生成素；骨資導因子(osteoinductivefactors);免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP);幹擾素例如幹擾素-a、-p和-y;集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(ILs);例如IL-1至IL-10;超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原例如AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；抗體；和上述多肽中任何一種的片段。在本發明的優選實施方案中，所述多肽是凝血因子VII多肽。在關於這點的某些實施方案中，用於實踐本發明的細胞是表達外源的凝血因子VII基因的人細胞。在這些細胞中，外源基因可以是完整的或可以已被原位修飾，或者在凝血因子VII基因之外的序列可以已被原位修飾以改變外源的凝血因子VII基因的表達。在關於這點的其他實施方案中，來自任何真核來源的細胞是經改造的以從重組基因表達人凝血因子VII。如本文所使用的，術語"凝血因子VII多肽"和"FVII多肽"表示包含野生型人凝血因子Vila(即，具有美國專利號4，784,950中/>開的胺基酸序列的多肽)的胺基酸序列1-406的任何蛋白質、其變體，以及凝血因子VII相關多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII綴合物。這包括顯示出相對於野生型人凝血因子Vila來說基本上相同或改進的生物學活性的FVII變體、凝血因子VII相關多肽、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII綴合物。術語"凝血因子VII"希望包括其未切割(酶原)形式的凝血因子VII多肽，以及已經經蛋白水解加工而產生它們各自的生物活性形式的那些，其可以稱為凝血因子VIIa。通常，凝血因子VII在第152位和第153位殘基之間切割而產生凝血因子VIIa。凝血因子VII的此類變體可以顯示出相對於人凝血因子VII來說不同的性質，包括穩定性、磷脂結合、改變的比活性等。如本文所使用的，"野生型人FVIIa"是具有美國專利號4,784，950中公開的胺基酸序列的多肽。如本文所使用的，"凝血因子VII相關多肽"涵蓋了這樣的多肽，包括變體，其中凝血因子Vila的生物學活性相對於野生型凝血因子Vila的活性來說已經實質上進行了修飾，例如減少。這些多肽包括，酸序列改變的凝血因子VII或凝血因子VIIa。如本文所使用的，術語"凝血因子VII衍生物"意指顯示出相對於野生型凝血因子VII來說基本上相同或改進的生物學活性的FVII多肽，其中親本肽的一個或多個胺基酸已經採用遺傳和/或化學和/或酶促的方法進行了修飾，例如通過烷化、糖基化、PEG化、醯化、酯形成或醯胺形成等。這包括但不限於PEG化的人凝血因子VIIa、半胱氨酸-PEG化的人凝血因子Vila及其變體。凝血因子VII衍生物的非限制性實例包括在WO03/31464和美國專利申請US20040043446、US20040063911、US20040142856、US20040137557和US20040132640(NeoseTechnologies,Inc.)中/>開的糖PEG化的FVII衍生物；在WO01/04287、美國專利申請20030165996、WO01/58935、WO03/93465(MaxygenApS)和WO02/02764、美國專利申請20030211094(UniversityofMinnesota)中7>開的FVII綴合物。術語"改進的生物學活性，，指i)與重組野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的FVII多肽，或ii)與重組野生型人凝血因子VIla相比具有基本上相同或增加的TF結合活性的FVII多肽，或iii)與重組野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的在血漿中的半衰期的FVII多肽。術語"PEG化的人凝血因子Vila"表示具有與人凝血因子Vila多肽綴合的PEG分子的人凝血因子VIIa。應當理解，PEG分子可以連接至凝血因子Vila多肽的任何部分，包括凝血因子Vila多肽的任何胺基酸殘基或糖部分。術語"半胱氨酸-PEG化的人凝血因子Vila"表示具有PEG分子的凝血因子Vila,所述PEG分子綴合至引入人凝血因子Vila中的半胱氨酸的巰基上。與重組野生型人凝血因子Vila相比具有基本上相同或增加的蛋白水解活性的凝血因子VII變體的非限制性實例包括S52A-FVIIa、卩60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352:182-192，1998);在美國專利號5，580，560中公開的顯示出增加的蛋白水解穩定性的FVIIa變體；已經在第290位和第291位殘基之間或在第315位和第316位殘基之間經蛋白水解切割的凝血因子Vila(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48:501—505，1995);凝血因子Vila的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363:43-54，1999);在PCT/DK02/00189(相應於W002/077218)中公開的FVII變體；和在W002/38162(ScrippsResearchInstitute)中/>開的顯示出增加的蛋白水解穩定性的FVII變體；在WO99/20767、美國專利US6017882和US6747003、美國專利申請20030100506(UniversityofMinnesota)和WO00/66753、美國專利申i青US20010018414、US2004220106和US200131005、美國專利US6762286和US6693075(UniversityofMinnesota)中公開的FVII變體，其具有經修飾的Gla-結構域並顯示出增強的膜結合；和在WO01/58935、美國專利US6806063、美國專利申請20030096338(MaxygenApS)、WO03/93465(MaxygenApS)、WO04/029091(MaxygenApS)、WO04/083361(MaxygenApS)和WO04/111242(MaxygenApS)以及WO04/108763(CanadianBloodServices)中乂〉開的FVII變體。與野生型FVIIa相比具有增加的生物學活性的FVII變體的非限制性實例包括，在WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、PCT/DK02/00635(相應於WO03/027147)、丹麥專利申請PA200201423(相應於WO04/029090)、丹麥專利申請PA200101627(相應於WO03/027147)、WO02/38162(ScrippsResearchInstitute)中公開的FVII變體；和在JP2001061479(Chemo-Sero-TherapeuticResInst.)中公開的具有增強的活性的FVIIa變體。凝血因子VII的變體的實例包括，但不限於，L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII,K337A-FVII,M298Q-FVII,V158D/M298Q-FVII,L305V/K337A-FVI1，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,K157A-FVII,E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII,和S336G-FVII，L305V/K337A-FVI1，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVI1，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVI1，L305V/K337A/M298Q-FVI1，L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVI1，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII:U05V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/K316Q-FVII,S314E/L305V-FVILS314E/E296V-FVILK316H/L305V-FVII:K316H/E296V-FVII:K316Q/L305V-FVII:K316Q/E296V-FVILS314E/L305V/K337A-S314E/V158D-FVIIS314E/V158T-FVIIK316H/V158D-FVIIK316H/V158T-FVIIK316Q/V158D-FVIIK316Q/V158T-FVI1S314E/K316H-FVI1S314E/K337A-FVIIS314E/M298Q-FVIIK316H/K337A-FVIIK316H/M298Q-FVI1K316Q/K337A-FVIIK316Q/M298Q-FVI1-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVIIS314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVIIS314E/L305V/V158D/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158D/E296V-FVIIS314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVIIS314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVn，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D-FVI1，K316H/L305V/E296V-FVI1，K316H/L305V/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T-FVI1，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/M298Q-FVn，K316H/L305V/K337A/E296V-FVIIK316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVIIK316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVI1，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/U05V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V—FVII，K316Q/L305V/M298Q—FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158T-FVI1，K316Q/L305V/K337A/M298Q—FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158D-FVI1，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V-FVI1，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVI1，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVI1，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVI1K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVIIK316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVIIK316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337AK316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D-FVI1，F374Y/E296V-FVII,F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVI1，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVIIF374Y/L305V/E296V-FVII,F374Y/L305V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVIIF374Y/K337A/V158T-FVIIF374Y/K337A/E296V-FVIIF374Y/V158D/S314E-FVIIF374Y/V158D/E296V-FVIIF374Y/V158T/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E-FVIIF374Y/E296V/M298Q-FVI1FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII,FVII，FVII，F374Y/K337A-FVn，F374Y/M298Q-FVII,F374Y/L305V-FVII,F374Y/K337A/S314E-FVIIF374Y/K337A/M298Q-FVI1F374Y/K337A/V158D-FVIIF374Y/V158D/M298Q-FVIIF374Y/V158T/S314E-FVIIF374Y/V158T/E296V-FVI1F374Y/S314E/M298Q-FVIIF374Y/L305V/K337A/V158DF374Y/L305V/K337A/M298Q-FVI1F374Y/L305V/K337A/S314E-FVIIF374Y/L305V/V158D/M298Q-FVIIF374Y/L305V/E296V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/E296V/S314E-FVIIF374Y/L305V/M298Q/S314E-FVIIF374Y/K337A/S314E/V158T-FVIIF374Y/K337A/S314E/E296V-FVI1F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVIIF374Y/K337A/M298Q/E296V-FVIIF374Y/K337A/E296V/V158D-FVIIF374Y/V158D/S314E/E296V-FVIIF374Y/V158T/S314E/E296V-FVIIF374Y/V158T/M298Q/E296V-FVIIF374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E.F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E'F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E'F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337AF374Y/L305V/E296V/M298Q/S314EF374Y/V158D/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D/E296y/M298Q/S314EF374Y/L305V/V158D/K337A/S314EF374Y/V158D/M298Q/K337A/S314EF374Y/V158D/E296V/K337A/S314EF374Y/L305V/V158D/E296V/M298QF374Y/L305V/V158D/M298Q/K337AF374Y/L305V/V158D/E296V/K337AF374Y/L305V/V158D/M298Q/S314EF374Y/L305V/V158D/E296V/S314EF374Y/L305V/K337A/V158T-FVIIF374Y/L305V/V158D/E296V-FVIIF374Y/L305V/V158D/S314E-FVIIF374Y/L305V/E296V/V158T-FVIIF374Y/L305V/M298Q/V158T-FVIIF374Y/L305V/V158T/S314E-FVIIF374Y/K337A/S314E/M298Q-FVIIF374Y/K337A/S314E/V158D-FVIIF374Y/K337A/V158T/E296V-FVIIF374Y/K337A/M298Q/V158D-FVIIF374Y/V158D/S314E/M298Q-FVIIF374Y/V158D/M298Q/E296V-FVIIF374Y/V158T/S314E/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII國FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVII-FVIIF374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVI1，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVI1，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVI1，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVI1，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVI1，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVn，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVI1，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVn,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVI1，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVI1，S52A-凝血因子VII，S60A-凝血因子VII;R152E-凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，T106N-FVII,K143N/N145T-FVI1，V253N-FVII，R290N/A292T-FVI1，G291N-FVII,R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;以及在233Thr-240Asn的胺基酸序列中具有置換、添加或缺失的FVII;在304Arg-329Cys的胺基酸序列中具有置換、添加或缺失的FVII;和在15311e-223Arg的胺基酸序列中具有置換、添加或缺失的FVII。因此，凝血因子VII多肽中的置換變體包括但不限於在位置PIO、K32、L305、M306、D309、L305、L305、F374、V158、M298、V158、E296、K337、M298、M298、S336、S314、K316、K316、F374、S52、S60、R152、S344、T106、K143、N145、V253、R290、A292、G291、R315、V317處的置換，以及在從T233至N240或從R304至C329;或從1153至R223的胺基酸序列中的置換、添加或缺失，或它們的組合，特別是變體例如P10Q、K32E、L305V、M306D、D309S、L305I、L305T、F374P、V158T、M298Q、V158D、E296V、K337A、M298Q、M298K、S336G、S314E、K316H、K316Q、F374Y、S52A、S60A、R152E、S344A、T106N、K143N、N145T、V253N、R290N、A292T、G291N、R315N、V317T,以及從T233至N240,或從R304至C329，或從1153至R223的胺基酸序列中的置換、添加或缺失，或它們的組合。在某些實施方案中，凝血因子VII多肽是人凝血因子Vila(hFVIIa),優選重組製備的人凝血因子Vila(rhVIIa)。在其他實施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII序列變體。在某些實施方案中，凝血因子VII多肽具有不同於野生型人凝血因子VII的糖基化。勿應在實施本發明中，所述細胞是真核生物細胞，更優選已建立的真核生物細胞系，包括但不限於CHO(例如ATCCCCL61)、C0S-1(例如ATCCCRL1650)、幼倉鼠腎(BHK)和HEK293(例如ATCCCRL1573;Graham等人，/.Ce/.K/ro厶36:59-72，1977)細胞系。優選的BHK細月包系是tk—tsl3BHK細月包系(Waechter和Baserga，戶roc.#"7.C2'.yW79:1106-1110，1982),下文中稱為BHK570細胞。BHK570細胞系可從美國典型培養物保藏中心，12301ParklawnDr.，Rockville，MD20852，在ATCC登記號CRL10314下獲得。tk-tsl3BHK細胞系還可以從ATCC在登記號CRL1-632下獲得。優選的CHO細胞系是可從ATCC在登記號CC161下獲得的CH0Kl細胞系。其他合適的細胞系包括但不限於RatHepI(大鼠肝瘤；ATCCCRL1600)，RatHepII(大鼠肝瘤；ATCCCRL1548),TCMK(ATCCCCL139)，人肺(ATCCHB8065)，NCTC1469(ATCCCCL9.1);DUKX細胞(CH0細胞系)(Urlaub和Chasin，Jcad.M」77:4216-4220，1980)(DUKX細胞也稱為訓ll細胞),和DG44(CHO細胞系)(Ce//，33:405,1983，和So肌〃cCe//#o/ec"73i"(7e/e〃"12:555，1986)。同樣可以使用的是3T3細胞、Namalwa細胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其他細胞的融合細胞。在一些實施方案中，細胞可以是突變細胞或重組細胞，例如表達與它們所源自的細胞類型相比在性質或數量上不同的酶i瞽的細胞，其中所述酶催化蛋白質的翻譯後修飾(例如，糖基化酶如糖基轉移酶和/或糖普酶，或者加工酶，例如前肽)。合適的昆蟲細胞系還包括但不限於鱗翅目昆蟲細胞系，例J(口草地夜蛾(5^odo/^era/Vi^i'/erc^)細月包或粉糹丈夜蛾(7y/c/op/^/a/n')細胞(參見，例如US5,077,214)。在某些實施方案中，用於實施本發明的細胞能夠在懸浮培養中生長。如本文所使用的，懸浮-勝任性細胞(suspension-competentcell)是可以在懸浮液中生長而不形成大的、牢固的聚集體的細胞，即為單分散的或在每個聚集體中只有少數細胞的鬆散聚集體中生長的細胞。懸浮-勝任性細胞包括，但不限於，無需適應或處理即可在懸浮液中生長的細胞(例如，造血細胞或淋巴樣細胞)，和通過使附著依賴性細胞(例如，上皮細胞或成纖維細胞)逐漸適應懸浮生長而製成懸浮-勝任性狀態的細胞。用於實施本發明的細胞可以是粘附細胞(也稱為貼壁依賴性或附著依賴性細胞)。如本文所使用的，粘附細胞是需要將其自身粘附或錨定至合適表面以進行增殖和生長的那些細胞。在本發明的一個實施方案中，所使用的細胞是粘附細胞。在這些實施方案中，繁殖階段和生產階段包括微載體的使用。所使用的粘附細胞應當能夠在繁殖階段期間遷移到載體上(並且如果使用大孔栽體，則遷移到載體的內部結構中)，並且當轉移至生產生物反應器中時遷移至新載體。如果粘附細胞沒有足夠的能力通過自身遷移至新載體，那麼可以通過使包含細胞的微載體與蛋白水解酶或EDTA接觸來將它們從載體中釋放出來。所使用的介質(特別是當不含動物來源組分時)應進一步包含適合於支持粘附細胞的組分；用於培養粘附細胞的合適的介質可從供應商例如Sigma獲得。細胞還可以是懸浮-適應性或懸浮-勝任性細胞。如果使用此類細胞，那麼可以在懸浮液中進行細胞的繁殖，因此微載體只在生產培養容器本身中的最後繁殖階段中和在生產階段中使用。在懸浮-適應性細胞的情況下，所使用的微載體通常是大孔載體，其中細胞通過物理包載在載體的內部結構中而附著其上。在這樣的實施方案中，真核細胞一般選自CH0、BHK、HEK293、骨髓瘤細胞等。本發明的方法通常在攪拌培養容器中進行，並且優選採用基於微載體的方法類型。在基於微載體的方法中，細胞已遷移至載體(大孔載體)的內部結構中或已將其自身附著至載體(固體載體)表面，或兩者。在基於微載體的方法中，最初將真核細胞、微載體和細胞培養液置於培養容器中。在接下來的幾天裡，如果培養體積沒有達到開始時容器的最終工作體積，那麼可以加入額外的細胞培養液。在接下來的時間內，定期收穫包含產物的培養物上清液並用新的培養液替換，直至培養最終結束。當收穫包含產物的上清液時，停止攪動例如攪拌培養物，並在允許包含細胞的載體沉澱後取出包含產物的細胞培養物上清液部分。為了改進程序的總體結果，優選地可以在收穫包含產物的上清液之前應用冷卻步驟，參見，例如W003/029442。在某些實施方案中，在允許載體沉澱之前將培養液冷卻至約18°C-約32°C，或約20°C-約30。C，或約22°C-約28。C的溫度。細胞培養程序的其他可應用的變化形式公開於WO02/29084中。繁殖步驟在達到其中有規律地收穫包含產物的培養物上清液以用於進一步下遊處理的生產階段前，根據可能適合於所考慮的特定細胞的任何方案或規程來繁殖細胞。繁殖階段可以是單步驟或多步驟的程序。在單步驟的繁殖程序中，從貯庫中取出細胞並直接接種至其中將進行生產的包含微栽體的培養容器中。在多步驟的繁殖程序中，從貯庫中取出細胞，並通過逐漸增加尺寸的多個培養容器進行繁殖，直至到達其中將進行生產的包含微載體的最終培養容器。在繁殖步驟期間，細胞在對於生長來說進行了優化的條件下生長。培養條件，例如溫度、pH、溶解氧張力(tension)、溶解C02濃度等是已知對於特定細胞來說是最優的那些，並且對於本領域技術人員來說將是顯而易見的(參見，1"列i口，爿/z/邁a7Ce//Cw/fwre..^戶racf/ca/JpproacA岸二成，Rickwood:D.和Hames，B.D.，編者，OxfordUniversityPress,NewYork(1992))。在一種方法中，細胞培養過程在一個培養容器中進行將細胞直接接種到其中將進行生產的包含微載體的培養容器中；讓細胞進行繁殖直至達到適合的細胞密度，並開始生產階段。在另一種方法中，細胞培養過程在至少2個不同的培養容器中進行一個或多個種子培養容器(第一繁殖步驟)，隨後為生產培養容器(最後的繁殖步驟，隨後為生產階段)。在第一繁殖步驟中，將表達所需多肽的細胞接種到包含培養基的種子培養容器中，並進行繁殖直至細胞到達最小交叉移種密度(minimumcross-seedingdensity)。隨後，將繁殖的種子培養物轉移至包含(a)培養基和(b)微載體的生產培養容器中。在這個培養容器中，在細胞遷移至固體載體的表面或大孔載體的內和外表面上的條件下培養細胞，並且它們在該最後的繁殖步驟中持續生長直至載體完全被細胞佔據。在該最後的繁殖步驟期間，通過允許微載體下沉至培養容器底部來進行介質更換，之後取出預定罐體積百分比的介質並向容器中加入相應罐體積百分比的新鮮介質。然後，將微載體重懸浮於介質中，並且以預定的時間間隔，例如每24小時重複這一取出介質和替換的過程。所替換的介質的量取決於細胞密度，並且一般可以是罐體積的10-95%,優選25%-80%,如下表1中所示。應當理解，在其中繁殖階段是多步驟程序的方法中，繁殖可以在逐漸增加尺寸的培養容器中進行，直至獲得足夠數目的細胞用於進入最終的培養容器。例如，可以順次使用一個或多個5L、50L、100L或500L的培養容器。種子培養容器一般具有5L至1000L的容量。通常，以約0.2-0.4x1(T細胞/mL的初始密度將細胞接種到種子培養容器中，並進行繁殖直至培養物達到約1.Gx16細胞/mL的細胞密度。通常，最小交叉移種密度為約0.8-約1.5x1(T細胞/mL。適合於生產所需多肽例如凝血因子VII的一些設定點(set-point)不一定必需適合於細胞的最初生長(在種子培養中或在微載體上)。例如，所述兩個階段的溫度、溶解氧張力、溶解C02濃度和pH可以不同。在繁殖過程中進行介質更換以使細胞保持存活和生長，而不收穫培養物上清液用於下遊處理。在下面的表1中概括了用於在最終培養容器(包含微載體)中的最後繁殖步驟的可能培養條件。表1tableseeoriginaldocumentpage22-在下列時才幾更換在l.0—12.Ox10'在l.0-12.Ox106在2.0-10x106細在2.0—10x106細的培養基的％細胞/mL時更換60細胞/mL時更換80月^/mL時更換80%月&AnL時更換80%-90%的培養基%的培養基的培養基的培養基生產階段除了對於本發明方法而限定的特徵和措施外，需要採取許多其他措施用於生產以得到令人滿意的結果，如下文中將進行描述的。當細胞密度達到適合於開始生產階段(即適合於對包含產物的培養物上清液進行下遊處理)的值時，每24小時收穫60-95%的培養物上清液，優選80%。這個細胞密度值一般為1-12x1(T細胞/mL。設定點可以在這時進行改變，並且設定在適合於生產所需多肽的值上。通過允許微載體下沉至罐底部來進行介質更換，之後取出所選罐體積百分比的介質並向罐中加入相應罐體積百分比的新鮮介質。一般替換25-90%的罐體積；優選地，用新鮮介質替換80%的罐體積。然後，將微載體重懸浮於介質中，並且一般每10-48小時，優選地每24小時重複這一取出介質和替換的過程。該過程的這個方面的概述顯示於表2中。表2設定點範圍優選範圍優選值C優選值D溶解C。2濃度80-200ramHg100-環mmHg120-180mmHg120-160mmHg6-86.6_7.6對於CHO為7.0,和對於B服為6.7-6.9對於CHO為7.0,和對於BHK為6.7-6.9溫度26-40'C30-37。C36。C36'C溶解氧張力10-90%飽和20-80%飽和50%50%-更換的培養基的％每10-48小時更換25-90%的培養基每10-48小時更換80%的培養基每24小時更換80%的培養基每24小時更換80%的培養基任選地，當進入生產階段時和在生產階段過程中可以採用培養的溫度設定點的下降。當進入生產階段時，通常將溫度、溶解氧張力、溶解C02濃度、工作pH和介質更換頻率改變為對於生產來說最佳的值。從表1和表2中可以分別看出生長和生產階段中的溫度範圍和值的實例。在生產階段期間，對於CH0細胞系來說優選約36X:的溫度。微裁謬如本文所使用的，微載體是足夠小以允許它們在懸浮培養(以對細胞不引起明顯剪切損害的攪拌速率)中使用的顆粒。它們是固體的、多孔的，或具有在表面上有塗層的固體核。微載體可以例如，但不限於，是基於纖維素或葡聚糖的，並且它們的表面(在多孔載體的情況下是內和外表面)可以是帶正電的。進一步的細節可以在W002/29083和"Microcarriercel1culture，principlesandmethods.AmershamPharmaciaBiotech.18-1140—62.EditionAA"中找到。在一系列實施方案中，微載體具有約150-350um的總體顆粒直徑；並且具有約0.8-2.Omeq/g的正電荷密度。在一系列實施方案中，微栽體是固體載體。有用的固體微載體包括，但不限於，Cytodex1和Cytodex2(GEHealthcare)。固體載體特別適合於粘附細胞(貼壁依賴性細胞)。在另一系列實施方案中，微栽體是大孔載體。如本文所使用的，大孔載體是顆粒，例如基於纖維素的，其具有下列性質(a)它們足夠小以允許它們在懸浮培養(以對細胞不引起明顯剪切損害的攪拌速率)中使用；和(b)它們具有足夠大小的孔和內部空間以允許細胞遷移至顆粒的內部空間中。在一個實施方案中，它們的表面(內和外)可以是帶正電的。在一系列實施方案中，所述載體(a)具有約l50-350um的總體顆粒直徑；(b)具有平均孔開^:直徑(poreopeningdiameter)為約15-約40um的孔；和(c)具有約0.8-2.0meq/g的正電荷密度。在某些實施方案中，通過DEAE(N，N，-二乙基氨基乙基)基團提供正電荷。有用的大孔載體包括，但不限於，Cytoporel和Cytopore2(GEHealthcare)。特別優選的是Cytopore1載體，它具有230um的平均顆粒直徑，30um的平均孔大小，和1.1meq/g的正電荷密度。義說一#培#務伴如本文所使用的，大規模培養容器具有至少約100L的容量，優選至少約500L，更優選至少約1000L,和最優選至少約5000L。在細胞培養過程在至少2個不同的培養容器中進行運作的情況下，例如一個或多個種子培養容器(第一繁殖步驟)，隨後為生產培養容器(最後的繁殖步驟，隨後為生產階段)，該過程一般包括將約50L經增殖的種子培養物(約1.Ox16細胞/mL)轉移至包含150L培養基的500L培養容器中。在適當的例如溫度、pH、溶解氧張力(DOT)、溶解C2濃度和攪動速率條件下維持大規模培養，並且通過向培養容器中加入介質而逐漸增加體積。在微載體方法的情況下，培養容器還包括相應於I-IOg/L的最終微載體濃度的微載體量。轉移後，細胞通常在最初24小時內遷移至載體的表面上或的栽體的內部中。術語"細胞培養液"和"培養基"(或簡單地稱為"介質")指用於培育真核細胞的營養液，它一般提供至少一種來自一個或多個下列類別的組分(1)促成介質重量摩爾滲透壓濃度的鹽，例如鈉、鉀、鎂和鈣；(2)能量來源，通常為碳水化合物的形式例如葡萄糖；(3)所有必需胺基酸，並且通常為基本的那一組20種胺基酸；(4)以低濃度需要的維生素和/或其他有機化合物；和(5)微量元素，其中微量元素被定義為一般以極低濃度需要的，通常處於微體積摩爾濃度範圍內的無機化合物。所述營養液可以任選補充有一種或多種來自下列任一類別的組分(a)激素及其他生長因子，例如胰島素、轉鐵蛋白和表皮生長因子；和(b)蛋白質和組織的水解產物。優選地，細胞培養基不包含任何源自動物的組分。重要地，細胞培養液包含如上文進一步限定的植物蛋白水解產物。本發明包括在缺乏動物來源組分的介質中培養真核細胞。如本文所使用的，"動物來源"組分是在完整動物中產生的(例如，從血清中分離和純化的蛋白質)或通過使用在完整動物中產生的組分來生產的(例如，通過使用從動物中分離和純化的酶來水解植物來源的材料而製得的胺基酸)任何組分。相反地，具有動物蛋白序列(即具有動物基因組來源)但在介質中於體外在細胞培養中(例如在重組酵母或細菌細胞中，或在重組或非重組的已建立的連續真核細胞系中)產生的蛋白質不是"動物來源"組分，所述介質缺乏在完整動物中產生並從中分離和純化出的組分，(例如，在酵母或細菌細胞中產生的胰島素，或在已建立的哺乳動物細胞系例如CH0、BHK或HEK細胞中產生的胰島素，或在Namalwa細胞中產生的幹擾素)。例如，具有動物蛋白序列(即具有動物基因組來源)但在缺乏動物來源組分的介質中於重組細胞中產生的蛋白質(例如，在酵母或細菌細胞中產生的胰島素)不是"動物來源組分"。因此，缺乏動物來源組分的細胞培養基是可以包含重組產生的動物蛋白的細胞培養基；然而，這樣的培養基不包含例如動物血清或者從動物血清中純化的蛋白質或其他產物。這樣的培養基可以例如包含一種或多種來源於植物的組分。可以使用在本發明的條件下支持細胞生長和維持的任何細胞培養基，特別是缺乏動物來源組分的細胞培養基。通常，培養基包含水、重量摩爾滲透壓濃度調節劑、緩衝液、能量來源、胺基酸、無機或重組的鐵源、一種或多種合成或重組的生長因子、維生素和輔助因子。在一個實施方案中，培養基缺乏動物來源組分並缺乏蛋白質("無蛋白質的")。缺乏動物來源組分和/或蛋白質的培養基可從供應商例如Sigma、SAFCBiosciences、Gibco和Gemini獲得。除了常規組分外，適合於生產凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的介質包含維生素K,其是凝血因子VII中的穀氨酸殘基的Y-羧化作用所必需的，濃度為約0.l-50mg/L，優選約0.5-25mg/L，更優選約1-10mg/L，和最優選約5mg/L。適合於在本發明中使用的介質可從供應商例如Gibco和SAFCBiosciences獲得。在一個實施方案中，介質如表3a中所示構成。下表(表3a)是適合於在本發明中使用的介質的組成。表3atableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28tableseeoriginaldocumentpage29在一個實施方案中，介質如表3b中所示構成。下表(表3b)是適合於在本發明中使用的介質的組成。表3btableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31介質優選是缺乏動物來源組分的介質。在一個實施方案中，介質是商購可得的、缺乏動物來源組分的、無蛋白質的CHO介質(SAFCBiosciences)。在某些實施方案中，在本發明實施中使用的細胞適應於在缺乏動物來源組分的介質，例如缺乏血清的介質中懸浮生長。這樣的適應程序4笛述於，j:i口Scharfenberg，等人,」//邁a/Ce//Tec力/2o/o^K"e7e/o/7/z7e/^5"fo『ar^51f力eCe//^r/,E.C.Beuvery等人(編者)，KluwerAcademicPublishers,第619—623頁，1995(BHK和CH0細月包)；Cruz,"/Wec/wo/.7bc力.11:117—120,1997(昆蟲細胞)；Keen,Cj^c^ec力"o/.17:203-211，1995(骨髓瘤細胞)；Berg等人，A/Wec力//《"^14:972-978，1993(人腎293細胞)中。在一個特別優選的實施方案中，宿主細胞是BHK21或CH0或HEK293細胞，它們已被改造成表達人凝血因子VII，並且已適應在不存在血清或動物來源組分的情況下生長。在本發明中可用的培養容器可以例如基於常規的攪拌罐式反應器(CSTR)，其中攪動通過常規葉輪類型而獲得，或者氣升式反應器，其中攪動通過從容器底部導入空氣而獲得。一般控制在特定界限內的進一步的參數包括pH、溶解氧張力(DOT)、溶解C0,濃度和溫度。溶解氧張力可以通過例如噴射純氧來維持。溶解C02濃度可以通過噴射空氣來維持。溫度控制媒介物一般是水，必要時加熱或冷卻。水可以流過圍繞容器的夾套或流過浸入培養物中的盤管。術語"培養容器"可以與"罐"、"反應器"、"發酵罐"和"生物反應器"互換使用。下遊處理一旦將介質從培養容器中取出，就可對其實施一個或多個處理步驟以獲得所需蛋白質，包括，但不限於，離心或過濾以去除沒有固定在載體中的細胞；親和色譜，疏水相互作用色譜；離子交換色譜；大小排阻色譜；電泳程序(例如製備型等電聚焦(IEF)電泳)，差異溶解度(例如，硫酸銨沉澱)，或提取等。一般可參見，Scopes,屍rofe//7屍wW/7ca〃叫Springer-Verlag,NewYork,1982;和戶rc^e/"屍wr/Z7ca〃0/，J._C.Janson和LarsRyden，編者,VCHPublishers，NewYork,1989。凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的純化可以涉及，例如在抗凝血因子VII抗體柱上的親和色譜(參見，例如，Wakabayashi等人，/."/o人C力e瓜261:11097，1986;和Thim等人，"/oc力e瓜27:7785，1988)，和通過蛋白水解切割而激活，其中使用凝血因子XIIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其他蛋白酶，例如凝血因子IXa、激肽釋it酵、凝血因子Xa和凝血酵原、。參見，伊J^t口0sterud等人，^'oc力e瓜11:2853(1972);Thomas,美國專利號4，456，591;和Hedner等人，/.//^eW.71:1836(1983)。備選地，凝血因子VII可以通過使其經過離子交換色譜柱，例如MonoQ(Pharmacia)等，來激活。下列實施例旨在作為本發明的非限制性的舉例說明。實施例實施例1:無血清地生產凝血因子VII(小型中試規模培養)進行下列實驗以在小型中試規模培養(20L)中生產凝血因子VII。圖1中顯示了培養過程的流程圖。該過程的生產部分是高細胞密度(HCD)過程，其中細胞藉助於微載體而保留在發酵罐中。從FVII生產性細胞系的細胞庫中解凍出細胞。該FVII生產性細胞系是CH0K1細胞系，其用編碼凝血因子VII的基因轉染，並且適應於在不存在動物來源組分的情況下在無血清懸浮液中生長。解凍後，細胞順次在增加尺寸的旋轉瓶中在無動物來源組分的液體介質中繁殖。用於繁殖的介質含有濃度為約5.0g/L的大豆蛋白水解產物。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加體積。所使用的介質不含血清及其他動物來源組分。當體積達到4L，並且細胞數目達到《0.8x107ml時，將旋轉瓶的內容物轉移至20L攪拌罐式反應器(小型中試規模生產發酵罐)中。該生產發酵罐包含大孔Cytopore載體(GEHealthcare)，並且在將細胞轉移至生產發酵罐中後，將細胞在24小時內固定在載體中。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加生產發酵罐中的體積。幾天後，當體積達到20L時，開始生產階段。在生產發酵罐中使用的介質含有濃度為1.25g/L(實施方案a)或5.0g/L(參照)的大豆蛋白水解產物。在生產階段期間，每24小時進行介質更換停止攪動以允許載體沉澱，隨後收穫約80%的培養物上清液並用新介質替換。將收穫的培養物上清液轉移以用於下遊處理。在生產階段中該過程以這種方式進行數周。在生產發酵罐中的培養物在約36。C的溫度，約50%用空氣飽和的溶解氧水平，和約100-150mmHg的溶解C02水平下維持。在生產階段期間，細胞密度達到1-2x1(T細胞/ml，並且在每日收穫物中的FVII濃度達到10-20mg/L。pH維持在6.70以上。圖2中的圖表顯示了來自在20L發酵罐(小型中試規模發酵罐)中的微載體培養的結果。該圖表舉例說明了，當在生產發酵罐中使用1.25g/L大豆水解產物代替5.0g/L大豆水解產物時，與凝血因子VII生產率有關的穩定性的差異。實施例2:無血清地生產凝血因子VII(大型中試規模培養)從FVII生產性細胞系的細胞庫中解凍出細胞。該FVII生產性細胞系是CH0K1細胞系，其用編碼凝血因子VII的基因轉染，並且適應於在不存在動物來源組分的情況下在無血清懸浮液中生長。解凍後，細胞順次在增加尺寸的旋轉瓶中在無動物來源組分的液體介質中繁殖。用於繁殖的介質含有濃度為約5.0g/L的大豆蛋白水解產物。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加體積。所使用的介質不含血清及其他動物來源組分。當體積達到4L，並且細胞數目達到《0.8x107ml時，將旋轉瓶的內容物轉移至50L攪拌罐式反應器(種子發酵罐)中。在50L發酵罐中用於繁殖的介質含有濃度為約5.0g/L的大豆蛋白水解產物。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加體積。所使用的介質不含血清及其他動物來源組分。當體積達到50L，並且細胞數目達到a1.0xl0Vml時，將50L發酵罐的內容物轉移至500L攪拌罐式反應器(大型中試規模生產發酵罐)中。該生產發酵罐包含大孔Cytopore載體(GEHealthcare)，並且在將細胞轉移至生產發酵罐中後，將細胞在24小時內固定在載體中。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加生產發酵罐中的體積。幾天後，當體積達到450L時，開始生產階段。在生產發酵罐的繁殖階段中使用的介質含有濃度為5g/L的大豆蛋白水解產物，而在生產階段中使用的介質含有濃度為1g/L的大豆蛋白水解產物(實施方案a)。在參照運行中，介質在繁殖階段中含有的大豆蛋白水解產物的濃度與在生產階段中一樣。在生產階段期間，每24小時進行介質更換停止攪動以允許載體沉澱，隨後收穫約80%的培養物上清液並用新介質替換。將收穫的培養物上清液轉移以用於下遊處理。在生產階段中該過程以這種方式進行數周。在生產發酵罐中的培養物在約36。C的溫度，約50%用空氣飽和的溶解氧水平，和約100-150mmHg的溶解0)2水平下維持。在生產階段期間，細胞密度達到1-2x17細胞/ml,並且在每日收穫物中的FVII濃度達到10-20mg/L。pH維持在6.70以上。圖3中的圖表顯示了來自在500L發酵罐(大型中試規模發酵罐)中的微載體培養的結果。該圖表舉例說明了，當在生產發酵罐的生產階段中使用1g/L大豆水解產物代替5g/L大豆水解產物時，與凝血因子VII生產率有關的穩定性的差異。實施例3:無血清地生產凝血因子VII(大規模)從FVII生產性細胞系的細胞庫中解凍出細胞。該FVII生產性細胞系是CHO細胞系，其用編碼凝血因子VII的基因轉染，並且適應於在無血清懸浮液中生長。解凍後，細胞順次在增加尺寸的旋轉瓶中繁殖。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加體積。所使用的介質不含血清及其他動物來源組分。最後，將4L旋轉培養物轉移至第一個種子發酵罐步驟(50L發酵罐)。隨著細胞數目增加，將種子發酵罐中的體積逐漸增加至50L。然後將50L種子培養物轉移至第二個種子發酵罐步驟(500L發酵罐)。隨著500L種子發酵罐中的細胞數目增加，將體積逐漸增加至500L。生產發酵罐(5000L)包含大孔Cytopore栽體(GEHealthcare)，並且在將細胞轉移至生產發酵罐中後，將細胞在24小時內固定在載體中。隨著細胞數目增加，通過添加新介質來逐漸增加生產發酵罐中的體積。旋轉瓶、種子發酵罐和生產發酵罐的繁殖階段中的介質含有濃度(d)為約5g/L的大豆水解產物。幾天後，當體積達到4500L時，開始生產階段。在生產階段期間，每24小時進行介質更換停止攪動以允許載體沉澱，隨後收穫約80%的培養物上清液並用新介質替換。生產階段中的介質含有濃度(C2)為約1g/L的大豆水解產物。將收穫的培養物上清液轉移以用於下遊處理。在生產階段中該過程以這種方式進行數周。在生產發酵罐中的培養物在約36。C的溫度，約50%用空氣飽和的溶解氧水平，和在100-180mmHg例如100-150miiiHg範圍內的溶解C02水平下維持。安裝好所有生物反應器(50L、500L、5000L)以控制溫度、溶解氧(通過微量噴射器噴射氧)、攪動速率、頂部空間通氣速率和pH(通過向頂部空間添加C02氣體向下調控，而不通過添加鹼向上調控)。此外，安裝好生產發酵罐(5000L)以控制溶解的C02。藉助於YSI8500CO廣裝置進行在線COr測量。根據0)2信號，通過經由管將大氣空氣噴射到液體中來控制co2水平。當co2濃度在設定點或以下時，將噴射速率設定為0L/分鐘/L培養液，和當C02濃度處於設定點以上時，將噴射速率設定為0.01-0.05L/分鐘/L培養液。在生產階段期間，細胞密度達到1-2x107細胞/ml,並且在每日收穫物中的FVII濃度達到10_20mg/L。pH維持在6.70以上。權利要求1.用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，並且其中第一種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C1)和第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5∶1(C1∶C2)。2.根據權利要求l的方法，其中所述比例C1:&為2:1-10:1。3.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述濃度G為0.2-3.5g/L。4.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述濃度d為4.0-10.0g/L。5.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述植物蛋白水解產物是大豆蛋白水解產物。6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述多肽是凝血因子VII多肽。7.用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述第一種細胞培養液包含濃度為4.0-10.0g/L的大豆蛋白水解產物，所述第二種細胞培養液包含濃度為0.2-3.5g/L的大豆蛋白水解產物，並且其中所述笫一種細胞培養液中大豆蛋白水解產物的濃度(c,)和所述第二種細胞培養液中大豆蛋白水解產物的濃度(c2)之比為至少1.5:1(d:C2)。8.用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產凝血因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中使所述細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中所述細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，例如大豆蛋白水解產物，並且其中所述第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)為0.7-3.0g/L。9.根據權利要求8的方法，其中所述濃度C2為0.9-2.5g/L。10.根據權利要求8-9中任一項的方法，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，並且其中所述第一種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(d)和所述第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5:1。11，根據權利要求10的方法，其中所述濃度d為4.0-10.0g/L。12.根據權利要求l-6、7和8-11中任一項的方法，其中所述植物蛋白水解產物的濃度具有下列特性在所述繁殖階段中的高濃度(d);在所述生產階段中的低濃度-低水平A(C2A)在所述生產階段中的低濃度-低水平B(C2B)在所述生產階段中的低濃度-低水平A(C2A)在所述生產階段中的低濃度-低水平B(C2B);等，其中d》C2B〉C"，並且濃度Cu和"在對於C2而指定的濃度範圍內，並且其中當觀察到細胞數目減少時，進行從低水平A(Cu)至低水平B(C2B)的首次轉換，和當細胞數目已恢復至大約相應於減少前水平的水平時，進行從低水平B(C2B)至低水平A(C2A)的後續轉換。全文摘要本發明涉及用於在包含在無血清培養液中的真核細胞中大規模生產多肽的方法，所述方法包括(i)所述細胞的繁殖階段，其中細胞在第一種細胞培養液中繁殖，和(ii)所述細胞的生產階段，其中細胞存在於第二種細胞培養液中，其中所述細胞培養液各自包含植物蛋白水解產物，並且其中第一種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C1)和第二種細胞培養液中植物蛋白水解產物的濃度(C2)之比為至少1.5∶1(C1∶C2)。文檔編號C12P21/02GK101120085SQ200680004744公開日2008年2月6日申請日期2006年2月6日優先權日2005年2月11日發明者I·M·克努德森申請人:諾和諾德醫療保健公司