一種抗不育症和提高生育力的藥劑的製作方法
2023-04-23 16:15:46
專利名稱：一種抗不育症和提高生育力的藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及局部麻醉藥在製備用於抗不育症或用於提高生育力的藥劑方面的應用。它還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括藥物上有效劑量的局部麻醉藥和藥物上可接受的賦形劑。它還涉及一種用所述藥物組合物提高婦女生育力的方法。
不育症或低生育力會是為該病苦惱的人們的一個難題。對不生育婦女的常規療法是IVF(體外授精)治療。該IVF療法的基礎如下刺激排卵每天激素注射，超聲檢查和血樣。
恢復卵母細胞用局部麻醉法經陰道進行超聲波引導的卵巢穿刺。
精子的預備遊上，遊下，精子選擇或者選擇具有最好的前進活動性的最佳精子群體的其它方法。
體外授精在細胞培養箱中將卵母細胞和選定的精子群體培養。直接顯微鏡檢查細胞分裂和選擇最有活力的胚細胞。
胚胎轉移將2～3個活力最強的胚細胞置於子宮腔內進行有希望的子宮內膜中植入。
IVF療法是一種昂貴的方法，對於一些夫婦來說，它會引發複雜的心理副作用。試圖懷孕的該技術性的人工方法對於經歷該療法的夫婦來說具有不利作用，該療法會不利地影響夫妻關係。在整個該煩瑣的治療之後，只有25～30％的懷孕率，其餘那些未獲成功的夫妻其關係遭到破壞並且仍無孩子。IVF治療的費用是每個月經周期約20000～25000SEK。
雖然以前進行了一些研究，但子宮內膜異位期間不育症的原因尚未弄清，也不清楚治療後缺乏改善的生育率的原因。尤其是還不清楚不存在骨盆粘連時輕度子宮內膜異位與低生育力之間的關係(Mahmood，TA，Templeton A.輕度子宮內膜異位的病理生理學文獻綜述。人類生殖(Human Reproduction)1990；5765～784)。
已在帶有子宮內膜的腹膜植入物的患者腹膜液(PF)中發現了白細胞數增多，並認為是一種發作的不生育炎症(Haney AF，Muscato JJ，Weinberg JB不育症患者中的腹膜液細胞群。生育與不孕(FertilSteril)1981，35696～698；Edelstam GAB.Lundkvist OE，Venge P，Laurent TC生殖器炎症過程中腹膜液內的透明質(hyaluronan)和髓過氧化物酶。炎症(Inflammation)1994，1813～21)。數目增加的白細胞含有活體內接觸過抗原的巨噬細胞，該巨噬細胞分泌巨噬細胞衍生的生長因子(MDGF)，這可以解釋子宮內膜組織的增殖(Halme J，White C，Kauma S，Estes J，Haskill S。子宮內膜異位患者的腹膜巨噬細胞體外釋放生長因子活性。臨床內分泌學和代謝雜誌(J Clin Endocrin andMetabolism)，1988；661044～49)。得自巨噬細胞的其它分泌產物，生長因子例如TNF和幹擾素，表現出配子毒性並且還可能對生育過程產生不利影響(Halme J子宮內膜異位相關性不育症中腹膜炎的作用。AnnN Y Acad Sci 1991；622266～74)。
無細胞的腹膜液也對生殖力降低有重要作用，因為已證實它顯著降低輸卵管傘獲取卵子的能力(Suginami H，Yano K，Watanbe K，Matsnura S子宮內膜異位腹膜液中存在的抑制輸卵管傘捕獲卵子的因素。生育與不孕1986；461140～1146)。已在患有子宮內膜異位和未解釋的不育症的患者腹膜液中分別發現了精子前進速度的降低(Makarand K，Oak M，Chantler EN，Vaughan Williams CA，Elstein M.對患有子宮內膜異位和未解釋的不育症的不育婦女腹膜液中精子存活率的研究。臨床生殖和生育力(Clinical reproduction and fertility)1985；3297～303)。甚至更有趣的是，在與得自患子宮內膜異位的患者的腹膜液進行24小時體外培養過程中發現了精子吞噬作用的增大(Muscato JJ，Haney AF，Weinberg JB，人腹膜巨噬細胞對精子的吞噬作用子宮內膜異位中一個可能的不育原因。美國婦產科學雜誌(Am J ObstetGynecol)1982；144503～510)。然而，在該具體研究中存在數個不同的精子供體，所以不能排除包括的免疫因素。
本發明是一種用於婦女授精的IVF療法的替代方法。已通過體外研究發現了利多卡因可減小精子吞噬作用。認為利多卡因的該效果是由於通過阻止Na+滲透性的增大和通過可能干擾細胞膜中ATP而引起細胞膜的穩定化。該療法的費用將大約是IVF療法的10％，例如每個月經周期2500SEK。不存在可引起心理副作用的技術授精過程。該療法可對患有子宮內膜異位和/或輕度機械原因的不育症的患者試用。可在等候IVF時實施該療法並且不會影響後續IVF療法的成功可能性。
迄今，文獻中未報導過用利多卡因治療不育症。但已知利多卡因的其它藥學效果。例如，在EP 507 160中，它公開了一種應用於皮膚、含利多卡因的外用製劑，該製劑包括置於支持體上的藥物保持層。該製劑應該用於治療帶狀皰疹神經痛和帶狀皰疹後神經痛。
附圖中應用的「endometr」表示子宮內膜異位，「end-prob」表示可能的子宮內膜異位。
圖1是顯示培養的每天的自由精子數的示意圖與細胞介質(cellmedium)(A，對照)，與細胞介質和利多卡因(B)，與腹膜液(C，對照)以及與腹膜液和利多卡因(D)。
圖2是顯示培養的每天的前進性遊動的精子數的示意圖與細胞介質(A，對照)，與細胞介質和利多卡因(B)，與腹膜液(C，對照)以及與腹膜液和細胞介質和利多卡因(B)，與腹膜液(C，對照)以及與膜腹液和利多卡因(D)。
圖3是顯示培養的每天的非前進但遊動的精子數的示意圖與細胞介質(A，對照)，與細胞介質和利多卡因(B)，與腹膜液(C，對照)以及與腹膜液和利多卡因(D)。
圖4是顯示培養的每天的活著但靜止的精子數的示意圖與細胞介質(A，對照)，與細胞介質和利多卡因(B)，與腹膜液(C，對照)以及與腹膜液和利多卡因(D)。
圖5是顯示培養的每天的死精子數的示意圖與細胞介質(A，對照)，與細胞介質和利多卡因(B)，與腹膜液(C，對照)以及與腹膜液和利多卡因(D)。
參考圖1～6，局部麻醉藥在製備用於抗不育症或用於提高生育力的藥劑方面的應用。所述局部麻醉藥可選自具有局部麻醉效果的任何物質。這類物質的實例有布比卡因(1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-2-哌啶甲醯胺)、利多卡因(2-(二乙氨基)-N-(2，6-二甲基苯基)乙醯胺)、甲哌卡因(N-(2，6-二甲基苯基)-1-甲基-2-哌啶甲醯胺)、丙胺卡因(N-(2-甲基苯基)-2-(丙氨基)丙醯胺)和羅哌卡因((S)-N-(2，6-二甲基苯基)-1-丙基-2-哌啶甲醯胺)。也可應用其它局部麻醉藥。優選應用利多卡因。
本發明的另一特徵是一種藥物組合物，它包括藥物上有效濃度的局部麻醉藥與藥物上可接受的賦形劑。所述濃度是一個對婦女不育症有效果的濃度或是一種提高婦女生育力的濃度。劑量和濃度可由醫師確定。有效物質的濃度至少是5μg/ml。可應用1～20ml中100～2000μg，優選約118μg。施用的劑量至少是100μg，尤其約1000μg。所述組合物優選通過輸卵管灌氣法優選在腹膜腔內施用。所述局部麻醉藥如前面定義。
可將所述活性成分與賦形劑混合，該賦形劑是藥物上可接受的並與所述活性成分相容，其用量適用於本文描述的療法。此外，如果需要的話，所述組合物可含少量輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑，pH緩衝劑等，它們增強所述活性成分的效果。
本發明的藥物組合物可包括其中所含組分的藥物上可接受的鹽。藥物上可接受的鹽包括酸加合鹽，即與無機酸(例如鹽酸或磷酸)形成的鹽，或者與有機酸(例如乙酸、酒石酸和扁桃酸)形成的鹽。
生理上耐受的載體是本技術中熟知的。液態載體的實例有無菌水溶液，該水溶液除了活性成分和水外不含其它物質，或者含緩衝劑(例如生理pH值的磷酸鈉)、生理鹽水或這二者，例如磷酸鹽緩衝的鹽水。此外，水性載體可含一種以上緩衝劑鹽，以及例如氯化鈉和氯化鉀這類鹽，葡萄糖，丙二醇，聚乙二醇和其它溶質。
所述組合物還可包括透明質，它是一種粘稠的物質，例如呈凝膠形式。透明質給出活性物質的緩慢釋放，它是優選的，因為在排卵和按本發明治療後長達24小時可能會發生受孕。另一優點在於，透明質對精子有刺激作用(Zimmerman ER，Drobnis E，Robertson KR，NakajimaST，Kim H用精子選擇系統與洗滌技術配製精液。生育與不孕1994；61269～275)。
通常不認為不育症是一種病。本發明還包括用本發明的藥物組合物治療婦女不育症的方法，其特徵在於，所述藥物組合物是通過輸卵管灌氣法被插入的。
本發明尤其涉及抗不育症或提高生育力的美容方法或非治療性方法，其中a)診斷排卵，b)當按步驟a)預期到排卵時給出用局部麻醉藥的治療。
該治療優選通過輸卵管灌氣法實施。步驟優選如下自發排卵在正常月經周期中初步治療。只刺激停止排卵的患者，並用氯米芬(Clomifen)(片劑)初步治療，氯米芬容易製備且不貴。排卵後需要一個血樣以證實在受治療的周期中已排卵。
LH(黃體生成素)檢驗通過自己在家裡檢查尿樣診斷排卵前24～36小時LH急變。
輸卵管灌氣法當LH檢驗是陽性時給予輸卵管灌氣法治療，即在正常的婦科檢查中例如用10ml的100μg/ml利多卡因的生理NaCl或林格溶液治療。將不需麻醉。
授精無人工處理。在被給予輸卵管灌氣法治療後夫婦將在家裡通過正常的性交方式嘗試並達到懷孕。
不存在對精子存活的不利效果這一發現證實了精子未受利多卡因的影響，這也已在其它研究中被證實(Bennett SJ，Bolton V，Parsons J.利多卡因對人精子活動性的效果。輔助的生殖和遺傳學雜誌(J AssistedReprod. Genetics)1992；9271～3)。對卵母細胞似乎也是這樣，因為已測得高含量的利多卡因但沒有任何有關授精或胚胎發育的問題(Bailey-Pridham DD，Cook CL，Reshef E，Hurst HE，Drury K，Yussman MA。在經陰道的卵母細胞恢復過程中卵泡液利多卡因含量。生育與不孕1990；53171～173)。最高含量是118μg/ml，它表明在體外培養中給出的劑量即1000μg利多卡因應該可稀釋到例如在10ml等滲液中100μg/ml而被應用。該濃度現將被用於在排卵前24小時進行的輸卵管灌氣法之後臨床研究懷孕結果以提高精子存活率。
利多卡因已被應用多年但沒有任何關於懷孕期間不利效果的報導，在動物研究中也已得到證實(Ramazzotto J，Curro FA，Paterson JA，Tanner P，Coleman M。在懷孕的大鼠中利多卡因的毒理鑑定。牙研究雜誌(J Dent Res)1985；641214～1218)，所以利多卡因應可被用於治療子宮內膜異位患者的不育症。
本發明通過如下實施例而被闡述。除非另外定義，應用的所有技術術語和科學術語都與本領域普通技術人員通常理解的具有相同意義。除非另外說明，本文應用的技術是本領域普通技術人員已知的技術。本文提到的文獻併入作參考。
實施例1-子宮內膜異位婦女的PF(腹膜液)中精子吞噬作用的減小。
進行該研究以進一步分析白細胞對子宮內膜異位期間降低的生育力的作用，還探尋潛在的療法。為了排除免疫影響，只有一名精子損獻者參與了該實驗。將配製的精子樣品與得自健康婦女和患子宮內膜異位的婦女的未離心腹膜液一起培養，以評定精子吞噬作用對子宮內膜異位期間降低的生殖力的重要性。當存在或不存在局部麻醉藥時，每天計數培養物中成活的精子數達五天，添加局部麻醉藥是為了探尋降低腹膜白細胞群活性的方法。材料和方法患者婦女將患者分成三個不同的組。對照材料(n＝9，平均年齡＝38.5歲)包括進行腹腔鏡檢絕育的婦女或具有不明白的腹痛的婦女。對比例具有被認為與解剖學上正常子宮和輸卵管一樣正常的腹腔鏡檢發現物。
研究組是這樣的婦女通過腹腔鏡檢查發現了不育症的病因或者腹痛的病因並且診斷為子宮內膜異位(n＝11，平均年齡＝34.5歲)。該組中，對8名患者是用腹腔鏡檢診斷的，對3名患者的診斷是既往病歷的可能子宮內膜異位但她們尚未發展在腹腔鏡檢查時可見到的任何子宮內膜異位性植入物。
男子精子損獻者是具有正常生育力的健康的38歲男子，在每次精子採樣之前的節慾期為2～3天。精子樣品是通過上遊技術(swim uptechnique)選擇最佳群體而配製的(Russel LD，Rogers BJ。應用上升技術改善人精子群體的質量和授精可能性。男科學雜誌(J Androl)1987；825)。在腹腔鏡檢查下採集的腹膜液樣品在患者被麻醉後，取血樣供以後分析透明質，它在PF中可被用作發作炎症的標記從而排除PID(骨盆炎性疾病)。在器械安全地處於腹腔內的腹腔鏡檢查開始時，應用抽吸器通過特氟隆導管(直徑1.7mm，Optinova，Godby，芬蘭)抽吸直腸子宮陷凹中所有可得到的腹膜液並在特氟隆瓶(Nalgene，Brochester，NY，美國)內與10IU肝素/ml混合(Olive DL，Weinberg JB，Haney AF.腹膜巨噬細胞和不育症細胞數和骨盆病理學之間的聯繫。生育與不孕1985；44772～777)並即刻加以注意。通過在電子天平上稱量測定腹膜液量。特氟隆是採集PF的精選的材料，是因為它對哺乳動物細胞的低粘著性(Grinnell F，Milam M，Srere PA。對細胞粘著的研究。生物化學與生物物理學文獻(ArchBiochem Biophys)1972；153193～198)。將肝素用作抗凝劑以防止白細胞聚集(Makarand等，1985)。以前應用檸檬酸鹽(Edelstam等，1994)，它在精子培養中對精子生存力有不利影響。所有樣品都是獲得患者許可後抽取的，取樣方法得到瑞典Uppsala大學醫學院的倫理委員會的認可。精子和腹膜液的培養將特氟隆小管用於在潮溼的細胞培養箱內按如下進行的所有培養中a)細胞介質(1ml)，精子(1ml細胞介質中106個)和0.1ml NaCl。
b)細胞介質(1ml)，精子(1ml細胞介質中106個)和0.1ml利多卡因10mg/ml(Xylocain，ASTRA)。
c)精子(1ml細胞介質中106個)，腹膜液(1ml)和0.1ml NaCl。
d)精子(1ml細胞介質中106個)，0.1ml利多卡因(10mg/ml)和腹膜液(1ml)。
Earls細胞介質(Sigma)含0.35％BSA(牛血清白蛋白)。離心殘餘量的腹膜液並將上清液冷凍(-20℃)供後續的透明質分析(Edelstam等，1994)。在五天中每天分析這些小管，對所有A～D培養物計數如下，直到100個精子
未與白細胞粘著的自由精子數前進性遊動的精子數非前進性遊動的精子數靜止但活著的精子數死精子數還應用錐蟲藍每天記錄存活的腹膜白細胞的百分數。結果主要發現是，當與腹膜液和利多卡因一起培養時，小管內有統計上顯著少的被吞噬的精子(p＜0.02)。觀察到被捕集在大的白細胞聚集體中的精子，並且一些精子顯然遭受吞噬，於是減少了自由活動的精子數。存在和不存在子宮內膜異位時的精子存活率培養兩天後，與子宮內膜異位的組相比，含正常組腹膜液的培養物中存在統計上顯著更多的自由精子(Kruskal Wallis p＜0.014)。存在和不存在利多卡因時的精子存活率在24或48小時後，未發現對精子存活的不利影響，並且在含利多卡因或不含利多卡因的精子培養物之間沒有統計上明顯的差異。應用Wilcoxon的p值分別示於表I和II中。
存在和不存在PF(腹膜液)和利多卡因時的精子存活率，未考慮診斷與單獨的精子培養物相比，不存在腹膜液時前進活動性降低得更快(圖2)。子宮內膜異位組中，存在和不存在PF和利多卡因時的精子存活率存在腹膜液和利多卡因時明顯有更多的自由精子，尤其是子宮內膜異位組中培養兩天之後。圖1和表II。
在兩個診斷組內，含利多卡因的培養物中隨時間推移死精子更多。圖5，表II。
腹膜液中的透明質濃度未表現發作的炎性過程的指徵，即證實所有患者是健康的。
表1當比較與利多卡因一起培養或未與利多卡因一起培養時，培養物中記錄的不同參數的P值。24小時培養時間後的數據。
a)不含利多卡因的培養物內更多前進性遊動的精子。
b)利多卡因組中更多的死精子。
表II.當比較與利多卡因一起培養或未與利多卡因一起培養時，培養物中記錄的不同參數的P值。48小時培養後的數據。
c)利多卡因中的更多d)利多卡因組內更多自由精子該研究包括了在五天培養過程中，利多卡因對精子存活率的影響以及對腹膜白細胞吞噬精子的作用。該研究只包括一名精子捐獻者以避免不同的免疫組合，這些組合會成為實驗中非受控因素。該研究還跟蹤精子存活達5天之久，而以前的研究是在24小時期間內考察精子存活的。此外，不但計數了自由的未被吞噬的精子數，還計數了有多少表現為前進性遊動或靜止性遊動的精子以及活著的、死的或自由的(即未與白細胞粘著的)精子數。
在該研究中，證實了以前的發現，即Muscato等1982描述的關於因精子吞噬作用引起子宮內膜異位患者的生育力降低。來自子宮內膜異位患者的腹膜巨噬細胞提高的吞噬能力也已用螢光珠證實了(SamejimaT，Masuzaki H，Ishimaru T，Yamabe T。子宮內膜異位中腹膜巨噬細胞的活性。亞洲大洋洲婦產科學雜誌(Asia Oceania J Obstet Gynaecol)1989，15175～181)。
其它關於精子吞噬作用的研究未考慮粘附到一些其它材料上的白細胞損失這個問題(Grinnell等1972)。Makarand等1985應用玻璃容器貯存腹膜液。玻璃對白細胞的粘著力最高(Grinell等1972)因而已被用於分離巨噬細胞(Smedsroed B，Pertoft H。通過珀可離心和選擇性粘著的方法從單個的大鼠肝高產率地製備純的肝細胞和網狀內皮細胞。白細胞生物學雜誌(J Leukocyte Biol.)1985；38)。Muscato等1989選擇了聚丙烯，就細胞粘著問題來說聚丙烯是比玻璃更好的替代材料，但沒有特氟隆理想。
在含利多卡因的培養物中死精子隨時間推移而更多這一發現勢必被認為是在利多卡因存在下，精子吞噬作用減小的結果，因為在含有或不含利多卡因的單獨的精子培養物中，未發現對精子的不利影響。這肯定也可解釋在利多卡因培養物中非前進性遊動的精子增多這一發現(圖3)。不存在腹膜液時前進活動性的降低可能指示PF(腹膜液)含有精子保持其功能所需要的物質。
如在引言中提及的那樣，輸卵管傘不斷地被腹膜液潤溼，該作用在子宮內膜異位患者的情況下減小卵子獲取能力(Suginami等，1986)。如該研究和以前的研究中闡明的子宮內膜異位患者腹膜液中的白細胞吞噬精子的能力更強(Muscato等，1982)。所以患子宮內膜異位的婦女可能具有促使她們的生育力降低的兩個因素。該研究還指示了有可能應用利多卡因的效果以便降低精子的吞噬作用。
總之，該研究證實了在利多卡因存在下精子吞噬作用的降低。必須繼續研究該現象，即在排卵前(LH急變時間)應用鹽水或利多卡因/鹽水溶液的輸卵管灌氣法的隨機臨床試驗進行研究。
雖然按優選的組合物和實施方案描述了本發明，但應懂得可對其作一定的替換和更改而不會偏離所附權利要求書的實質和範圍。
權利要求
1.局部麻醉藥在製備用於抗不育症或用於提高生育力的藥劑方面的應用。
2.權利要求1的應用，其特徵在於，所述局部麻醉藥選自下組藥物布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因和羅哌卡因。
3.一種藥物組合物，它包括藥物上有效濃度的局部麻醉藥和藥物上可接受的賦形劑。
4.權利要求3的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物上有效濃度至少是5μg/ml。
5.權利要求3的藥物組合物，其特徵在於，所述局部麻醉藥選自下組藥物布比卡因、利多卡因、甲哌卡因，丙胺卡因和羅哌卡因。
6.權利要求3的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物上可接受的賦形劑包括生理NaCl或林格溶液。
7.權利要求3～6任一項的藥物組合物，其特徵在於，它包括透明質。
8.用權利要求3的藥物組合物提高婦女生育力的方法，其特徵在於，所述藥物組合物優選通過輸卵管灌氣法被插入腹膜腔。
全文摘要
本發明涉及局部麻醉藥在製備用於抗不育症或用於提高生育力的藥劑方面的應用。它還涉及一種藥物組合物,該藥物組合物包括藥物上有效劑量的局部麻醉藥和藥物上可接受的賦形劑。它還涉及一種用所述藥物組合物提高婦女生育力的方法。
文檔編號A61K31/167GK1248915SQ98802557
公開日2000年3月29日 申請日期1998年2月9日 優先權日1997年2月15日
發明者格雷塔·埃德爾斯塔姆 申請人:埃德爾斯塔姆公司, 格雷塔·埃德爾斯塔姆