岷江百合類萌發素蛋白基因LrGLP2及其應用的製作方法

2023-04-24 07:06:56

專利名稱：岷江百合類萌發素蛋白基因LrGLP2及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學及基因工程技術領域，特別是岷江百合的具有抗真菌活性的類萌發素蛋白基因及應用。
背景技術：
真菌病害是植物病害中最大的一類，約佔植物病害的70 80%，許多危害重、分布廣的植物病害都是真菌引起的，並造成作物產量的巨大損失。控制植物真菌病害的常規方法主要有3種:一是使用化學殺菌劑，二是選育抗性新品種，三是採用合理的耕作制度，避免已感染土壤和帶病原植物材料 的傳播等。這些方法雖然獲得了一定成效，但是均不能從根本上解決真菌病害問題。隨著重組DNA技術的產生和發展，轉基因技術開闢了植物育種的新途徑。近年來，用基因工程方法培育抗真菌病害的植物品種或材料取得了初步成效，可望從根本上解決真菌病害問題。病程相關蛋白(pathogenesis-related protein, PR)是高等植物中普遍存在的一類防禦蛋白，病原體或其他外界因子的刺激能夠誘導其表達，在植物防衛反應中發揮重要作用。作為病程相關蛋白家族的一員，類萌發素蛋白(germin-like protein, GLPs)與植物抵禦外源物質傷害及多種逆境脅迫密切相關。GLPs是在植物中普遍存在的一類與小^iTriticum aestivum)萌發素(germin)序列高度相似、位於胞外基質的可溶性糖蛋白，絕大多數 GLPs 為穩定的低聚物(Druka A, Kudrna D, Kannangara CG, von Wettstein D,Kleinhofs A, Physical and genetic mapping of barIey(.Hordeum vulgare)germin-likecDNAs.Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99: 850 855)。GLPs 與 germin 結構相似，都含有￠-摺疊桶狀結構域，因此認為二者均屬於cupin超家族。GLPs在不同的物種中具有時空表達特性和不同的功能，主要以酶、受體和結構蛋白的形式參與多種生理生化過程。其中，酶包括草酸鹽氧化酶(oxalate oxidase, 0X0)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、ADP 葡萄糖焦憐酸酶 / 憐酸二酯酶(ADP glucose pyrophosphatase/phosphodiesterase, AGPPase)等，受體如雄激素結合蛋白(androgen binding protein,ABP19/20)激素受體、Rhicadhesins受體等。目前將不同植物的GLPs分為3個亞類:第I亞類為真萌發素(true germin),主要包括小麥、大麥的萌發素及一些其他穀類植物的GLPs,它們具有SOD和0X0的雙重活性；第2亞類的GLPs主要是來自於除小麥和大麥之外的其他禾穀類、裸子植物和茄科植物等，這一亞類主要與植物耐氧化脅迫有直接關係 』第3亞類的GLPs主要包括與生長素代謝相關的一些調節蛋白，它們與植物的生理節律和花期誘導功倉泛有關(Khuri S, Bakker FT, Dunwell JM, Phylogeny, function, and evolution of thecupins,a structurally conserved, functionally diverse superfamily of proteins.Mol Biol Evol,2001,18: 593 605)。多數對GLPs防禦機制的研究集中於GLPs在質外體中的表達，並通過細胞壁的作用對病原體做出早期反應。在受到真菌感染後，植物細胞內GLPs的表達上調，並且通過H2O2信號途徑來調節植物對真菌的防禦。數量遺傳學研究表明GLPs家族成員具有廣譜的病害抗性。在水稻的8號染色體上發現有12個緊密連鎖在一起的GLPs，通過RNA幹涉使編碼0sGLP8_6、0sGLP8_7、0sGLP8~ll 的基因沉默後，水稻對稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)及紋枯病菌的侵染都變得更敏感(Manosalva PM, Davidson RM, LiuB,Zhu X,Hulbert SH,Leung H,Leach JE,A germin-like protein gene family functionsas a complex quantitative trait locus conferring broad—spectrum diseaseresistance in rice.Plant Physiol, 2009,149: 286 296)。大麥中的 GLPs 基因價￠￡7( /iHvGER5a的瞬時超表達，或者通過RNA幹涉使iHvGER5a基因的瞬時沉默，可以保護大麥表皮細胞免受病原真菌f.sp.Aorofei的侵襲的基因沉默引起超敏反應，^LHvGEIMd取HvGER5a均是新的細胞外SOD(Zi_ermann G, BaumleinH, Mock HP, Himmelbach A, Schweizer P, The multigene family encoding germin-likeproteins of barley.Regulation and function in basal host resistance.PlantPhysiol, 2006,142: 181 192)。葡萄(KzYis Fi/ i/kra) GLPs 基因能被病原真菌
Erysiphe tor在感染部位特異性誘導表達；同時,亞細胞定位分析表明，VvGLP3與緣色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重組蛋白VvGLP3:GFP定位在細胞壁上，將帶有組氨酸標籤的VvGLP3轉入擬南芥過量表達，從中分離的VvGLP3重組蛋白具有SOD活性(Godfrey D, Able AJ, Dry IB, Induction of a grapevine germin-like protein(VvGLP3) gene is closely linked to the site of erysiphe necator infection: apossible role in defense Mol Plant Microbe Interact,2007,20: 1112 1125)。超表達甜菜vulgaris ) GLPs基因i vGLP-1的擬南芥,植株產生的H2O2增力口，且對兩種病原真菌K<9_r^fci77i應longisporum取R.solani的抗性顯著增強,但是並不影響幼苗與有益內生真菌Piriformospora indica的相互作用；同時，BvGLP-1的超表達激活一系列防衛相關蛋白如PR-1、PR-2、PR-3、PR-4、及TOF1.2的轉錄水平(Knecht K，Seyffarth M,Desel C,Thurau T,Sherameti I,Lou B,Oelmiiller R,Cai D,Expression ofBvGLP-1 encoding a germin-like protein from sugar beet in Aarabidopsis thalianaleads to resistance against phytopathogenic fung1.Mol Plant Microbe Interact,2010,23: 446 457)。當小麥受到f.sp.(ritici侵染時,從中克隆得到一個GLPs基因片段TaGL P5 (FJ594470),該基因位於小麥的5A染色體上，螢光定量PCR分析結果顯示該基因的表達受白粉菌誘導，並且接菌後24 h之前在抗病植株中的表達量高於在感病植株中的表達量，暗示該基因參與小麥對白粉菌的防禦反應(王俊美，孫燕飛，劉紅彥，康振生，徐紅明，白粉菌誘導的小麥類萌發素蛋白的克隆、定位及表達分析.中國農業科學，2009，42: 3104 3111)。此外，水稻的下調表達引起植株明顯矮化以及細胞形態的改變，同時導致紋枯病及稻瘟病等真菌病害的發生大幅增加；而將OsGLPl轉入菸草中表達，以不同濃度的菌液處理轉基因菸草，結果顯示轉基因菸草葉片沒有出現或僅出現較小的可見損傷，並且相關的SOD活性所介導的抗氧化防衛反應與H2O2的大量積累以及木質素等細胞壁成分之間的交聯作用有關(Banerjee J,Maiti MK,Functional role of rice germin-like proteinl in regulation of plant height anddisease resistance.Biochem Bioph Res Commun,2010,394: 178 183)。本發明的類萌發素蛋白基因來自眠江百合(Zi7iw regaJe Wilson)。ill民江百合又名王百合，是我國特有種，多年生草本植物，僅分布於四川西岷江流域海拔800 2700m的河谷到山腰的巖石縫中，具有極強的抗真菌、抗病毒等特性。

發明內容
本發明的目的是提供一種從岷江百合中克隆獲得具有抗真菌活性的類萌發素蛋白的全長基因類萌發素蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID:1所示，該基因全長為921bp，具有654bp的開放閱讀框(0RF)、49bp的5，非翻譯區和218bp的3，非翻譯區，編碼如SEQ ID:2所示胺基酸序列的蛋白質。本發明中所述類萌發素蛋白基因的編碼區是序列表SEQ ID:1中第50-703位所示的核苷酸序列或是編碼SEQ ID NO:2所示胺基酸序列蛋白質的其他DNA序列。本發明分離克隆岷江百合的一個抗真菌相關基因的完整cDNA片段，利用根癌農桿菌iAgrobacteriuni tumefaciens)介導法將目的基因轉入受體植物中並過量表達,通過進一步實驗驗證該基因是否具有抗真菌的活性，為後期利用該基因改良菸草以及其他植物抵禦真菌病害的能力奠定基礎，發明人將這個基因命名為GLPs是PRs家族中的一類胞外糖蛋白，在植物抗病防衛反應中起重要作用，GLPs主要通過0X0、S0D、AGPPase起作用，SOD和0X0是植物體內重要的ROS清除酶類，在植物抵抗氧化脅迫過程中起著重要作用，SOD把超氧化物轉變為過氧化氫和氧分子，它介導的反應是植物中主要的抗氧化防禦系統之一，過氧化物酶隨後把過氧化氫轉變為水；0X0通過催化草酸產生CO2和H2O2, SOD以及0X0催化產生的H2O2可以通過纖維素交聯作用增強細胞壁的結構，並催化細胞壁的氧 化交聯形成乳突，延緩和阻止病原菌的侵入和擴散，以保護細胞免受再次感染。此外，H2O2可以選擇性地參與信號級聯反應來引起植物的防衛反應或者直接形成一種抗菌的效應。在激活防衛基因表達過程中，H2O2還可以作為一種第二信使來引發超敏反應，而受感染部位通過超敏反應產生程序性細胞凋亡來減少外界微生物入侵帶來的損失。本發明涉及分離包含的DNA片段並鑑定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型，其中所述DNA片段如序列表SEQ ID:1所示，對該基因進行序列分析，表明LrGLP2全長cDNA序列為921bp，其包含一個654bp的開放閱讀框(Open reading frame, 0RF)、49bp 的 5，非翻譯區(untranslated region, UTR)以及218bp的3』UTR，ORF編碼一個具有217個胺基酸的蛋白質。LrGLP2編碼蛋白具有類萌發素蛋白的保守結構域，與來自'Y^iTriticum ae s t i vum)、^LmPhyscomitrellapatens')HMAPisum sativum)、^\ U^iJlelianthiis a/wm/s)以及其它物種的類萌發素蛋白高度相似，表明其屬於岷江百合中的類萌發素。超量表達序列表SEQ ID所示序列可以顯著增強菸草對葡萄座腔菌、擬莖點黴屬真菌、灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌的抗性。本發明另一目的是將岷江百合穀胱甘肽S-轉移酶基因應用在提高菸草對葡萄座腔菌、擬莖點黴屬真菌、尖孢鐮刀菌、灰葡萄孢的抗性中，具體操作如下:
(1)採用擴增的特異引物，從接種尖孢鐮刀菌後的岷江百合根中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出的全長編碼區，然後將其連接到pMD-18T載體上，經測序獲得具有目的基因的克隆；
(2)用限制性內切酶feMlI和&oRI酶切pMD-18T-Zrffi/C載體，通過膠回收得到目的基因片段。用同樣的內切酶對植物表達載體pCAMBIA2300s進行處理，膠回收穫得所需載體大片段，將膠回收的基因片段與植物表達載體pCAMBIA2300s)載體大片段連接，構建植物超表達載體，然後將所構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入菸草中表達；
(3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，並通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)及 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)獲得真正的轉基因植株，分析轉基因植物蛋白對真菌生長的抑制作用，最後篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。本發明為提高植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物能克服傳統育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發明來自岷江百合的LrGLP2基因能增強植物對真菌的抗性，將該基因導入菸草中，可以產生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術來減少真菌帶來的病害具有明顯的優勢和不可替代的重要性。它可以為大規模生產作物、花卉等提供方便，大量減少化學農藥的使用，還可以為農業生產節約成本、減小環境汙染且提高管理水平，因此本發明具有廣闊的市場應用前景。


圖1是本發明中 部分轉基因菸草基因組DNA的PCR檢測結果示意圖，其中:Marker是DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObp、1，000bp、750bp、500bp、250bp 以及 IOObp六條DNA片段組成；正對照是質粒pMD-18T-為模板的PCR反應；WT是非轉基因菸草(野生型)總DNA為模板進行的PCR ；
圖2是本發明中部分陽性轉基因菸草中轉錄水平的表達分析結果圖，其中:Marker是DL2000 DNA Marker (大連寶生物)；WT是非轉基因菸草總RNA逆轉cDNA為模板的PCR產物；正對照是質粒pMD-18T-Zrffi/C為模板的PCR產物；
圖3是本發明中轉基因菸草體外抗真菌活性的抑菌效果圖，其中:a、b、c、d圖示中的真菌分別是葡萄座腔菌、擬莖點黴屬真菌、尖孢鐮刀菌、灰葡萄孢;WT為野生型菸草的總蛋白；CK為空白對照，即無蛋白對照(用於提取蛋白的緩衝液)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容並不局限於此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的採用常規試劑或按常規方法配置的試劑。實施例1 'LrGLP2全長基因克隆以及序列分析
用尖孢鐮刀菌接種岷江百合，用接種24 h後的根提取總RNA，用液氮將處理過的岷江百合的根研磨成粉末，轉入離心管中，採用異硫氰酸胍法提取總RNA。採用逆轉錄酶M-MLV(promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系和操作過程為:取5 U g Total RNA,依次加入50 ng oligo (dT)、、DEPC水至反應體積為12.5 u L ;混勻後，70°C加熱變性5min後迅速在冰上冷卻5 min，然後依次加入4 u L 5 X First-stand buffer,2 u L dNTP(2.5mMeach) 0.5 u L RNasin (200U)、1 u L M-MLV (200U)，混勻並短時離心，42 °C溫浴 1.5 h,取出後70 °C加熱10 min，終止反應。cDNA第一鏈合成後置於_20°C保存備用。以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因LrGLP2，所用上下遊引物序列分別為5，GGATCCGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACA3，、5，GAATTCATCCATCAGAACT TAGCCTGGAGC3，。採用Advantage 2 PCR Enzyme (Clontech)擴增出目的基因，PCR反應條件:95 °C I min ；95°C30 s，62 °C 30 s，72 °C 60 s，30 個循環；72°C 2min。反應體系(20 y L)為 2 u L cDNA、2 u L 10XAdvantage 2 PCR Buffer、0.5 u L 50X dNTP Mix (IOmM each)、0.2 u L 正向引物(10 u M)、0.2 u L 反向引物(10 u M)、0.2 U L Advantage〗PCR Polymerase Mix、14.9UL PCR-Grade water。PCR結束後，取5 U L用於瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產物的特異性以及大小。由於PCR產物只有一條DNA帶，故直接對PCR產物進行TA克隆，使用的試劑盒為PMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應體系和操作過程為:取1.5 u L PCR產物，依次加入 I u L pMD18_T vector (50 ng/ u L)和 2.5 u L 2XLigation solution I，混勻置於16°C過夜反應。採用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5 a中。使用含有氨苄青黴素(ampicillin, Amp)的LB固體培養基篩選陽性克隆。挑選若干個單菌落，搖菌後用擴增LrGLP2的特異引物鑑定出多克隆位點插入的克隆。將所鑑定的克隆進行測序，最終獲得的 ZrdZC 全長 cDNA 為 921bp,通過 NCBI ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析發現其包含一個654bp的開放讀碼框(見序列表)，LrGLI^編碼一個含217個胺基酸的蛋白質LrGLP2，其分子量約為23.35KDa，等電點為6.16，含有I個半胱氨酸殘基(C),位於第46位,單體蛋白無二硫鍵形成。藉助生物信息學軟體SignalP 4.1分析編碼的蛋白序列，檢測其是否具有N端信號肽，結果表明該蛋白的第廣21位胺基酸組成LrGLP2的信號肽，可能的剪切位點在第2廣22個胺基酸之間。位於蛋白質N-末端的信號肽是分泌蛋白的典型標記，說明LrGLP2是一種分泌蛋白。實施例2:植物表達載體構建
採用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)從大腸桿菌中提取插入的質粒pMD-18T-Zrffi/C以及植物表達載體pCAMBIA2300s的質粒，取I y L用於瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質粒的完整性和濃度高低。用限制性內切酶&0RI (TaKaRa)和Bamm (TaKaRa)分別對質粒 pMD-18T_Zrffi/^ 和 pCAMBIA2300s 進行雙酶切(100 U L 體系)，反應體系和操作過程為:取20 uL pMD-l8T-LrGLP2和pCAMBIA2300s質粒、依次加A 10 u L 10XK buffer,5 u L EcoRI'b u L Bamm,m u L ddH20，混勻後短時離心，置於37 °C過夜反應。將所有酶切產物點於瓊脂糖凝膠中進行電泳，然後對基因片段和pCAMBIA2300s載體大片段分別進行膠回收，整個過程使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)，取1 U L回收產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，置於-20°C保存備用。利用T4 DNA Ligase(TaKaRa),將回收的 LrGLP2\Mk 片段和 pCAMBIA2300s 載體片段連接起來，反應體系(20 u L)和操作過程為:取10 uL LrGLP2mk片段依次加入2 y LpCAMBIA2300s 載體 DNA、2 u L 10XT4 DNA Ligase BufferU u L T4 DNA Ligase,5 u LddH20，混勻後短時離心，然後置於16 1:水浴過夜反應。接著採用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5a中，用含有50 mg/L卡那黴素(kanamycin, Km)的固體培養基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴增LrGLP2的特異引物進行PCR，挑選出LrGLP2與pCAMBIA2300s成功連接的克隆，所檢測的菌株若為陽性，加入甘油並置於_80°C保存備用。採用SanPrep柱式質粒抽提試劑盒(上海生工)提取並純化上述大腸桿菌中的pCAMBIA2300s-Zrffi/C質粒，隨後用液氮凍融法將上述構建的植物表達載體pCAMBIA2300s-Zrffi/^轉入所製備的根癌農桿菌LBA4404感受態細胞中，操作步驟為:取0.2 u g pCAMBIA2300s-Zrffi/C質粒加入含有200 U L感受態細胞的離心管中，輕輕混勻後冰浴5 min,接著轉入液氮中冷凍I min,然後迅速置於37 °C水浴5 min,之後立即冰浴2 min，加入800 u L LB液體培養基，28 1:振蕩培養4 h。將活化後的農桿菌塗於含有50mg/L Km的LB固體培養基上，28 °C靜止培養。挑選單菌落搖菌，用擴增的特異性引物進行PCR，檢測pCAMBIA2300s-Zrffi/C是否轉入農桿菌中。對於陽性克隆，加入甘油後置於-80°C保存備用。實施例3:農桿菌介導的植物遺傳轉化以及轉基因植物篩選
本實驗的轉基因受體是菸草，將菸草種子用75%的酒精浸泡30s，用無菌水洗滌後用
0.1%的HgCl2浸泡8 min,然後再用 無菌水洗滌若干次，播種於1/2MS培養基上，28 °C暗培養5-8 d,發芽後轉至光照培養箱(25 °C, 16 h/d光照)，以後每月用MS培養基繼代一次。從_80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-Zrffi/C質粒的農桿菌LBA4404菌種，接種於5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液體培養基中，28 °C培養至培養基渾濁。吸取I mL渾濁的菌液塗布於含有50 mg/L Km的LB固體培養基上，28 °C培養48ho將LB固體培養基上的農桿菌刮下適量接種於附加有20 mg/L的乙醯丁香酮的MGL液體培養基中，28 1:振蕩培養3 h以活化農桿菌。取菸草無菌苗葉子切成I cm2左右的葉盤，完全浸泡於上述含有活化農桿菌的MGL液體培養基中，浸染時間為15 min。用無菌濾紙吸乾葉盤表面的菌液，將葉盤置於共培養基上進行室溫培養。菸草轉化的共培養基為MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L瓊脂,22 °C無光條件下共培養2 d。將共培養後的葉盤轉到加有抗生素的MS篩選培養基中分化成苗，同時篩選轉基因植株。菸草篩選培養節為 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30g/L sucrose+6 g/L 瓊脂+50 mg/L Km+200 mg/L 頭抱黴素(cefotaxime sodium salt, Cef);篩選培養時將培養瓶轉移至光照培養箱培養(25 °C, 16 h/d光照，8 h/d黑暗)，出芽後用含有50 mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養基繼代培養，因菸草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進一步篩選，將菸草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培養基上使其生根，最後選用生根較好的再生苗做進一步的檢測。採用CTAB法提取轉基因菸草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取IU L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度，以轉基因植株的基因組DNA為模板用擴增LrGLP2的特異引物進行PCR，PCR結束後，取8 u L產物用於瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉基因植株，部分轉基因菸草植株的擴增結果如圖1所示，轉基因菸草共篩選到35株陽性轉基因植株。實施例4 'LrGLP2表達分析以及轉基因植株抗真菌活性分析
取陽性轉基因單株以及非轉基因菸草(野生型，WT)的嫩葉提取總RNA，逆轉錄生成cDNA第一鏈，並以此為模板用擴增的特異引物進行PCR，根據PCR結果分析各轉基因單株中LrGLP2轉錄水平的表達，總RNA提取以及RT-PCR的方法與步驟與實施例1中相同，PCR結束後，取5 UL用於瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結果如圖2所示。共檢測到19株轉基因單株中在轉錄水平有表達，這些單株的編號為I 19。
將實驗室保存的幾種病原真菌接種於PDA固體培養基(200 g/L馬鈴薯，15 g/L瓊脂，20 g/L葡萄糖)上，28 °C暗培養，待菌落生長至直徑約為2 3cm時添加蛋白，分析轉基因植株體外抗真菌活性，供試真菌共有5種:擬莖點黴屬iPhotnopsis sp.)真菌，葡萄座腔菌(Mo trosphaeria do thidea ),尖抱鍵刀菌 iFusarium oxysporum ),交鏈抱菌{Alternaria sp.cinerea、。為了防止其它雜菌汙染所提取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作，首先取I g轉基因菸草單株(編號分別為1、2、3、8、12)或野生型葉片放入研缽中，加入I mL蛋白提取液(1M NaCl, 0.1M乙酸鈉，1% PVP，pH6)，充分研磨。轉入1.5 mL離心管中，混勻後4 °C靜置過夜。4 °C離心30 min (12,000 g/min)，取上清於新的1.5 mL離心管中，並取適量用紫外分光光度儀測定總蛋白濃度，將轉基因和野生型植株的總蛋白濃度調整至0.2U g/u L，然後分別取20 u L滴於各真菌培養基的無菌濾紙上，在每個真菌的平板上除了添加不同轉基因菸草植株的總蛋白，同時平行添加野生型菸草的總蛋白和空白對照(CK，提取蛋白所用的溶液)，28°C培養幾天後觀察各處理抑菌真菌生長的情況，並據此評價轉基因菸草的體外抗真菌活性，結果·如圖3所示，LrGLP2轉基因菸草蛋白對葡萄座腔菌和擬莖點黴屬真菌的生長具有很強的抑制活性，對尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢的生長也具有明顯的抑制作用。
權利要求
1.一種岷江百合類萌發素蛋白基因其特徵在於:所述類萌發素蛋白基因LrGLP2的核苷酸序列如SEQ ID:1所示，該基因全長為921bp，具有654bp的開放閱讀框、49bp的5』非翻譯區和218bp的3』非翻譯區，編碼如SEQ ID:2所示胺基酸序列的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的岷江百合類萌發素蛋白基因其特徵在於:類萌發素蛋白基因LrGLP2的編碼區是序列表SEQ ID:1中第50-703位所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的岷江百合類萌發素蛋白基因在提高菸草對葡萄座腔菌、尖孢鐮刀菌、灰葡萄孢、擬莖點黴屬真菌抗性中的應用。
4.根據權利要求3所述的岷江百合類萌發素蛋白基因的應用，其特徵在於提高菸草的真菌抗性的具體操作如下: (1)將上述類萌發素蛋白基因與植物表達載體pCAMBIA2300s連接，構建植物超表達載體； (2)將上述構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入目標植物中； (3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，並通過聚合酶鏈式反應獲得真正的轉基因植株，接種特定病原真菌，分析轉基因植物蛋白對真菌生長的抑制活性，最後篩選出對真菌抗性明顯增 強的轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了一種具有真菌抗性的岷江百合類萌發素蛋白基因LrGLP2，LrGLP2基因具有SEQID1所述的核苷酸序列，編碼類萌發素蛋白，本發明通過功能基因組學相關技術證實LrGLP2基因具有提高植物抗真菌的功能。將本發明抗真菌LrGLP2基因構建到植物表達載體上並轉入菸草中過量表達，轉基因菸草植株具有很強的體外抗真菌活性。LrGLP2轉基因菸草蛋白對葡萄座腔菌、擬莖點黴屬真菌、尖孢鐮刀菌、灰葡萄孢的生長具有不同程度的抑制作用。
文檔編號C07K14/415GK103194457SQ201310143928
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月24日 優先權日2013年4月24日
發明者劉迪秋, 李紅麗, 何華, 張南南, 葛鋒, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學