河豚膠的醫藥保健用途的製作方法

2023-06-21 01:59:16

專利名稱：河豚膠的醫藥保健用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於保健食品、中藥藥品和生化藥品領域。具體地說，本發明涉及以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製備的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物——河豚膠(又稱河豚魚皮膠、河豚明膠或河豚膠原)的醫藥保健用途。
背景技術：
關於河豚與河魨的說明按照魚類分類學，名詞「河豚」為水生哺乳類，屬鯨目(Cetacea)、河豚科(Platanistidae)，名詞「河魨」為硬骨魚綱，屬魨形目(Tetrodontiformes)魨科(Tetrodontidae)，兩者進化階元懸殊，分別隸屬不同的綱、目。因此，它們是完全不同的兩類魚，本發明所用河豚屬後一類，即硬骨魚綱、魨形目(Tetrodontiformes)之魨科(Tetrodontidae)。所以，本發明所述河豚按魚類分類學其實應該稱作河魨。但是時至今日，因各種歷史原因和習俗，河魨魚被誤稱為河豚，並一直沿用下來。固本發明也使用了這一名稱(①李時診《本草綱目》；②《康熙字典》；③《新華字典》；④《日華子本草》；⑤《辭海》；⑥李曉川等《河豚魚及其加工利用》，中國農業出版社，1998)。但是按照中國自然科學生理學和魚類分類學審定名詞規定，「河魨毒素」一詞中使用「魨」，具體河魨魚種的學名中也用「魨」。
關於河魨毒素來源與河豚的毒性河豚有毒，這一點大多數人都知道。但是，很多人卻不知道河魨毒素並非河豚自身產生的，即河豚不會自己合成河魨毒素。河豚屬回遊生物，每年4至6月是它們的排卵期，這時它們會從海洋遊入內陸江河，產卵後又遊回大海，河豚幼魚也在當年遊入海洋。實際上，河魨毒素是由寄生於河豚體內的數種海洋微生物產生的，這些寄生性海洋微生物不存在於江河湖泊的淡水中，它們寄生於海洋中的河豚後合成並將河魨毒素分泌屯集於河豚體內。在河豚體內除肉和精囊外，幾乎所有其它組織和器官都含河魨毒素，以卵巢、肝臟、皮膚和血液含量最高。河豚體內的河魨毒素含量還與河豚品種和季節有關，一般從3月至7月末，河豚含毒量較高，其餘時間含毒素較少，11月底至來年1月初降至最低點，此後又會回升，如此循環。此外，河魨毒素在河豚體內含量水平還與其性腺發育程度有關，隨著性腺的成熟，含毒量也逐漸升高，至排卵期達到最高(4至6月)，排卵後毒性又逐漸下降，如此循環英國、日本等多個實驗室在這方面做了許多研究工作，發現在人工培養繁育條件下，河豚都無河魨毒素毒性。進一步深入研究證實，河豚自身基因組及細胞內沒有河魨毒素生物合成所必需的基因族和合成酶類(①Myoung-Ja Lee，et al.A Tetrodotoxin-Producing Vibrio Strain，LM-1，fromthe Puffer Fish Fugu vermicularis radiatus.Appl.Envir.Microbiol.，Apr 2000；661698-1701；②U Simidu，et al.Taxonomy of four marine bacterial strains that produce tetrodotoxin.Int.J.Syst.Bacteriol.，Oct 1990；40331-336；③UK HGMP Resource Centre-The Fugu Genomics ProjectOrigms of the Natural Toxin Tetrodotoxin.Aug.2002。原文如下Increasing evidence areindicative that puffer fish do not have the genes coding for a pathway for the synthesis tetrodotoxinmolecules.David Berkowitz and Ilona Kryspin-Sorensen have reviewed some of this evidence in apublication entitled″Transgenic FishSafe to Eat″.Some of the points raised follow.Puffer fishgrown in culture do not produce tetrodotoxin until they are fed tissues from a toxin producing fish.The blue-ringed octopus found in Australian waters accummulates tetrodotoxin in a special salivaryglad and infuses its prey with toxin by bite.This octopus contains tetrodotoxin-producing bacteria.Xanthid crabs collected from the same waters contain tetrodotoxin and paralytic shellfish toxin.Tetrodotoxin in aleae species Jania is produced by a bacteria species Alteromas.Additionally，tetrodotoxin is similar in structure and mode of action to saxitoxin which is a neurotoxin producedby a marine micro-organism.Both tetrodotoxin and saxitoxin inhibit the activity of the voltagesensitive sodium channel in the same mode of action；and both molecules contain a guanidiniummoiety.④松居隆.化學と生物.1984，22679；⑤安元健.化學と生物.1986，246；⑥陳永豪.河豚含毒與環境影響.中國海洋藥物雜誌，1990，38-9)。因此，如果一條河豚魚從未在海洋中生活過或從未接觸過海水和海洋生物的話，它是不會也不可能具有任何河魨毒素樣毒性的，反之，則一定會攜帶劇毒-河魨毒素。即，在淡水中人工繁殖飼養的河豚完全無毒。經我們實驗室對人工淡水繁殖飼養的不同生長發育階段河豚各種組織毒性的反覆測定，也證實了這一點。
關於膠原蛋白的生理生化和藥理學目前已經發現了二十多種膠原蛋白，都具有三股螺旋結構或部分三股螺旋結構。一般認為，它們作為細胞外基質的主要成分，起支撐，連接，保護和構成的作用，是人體內含量最高的蛋白質，幾乎分布於所有器官和組織。目前，依據膠原分子的形狀和螺旋結構的交聯特徵可以分為以下幾類①.經典的纖維狀膠原(包括I、II、III、V、和XI型)。②.網狀結構膠原(包括IV型族、VIII和X型)。③.在膠原纖維表面發現的和被認為具間斷型膠原三螺旋結構的交聯纖維(包括IX、XII、XIV、XVI和XIX型)。④.形成珠狀肌原纖維的膠原(VI型)。⑤.基底膜上的錨著纖維膠原(VII型)。⑥.具有跨膜結構域的膠原(包括XIII和XVII型)。⑦.新近發現的僅具有部分特徵性的膠原(包括XV、XVIII型)以及具有三股螺旋域的膠原蛋白等(①Prockop，D.J.Collagensmolecular biology，diseases，and potentials for therapy.Annu.Rev.Biochem.，1995，64403-434；②成軍《細胞外基質的分子生物學與臨床疾病》，北京醫科大學出版社，1999；③Ven Der Rest，M.，et al.Collagen family of proteins.FASEB J.，1991，52814-2823)。但是，由於膠原族蛋白分子巨大、種類繁多和結構複雜，迄今我們對膠原族蛋白質的生理生化、生物學功能和病理學意義尚未完全了解。
膠原(collagen)膠原的化學本質是蛋白質，由十幾種胺基酸按一定排列順序組成的膠原亞基(如α、β肽鏈等)是構成膠原分子的亞單位。定向排列整齊的3條膠原亞基肽鏈之間，通過共價鍵搭橋交聯，形成穩定的膠原微纖維不易溶解，故纖維狀膠原屬於不溶性硬蛋白。但常有一部分未共價交聯的膠原亞基可用中性鹽或稀醋酸溶液提取溶解出來，此部分稱為可溶性膠原。纖維狀膠原蛋白分子中的3條亞基肽鏈互相盤旋擰成膠原蛋白特有的左手三股螺旋構型。每個亞基如α-肽鏈大約由1000個胺基酸殘基組成，每個亞基肽鏈分子量約10萬，故纖維狀膠原蛋白分子量約為30萬左右。
膠原分子的亞基肽鏈中有近三分之一的胺基酸殘基為甘氨酸Gly。在胺基酸排列順序中，每隔二個其它胺基酸殘基即有一個Gly殘基，故整個結構可用(甘氨酸-X-Y)n來表示，式中X、Y分別代表其它胺基酸，n大約等於330。此種有規律的結構是使3條α-肽連結合形成三股螺旋結構的重要條件。膠原亞基肽鏈中含有羥脯氨酸Pro-OH和羥賴氨酸Lys-OH殘基，它們常在膠原α-肽鏈的Y位置上出現。而不帶羥基的脯氨酸Pro則常在X位置上出現。羥脯氨酸和Pro總數在膠原分子中約佔22％左右，也是維持膠原分子三股螺旋結構的重要組成部分。膠原分子中不含色氨酸Trp殘基，酪氨酸Try殘基也很少。
如上所述，膠原分子由三條螺旋型的肽鏈互相盤繞而成。每條肽鏈約由1000個胺基酸組成，肽鏈和肽鏈之間，由氫鍵聯結來加以穩定。而在肽鏈的螺旋體上環繞分布著氨基、羥基、羧基和醯氨基。膠原之所以不溶於水，就是由這個緊密、堅固的三螺旋體結構決定的。當膠原受熱或水解時，這個三鏈螺旋結構鬆散開來，變成明膠分子的無序和不規則線團狀肽鏈結構，因而明膠能溶於水，這時，明膠分子的肽鏈不再是定向的螺旋型纖維了。
明膠(gelatin)膠原經過不可逆的變性作用和部分降解斷裂所產生的產物稱為明膠。即明膠是膠原的變性和部分降解產物，由已失去原特定空間構型的無序膠原亞基肽鏈及其部分水解產物膠原多肽組成。膠原由有規則的結構轉變為無規則的明膠需經過二個基本過程熱變性過程 在此過程中，膠原的多肽鏈之間由於加熱引起氫鍵和靜電性鍵的斷裂，從而引起膠原螺旋解體，3條纏繞的蛋白鏈互相鬆開，進入溶液，形成無規則的線團(α鏈)。這個熱過程所需的溫度並不高，約 即可實現，這種解除了鏈間交鏈的膠原可以用中性電解質溶液把它從組織中提取出來。但是這個過程仍然不足以把所有的膠原都轉化為無規則的鏈。因為還有更穩定交聯的膠原在該過程中並沒有解除交聯。
共價鍵交聯的水解斷裂 在工業生產明膠時，這個過程必須發生在明膠製備工藝的熬膠之前，該階段的處理實際上是將膠原的一些肽鍵和交聯體，通過水解而從膠原本身中溶解到溶液中去。膠原中共價鍵的斷裂與PH值和溫度有關。斷裂的位置決定了產物明膠分子量的大小、多肽鏈的數目等。
所以，明膠系一種高分子蛋白質，它是由十幾種胺基酸按一定的方式組合而成的。明膠製品中出現的粘蛋白、糖醛酸和醛，可能來源於粘多糖組織。但這些成分在製造明膠過程中會降解，所以這些少量的非明膠成分不同於膠原製品中的非膠原成分，但是膠原製品和明膠製品的主要化學成分是相同的，即都是膠原性多肽。
已有大量研究文獻證實，皮膚和骨骼中的蛋白質主要是膠原蛋白。皮膚中存在的主要是□型和□型膠原蛋白，它們佔皮膚蛋白的90％左右。骨骼中主要是□型膠原蛋白，軟骨中主要是□型膠原蛋白，它們佔骨骼蛋白的90％以上。由於皮膚和骨骼來源廣泛易得，因此，皮膚和骨骼(包括軟骨)是提取製備明膠以及□、□和□型膠原蛋白的最佳天然原料，這一點已為本領域專業技術人員熟知且被廣泛應用(①Miller，E.J.et al.，inMethods in Enzymol.，vol.82，Academic Press Inc；②Ven Der Rest，M.，et al.Collagen family of proteins.FASEB J.，1991，52814-2823；③施惠群等《水產動物明膠》，農業出版社，1982；④成軍《細胞外基質的分子生物學與臨床疾病》，北京醫科大學出版社，1999；⑤上海明膠廠《皮膠明膠的生產》，上海出版社，1976；⑥蔣挺大等《膠原蛋白》，化學工業出版社，2001)。
然而，膠原蛋白依給藥途徑不同可產生截然相反的效果。如動物皮下注射□型膠原可誘發廣泛性關節炎(①徐叔雲《藥理實驗方法學》第2版，人民衛生出版社；②衛生部藥政局《新藥臨床前研究指導原則彙編》，1993)，但是同樣的膠原口服後，卻可治療風溼和類風溼性關節炎(中國專利CN1070711C等)。有人對此提出解釋，認為這是人體產生免疫耐受。口服動物膠(阿膠、龜甲膠、黃魚鰾膠)可調節、增強機體免疫功能，增強機體抵抗力，這早已為大眾所知，但是藥理作用機制不清楚。這些動物膠的化學本質為變性膠原蛋白及其部分水解產物膠原多肽。
已有大量研究證實，新血管生成在實體腫瘤的持續生長發展及轉移過程中起重要作用(①Folkman，J.Ann.Surg.1972，175409-416；②Folkman，J.Nat.Med.，1995 127-31；③Brooks，P.C.，et al.Cell，1998，92391-400)。研究發現，對血管基底膜膠原蛋白合成的抑制可抗血管生成，說明膠原蛋白合成對血管組織的生成和生長是非常關鍵的(①Maragoudakis，M.E.，et al.Kidney Int.1994，43147-150；②Haralabopoulos，G.G.，et al.Lab.Invest.1994，71575-582)。並由此產生了如endostatin、angiostatin、restin和Arresten、Canstatin、Tumstatin等具有抗血管生成作用的專利藥物，它們都可抑制血管生成和實體腫瘤的生長和轉移。Arresten、Canstatin、Tumstatin的共同顯著化學特徵為它們都是膠原蛋白樣多肽(美國專利US95/05107；US00/00383和US99/13737)。膠原蛋白應用於醫療保健的另一重要製劑來自鯊魚軟骨膠原(屬□型膠原)。中國專利申請公開CN 1314816A、CN1177927、國際專利申請公開WO 95/32722和WO 96/23512等多項專利申請中公開了鯊魚軟骨膠原提取物製備方法及其醫療用途，涉及鯊魚軟骨膠原提取物抗基質金屬蛋白酶、抗新血管生成和抗腫瘤活性。市場現在已有大量各種鯊魚軟骨膠囊製劑銷售。
因此，膠原蛋白除具有支撐，連接，保護和構成的作用外，還有其它我們現在尚不十分了解的重要功能和作用機制。對膠原蛋白分子結構和生物功能的深入研究，將使我們對生命整體機能學和膠原蛋白的醫藥應用產生極為重要的影響。同時說明，我們對膠原蛋白資源的開發應用具有廣闊前景和巨大價值。
關於河豚膠、河豚膠原和明膠的製造工藝與用途明膠包括河豚膠(河豚魚皮明膠)的工業製造工藝技術主要有酸法、鹼法和酶法技術，使用何種工藝主要取決於明膠的用途。但不論何種工藝技術，其生產過程一般包括以下主要工藝步驟(1)原料的前處理□.預處理包括預檢(除去雜物和腐敗原料)；分類(不同組織，新鮮、曬乾或鹽醃製的不同原料歸類)漂洗切塊和脫脂(有機溶劑或水簡單熬煮)。
□.除雜質和軟化膨漲主要有三種方法①酸處理原料用鹽酸進行浸漬處理，所用的酸除鹽酸外，還有醋酸、亞硫酸、磷酸和硫酸等。包括骨質原料的脫鈣(目的在於除去骨質原料中的鈣及其它鹽類，使組織鬆軟，以便使生產明膠所需物質生膠質釋放出來)，軟質原料的膨脹(目的在於使皮、鰾等軟質原料吸水膨脹，便於提取酸處理明膠)及水漂洗。一般需時幾天至幾周，期間需換酸數次。②鹼處理(浸灰)原料用石灰乳浸漬處理的過程。其作用是提高膠原的膠解度，除去原料中的有機雜質和提高明膠的產量、質量。一般用石灰乳浸泡7～50天或更長，亦有用NaOH，Na2SO4或Na2CO3等無機鹼，然後脫灰(包括水洗，酸中和及再水洗，需時5～48小時)。③酶處理一般用鏈黴蛋白酶(pronase)，中性蛋白酶，胰酶或胃蛋白酶等處理，需時3～5天，以除去非膠原蛋白質。酶法處理工藝條件要求較高，否則嚴重影響明膠質量，故使用不多。
(2)明膠的提取熬膠明膠的提取大多沿用古老的熬膠法，即制膠原料和水一起共熱而轉變成明膠的過程。熬膠是明膠生產的關鍵工序。經浸酸、浸灰或酶法處理後的原料，即可進行明膠的提取。提取方法大多採用水煮熬膠法，需熬膠4～6次，每次1～4小時。亦有使用高溫高壓熬膠，或兩種方法結合使用的熬膠工藝，目的均是為了提高出膠率和提高明膠質量。
(3)膠液的處理包括過濾、濃縮、防腐、刮片和乾燥成形，最後得到薄片狀明膠，經粉碎後可得粉末狀或細顆粒形明膠或經噴霧乾燥得到乾粉。
利用現有常規膠原蛋白製備方法易於得到河豚膠原蛋白。如先用稀醋酸、稀鹽酸等稀酸處理，勻漿後，再用NaCl分級沉澱，可得到□、□和□型天然河豚膠原蛋白。用有機溶劑如乙醇、丙酮或高濃度NaCl等沉澱可獲得總蛋白混合提取物(包括膠原蛋白和其它蛋白)(Colowick，S.P.，Kaplan，N.O.，Methods in Enzymol.，vol.82、vol.144、vol.145，Academic PressInc；)。
文獻報導了許多種河豚魚皮膠生產工藝，其中一種如下所述把洗淨的河豚魚皮浸泡於含CaO 1～2％的石灰乳中。在春秋季節，一般浸10～15天，中間換灰3～4次。浸泡期間，須注意及時換灰，翻動。測pH值，防止脫灰。浸灰結束後，取出漂洗，用鹽酸中和，並在pH3.5～4的情況下保持5～6小時，再用水漂洗7～8小時，洗淨後將皮放入熬膠鍋內，加入適量的水(不要太多，因皮內已有大量的水)，調節pH6～6.5，然後，在70□下熬膠4小時，放出膠液(頭道膠)。渣再加入適量的水，在0.5公斤/釐米2壓力下再熬膠2次，每次30分鐘，待壓力等於0後，放出膠液。所得的膠液通過離心、濃縮、冷卻、成形、乾燥，製得成品。(李曉川等《河豚魚及其加工利用》，中國農業出版社，1998)。
上述生產工藝和其他發表文獻製造的河豚膠有以下特點(1)都是變性膠原蛋白或膠原蛋白，以變性膠原蛋白為主並有部分水解；(2)除膠原、明膠蛋白外，魚皮其它蛋白含量很低，被浪費未利用；(3)一般無河豚魚骨、魚鰭膠原蛋白；(4)抗原性很低，原膠原蛋白所結合的糖類抗原決定簇基本被破壞；(5)生物學活性和藥理作用不明，除同下述其他明膠相似作為外科敷料或食品輔料等使用外，本身也未作為任何其他疾病的治療和預防之藥品、保健品或功能食品應用；(6)工藝過程耗時太長(一個周期需20～50天左右)；(7)產生大量三廢(廢酸、廢鹼和廢料)；(8)工藝過程對設備腐蝕性很大；(9)安全性不能保證；(10)製備河豚魨膠原的相關實驗室文獻，工藝複雜，流程長，產率低，條件苛刻，不能進行工業化生產。(①施惠群等《水產動物明膠》，農業出版社，1982；②李曉川等《河豚魚及其加工利用》，中國農業出版社，1998；③鄒勝祥河豚魚皮膠止血粉的試製及止血效果觀察，海洋藥物316，1988；④蔣挺大等《膠原蛋白》，化學工業出版社，2001；⑤Colowick，S.P.，Kaplan，N.O.，Methods in Enzymol.，vol.82、vol.144、vol.145，Academic Press Inc；)。
水產動物膠主要來源於魚皮、魚鰾、魚鱗、魚骨、龜鱉甲等，化學上屬於明膠類。水產動物明膠被廣泛應用於食品、醫藥和工業。在食品中，常用作食品的膠凝劑、糖漿穩定劑、乳化劑、增稠劑、軟糖的發泡劑、糖果等的粘合劑、酒類的澄清劑和香腸腸衣等。在醫藥工業方面，明膠有極其重要的應用，主要包括製作膠囊囊殼，除硬膠囊囊殼外，軟膠囊和滴丸外殼亦是由明膠製成。在藥品片劑生產中，明膠常作為粘合劑，使用後利於固體藥物壓片成型。在生產藥用栓劑和錠劑時，明膠常作為基質賦形劑使用。明膠經處理後，可製成明膠止血海綿、外科用(止血)粉劑、人工血管，人工神經管，補鉻明膠，骨移植基質，促進鈣吸收劑、胺基酸、可吸收性手術縫合線(不需拆線)和保護性敷料等，明膠在醫學上的另一重要用途是製造血漿代用品，用於手術和急救傷員。製作血漿代用品的明膠須去除抗原性和熱原。明膠在工業上亦有許多重要應用，如製作高質量紙張(感光紙，曬圖紙，圖表紙，貨幣紙，照相紙等)；化妝品乳液的乳化劑和穩定劑；絮凝劑(用於汙水處理，提煉鈾礦等)；膠帶紙和雙面膠；細菌培養基；底片製造(x光片、電影膠片和膠捲底片)；紡織工業和皮革工業中用於印染、上漿和上光等(①施惠群等《水產動物明膠》，農業出版社，1982；②蘇州化工廠《骨膠明膠的生產》，上海人民出版社，1973；③上海明膠廠《皮膠明膠的生產》，上海出版社，1976；④蔣挺大等《膠原蛋白》，化學工業出版社，2001；⑤中國申請專利公開97199927；97199928；96198883和98112702等)。
河豚魚皮(魚骨)由於有細刺和毒性(天然河豚魚皮、魚骨含有中等程度的河豚毒素)，大多不作食用，一般用於醫藥和工業明膠製造以及皮革加工製造，醫藥和工業河豚膠(河豚魚皮明膠)已無細刺和河豚毒素，其用途十分廣泛，可用於粘合劑，造紙，印刷，火柴，塑料，照相，細菌培養，醫藥植皮，止血海綿、止血粉和食品工業輔料用膠，但是，從未有過用於本發明之醫藥保健用途(①李曉川等《河豚魚及其加工利用》，中國農業出版社，1998；②鄒勝祥河豚魚皮膠止血粉的試製及止血效果觀察，海洋藥物316，1988；③施惠群等《水產動物明膠》，農業出版社，1982)。
本發明所述河豚的魚肉、魚肝、卵巢、精囊、魚膽、血和目均有藥用記載。魚肉用於補虛，去溼氣，胃病胃出血，理腰腳酸軟，去痔疾，殺蟲。魚肝用於破潰淋巴結核，慢性皮膚潰瘍，癌症治療和鎮痛，也有人用於治療藥物成癮。卵巢用於治療疥癬蟲瘡，瘡癤，無名腫毒，頸淋巴結核，乳癌等。精囊用於提取魚素、精氨酸和魚精蛋白。魚膽用於提取牛磺酸，治療腳氣，燙傷，癬疥等。從河豚提取的河魨毒素可應用於治療關節炎，風溼病，瘙癢，陽萎，性慾低下，遺尿，破傷風，百日咳，氣喘，頭痛，肌肉痙攣，胃痙攣，破傷風痙攣，癌症鎮痛，局部麻醉，藥物成癮，神經和關節疼痛和心率失常等。此外，民間將九斑刺魨和六斑刺魨的皮用於治療水腫、咳嗽、遺精、陽痿、肝炎、哮喘、神經衰弱、小兒血尿和產後奶少。翻車魨、矛尾翻車魨和短吻三刺魨的皮及肝油用於佝僂病、乳腺炎、外傷出血、水火燙傷、跌打損傷和中耳炎等。光兔魨、棕腹刺魨和綠鰭馬面魨的肉、皮和鰾燉服用於痢疾、咳嗽、乳腺炎和胃病(①潘心富河豚藥用研究概況。藥學通報，1984，19(4)34-37；②賈玉海《中國海洋湖沼藥物學》，學苑出版社，1996；③伍漢霖《中國有毒魚類和藥用魚類》，上海科學技術出版社，1978；④江蘇新醫學院《中藥大辭典》，上海人民出版社，1977；⑤《中國藥用動物志》協作組《中國藥用動物志》，第一冊，天津科學技術出版社，1979；⑥李曉川等《河豚魚及其加工利用》，中國農業出版社，1998)。
迄今為止，國內外對河豚膠用於如本發明所述醫藥保健用途的生物活性、藥理作用及其作用機制尚無任何動物試驗研究和臨床應用報導。
關於相關疾病的病理生理學和藥理學胃潰瘍在人群中的發病率為8～10％，屬多發性常見慢性病。雖然消化性胃潰瘍的病理學機制尚未完全了解，但是目前已經認識到下述三種主要的致病因素(1)胃壁細胞分泌鹽酸過多；(2)胃黏膜防禦機能不全或受損和(3)幽門螺桿菌感染。針對上述病因，臨床治療消化性潰瘍藥物有3類(1)減少胃酸分泌藥或酸中和劑，包括H2阻滯劑；質子泵抑制劑；乙醯膽鹼拮抗劑以及酸中和劑；(2)胃黏膜保護劑，保護胃黏膜免受損傷；(3)抗生素，抗幽門螺桿菌感染。它們可分別作用於相應的致病病理過程(①李家泰《臨床藥理學》第二版，人民衛生出版社，1999；②katzung，B.G.《Basic Clinical Pharmacology》7th edition，Appleton Lange，1999)。
刺激胃酸分泌的內源性物質主要有乙醯膽鹼、組胺和胃泌素，抑制胃酸分泌的內源性物質主要有生長抑素、5-羥色胺及前列腺素E2和I2等(①陳壽坡《胃腸病臨床藥理學》，科學出版社，1998；②Mycek，M.J.，et al《Pharmacology》2nd edition，Lippincott Williams Wilkins，2000)。它們與相應受體結合後分別通過胞內腺苷酸環化酶和抑制性G蛋白而最終影響壁細胞頂端分泌小管膜內的質子泵H+，K+-ATP酶的活力而影響胃酸分泌。當刺激和抑制因素失去平衡時，胃酸和胃蛋白酶分泌過多，從而侵蝕胃壁和十二指腸形成潰瘍、炎症和出血乃至穿孔，因此對乙醯膽鹼、組胺和胃泌素有拮抗作用或可直接抑制質子泵H+，K+-ATP酶活性的化合物可望成為新的抑制胃酸分泌類抗潰瘍藥物如奧美拉唑、法莫替丁和派侖西平。
人的胃腔內含有較多的對胃黏膜有損害的物質，其中包括胃酸(鹽酸)、胃蛋白酶、反流入胃腔的膽汁和胰液(含胰蛋白酶等多種蛋白水解酶)、以幽門螺旋桿菌為主的微生物、藥物、飲酒和食物調料等。人胃壁細胞分泌H+濃度約為140～145mmol/L，比血液中高三四百萬倍，十二指腸球部腔內PH也低至2左右。正常人的胃、十二指腸全天與腐蝕力很強的鹽酸和能水解蛋白質的胃蛋白酶接觸，同時又經常暴露在上述對黏膜有害的其他物質中，為何仍可不受損傷而保持其完整性？目前認為，這是由於胃、十二指腸黏膜具有多重複雜的黏膜防禦機制，包括黏膜表面上皮和上皮細胞間的緊密接觸(tight junction)、黏膜血流量、上皮細胞的再生與修復及多種生理活性物質對黏膜的細胞保護作用(mucosa cytoprotection)。具有胃黏膜細胞保護作用的生理活性物質有前列腺素類PGs如PGE2和PGI2、碳酸氫鹽(HCO3-)、源於構成型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)的一氧化氮(NO)、粘液、巰基化合物、胃腸道活性肽(生長抑素、降鈣素基因相關肽和神經降壓素等)和生長因子(表皮生長因子EGF，成纖維細胞生長因子FGF和轉化生長因子αTGFα等)。PGs(PGE2，PGI2等)和源於cNOS的NO具有舒張血管、增加胃黏膜血流量和改善缺血性損傷的作用。當被黏膜損傷因素(如無水乙醇，0.6N HCl，0.2N NaOH，25％NaCl，非甾體抗炎藥，源於誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活力升高引起的胃黏膜組織中NO含量的病理性升高和iNOS基因大量表達以及缺血等〕作用後，胃黏膜防禦機能完整性受到損傷，黏膜保護活性物質在胃黏膜中的水平下降，將使黏膜糜爛和壞死，引起大面積潰瘍和廣泛性深度出血，甚至胃穿孔(①陳壽坡《胃腸病臨床藥理學》，科學出版社，1998；②蕭樹東《消化病學新理論與新技術》上海科技教育出版社，1999；③Robert，A.，et al.Cytoprotection byProstaglandins in rats.Gastroenterology，1979，77433-443；④Kroncke，K.D.，et al.Induciblenitric oxide synthase in human diseases.Clin.Exp.Immunol.1998，113147-156)。反之，如某物質可促進上述黏膜防禦機能和升高細胞保護活性物質水平則可能被開發為黏膜保護類抗潰瘍藥。
目前臨床使用的胃潰瘍治療藥物以上述抗酸藥加抗生素和胃黏膜保護劑為主，主要存在問題是療程長、用藥多、效果差、各藥作用(機制)單一、復發率高和有一定副作用。因此研究開發高效、速效、長效和副作用少的胃潰瘍治療藥物是世界各大製藥公司極其重視的項目和目標。
全球藥物濫用之首當屬酒精濫用(酗酒及攝入過多)，包括中國、日本和歐美國家。酒精濫用可造成巨大社會、家庭和個人健康傷害，如酗酒鬧事、犯罪，家庭暴力，酒精中毒和酒精性疾病，其後果非常嚴重且難以控制。酒精濫用是酒精性胃潰瘍、酒精性胃出血、酒精性肝纖維化(可演化為肝硬化)和酒精性脂肪肝等疾病的主要病因。目前雖然有一些藥物可用於戒酒，但是由於這些藥物的副作用和藥物反應太大以及飲酒者心理抵抗和酒精成癮性，加上社會因素和傳統生活飲食習慣，酒精戒斷幾乎不可能。亦有一些藥物可用於肝保護和胃黏膜保護，但是存在用藥時間長、藥效不理想和藥物起效慢等缺陷。所以研究開發飲酒前和飲酒後治療與預防酒精性疾病高效速效低毒藥物成為必要。從這一點來講，迫切期待開發出本發明的河豚膠。
臨床肝纖維化，脂肪肝，肝硬化屬嚴重肝臟疾病，其主要分子病理學特徵是肝組織中膠原蛋白異常增多和沉積。另外，乙醇和許多藥物及化學品，如對乙醯氨基酚和四氯化碳可誘發臨床或實驗性肝纖維化、脂肪肝或肝硬化，造成肝組織中膠原蛋白異常增多和肝損傷，肝硬化可進一步發展引起肝癌(①Prockop，D.J.Collagensmolecular biology，diseases，and potentialsfortherapy.Annu.Rev.Biochem.，1995，64403-434；②Muriel，P.Nitric oxide protection of ratliver from lipid peroxidation，collagen accumulation，and liver damage induced by carbontetrachloride.Biochem.Pharmacol.，1998，56773-779；③江正輝《酒精性肝病》中國醫藥科技出版社，2001)。
臨床化療的最大問題之一是化療後的副作用，往往給患者造成巨大的生理和心理傷害，這種傷害有時甚至會超過腫瘤本身。常見的化療副作用有嚴重胃腸道反應，體重下降，免疫力下降，白細胞數鹼少，毛髮脫落和抵抗力迅速下降等。因此，升高白細胞數，增強體質和機體免疫力，改善胃腸道功能和提高生活質量的藥物和保健品的應用是克服化療副作用，提高化療效果的另一有效途徑。本發明正是基於這種背景和需求而產生的。

發明內容
本發明所要解決的技術問題本發明的目的是，給出以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製備的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物——河豚膠製備的藥品和保健品的用途。
本發明進一步的目的是，公開以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製備的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物——河豚膠的一系列藥品和保健食品口服製劑及其製備工藝。
本發明的技術解決方案本發明涉及以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防胃潰瘍、酒精性胃潰瘍和胃出血、酒精性胃黏膜損傷、藥物性胃潰瘍和胃出血、藥物性胃黏膜損傷、應激性胃潰瘍、膽汁返流性胃潰瘍疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防十二指腸潰瘍、結腸炎疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防急性胃炎、慢性胃炎、淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃痙攣、胃痛、消化道出血疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防胃腸道功能紊亂、胃動力失調、消化吸收不良、消化吸收不良引起的體重下降、腹脹、腹瀉疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化、酒精性肝纖維化、肝硬化、肝纖維化、藥物性肝損傷疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防免疫功能失調和下降、白細胞減少症、類風溼性關節炎、風溼性關節炎、紅斑狼瘡疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防實體惡性腫瘤主要是消化道腫瘤胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌發生、發展和轉移疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防新生血管生成性疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及河豚膠作為有效成分在製備治療或預防膠原蛋白病理性增生、腰椎骨質增生、肺纖維化、腎纖維化疾病的藥物中的應用。
同時，本發明還涉及河豚膠作為有效成分在生產製造保健食品中的應用。
河豚魚皮明膠、明膠的工業製造工藝技術主要有酸法、鹼法和酶法技術，使用何種工藝主要取決於明膠的用途。但不論何種工藝技術，其生產過程一般包括以下主要工藝步驟(1)原料的前處理□.預處理包括預檢(除去雜物和腐敗原料)；分類(不同組織，新鮮、曬乾或鹽醃製的不同原料歸類)；漂洗；切塊和脫脂(有機溶劑或水簡單熬煮)。
□.除雜質和軟化膨漲主要有三種方法①酸處理原料用鹽酸進行浸漬處理，所用的酸除鹽酸外，還有醋酸、亞硫酸、磷酸和硫酸等。包括骨質原料的脫鈣(目的在於除去骨質原料中的鈣及其它鹽類，使組織鬆軟，以便使生產明膠所需物質生膠質釋放出來)，軟質原料的膨脹(目的在於使皮、鰾等軟質原料吸水膨脹，便於提取酸處理明膠)及水漂洗。一般需時幾天至幾周，期間需換酸數次。②鹼處理(浸灰)原料用石灰乳浸漬處理的過程。其作用是提高膠原的膠解度，除去原料中的有機雜質和提高明膠的產量、質量。一般用石灰乳浸泡7～50天或更長，亦有用NaOH，Na2SO4或Na2CO3等無機鹼，然後脫灰(包括水洗，酸中和及再水洗，需時5～48小時)。③酶處理一般用鏈黴蛋白酶(pronase)，中性蛋白酶，胰酶或胃蛋白酶等處理，需時3～5天，以除去非膠原蛋白質。酶法處理工藝條件要求較高，否則嚴重影響明膠質量，故使用不多。
(2)明膠的提取熬膠明膠的提取大多沿用古老的熬膠法，即制膠原料和水一起共熱而轉變成明膠的過程。熬膠是明膠生產的關鍵工序。經浸酸、浸灰或酶法處理後的原料，即可進行明膠的提取。提取方法大多採用水煮熬膠法，需熬膠4～6次，每次1～4小時。亦有使用高溫高壓熬膠，或兩種方法結合使用的熬膠工藝，目的均是為了提高出膠率和提高明膠質量。
(3)膠液的處理包括過濾、濃縮、防腐、刮片和乾燥成形，最後得到薄片狀明膠，經粉碎後可得粉末狀或細顆粒形明膠或經噴霧乾燥得到淡黃色粉狀製取物，此製取物即是以河豚膠原蛋白或變性膠原蛋白及其部分水解產物為主要化學成分和活性成分的蛋白質製品——河豚膠。
利用現有常規膠原蛋白製備方法易於得到河豚膠原蛋白。如先用稀醋酸、稀鹽酸等稀酸處理，勻漿後，再用NaCl分級沉澱，可得到□、□和□型天然河豚膠原蛋白。用有機溶劑如乙醇、丙酮或高濃度NaCl等沉澱可獲得總蛋白混合提取物(包括膠原蛋白和其它蛋白)(Colowick，S.P.，Kaplan，N.O.，Methods in Enzymol.，vol.82、vol.144、vol.145，Academic PressInc；)。
在乾燥步驟，如使用冷凍乾燥技術進行乾燥，則所得河豚膠凍乾粉色澤較好，可為白色。如使用噴霧乾燥技術進行乾燥，則所得河豚膠乾粉為淡黃色。
本發明的河豚膠之特徵在於是以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝製備的，其河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物總含量大於40％(Kivirikko法測定)，總蛋白含量大於70％(克氏定氮法和Lowry法測定)。
河豚膠製備工藝所用有機酸或無機酸，無機鹼和蛋白水解酶各有多種。作為具體的例子，可以舉出甲酸，醋酸，丙酸，丙二酸，丁酸，丁二酸，蘋果酸，枸櫞酸，酒石酸，乳酸，磷酸，鹽酸，硫酸，硝酸；NaOH，KOH，Ca(OH)2(石灰水)，碳酸鈉；胰蛋白酶，胰酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶，鏈黴蛋白酶，凝血酶，明膠酶，膠原酶□，膠原酶□，膠原酶□，蛋白酶K及其它動、植物和微生物來源的其它各種蛋白水解酶。
本發明所述河豚係指魚類分類學中魨亞目(Tetraodontoidei)魨科(Tetraodontidae)東方魨屬(Fugu)中所有東方魨魚種，如暗紋東方魨(Fugu obscurus)、紅鰭東方魨(Fugurubripes)、假晴東方魨(Fugu pseudommus)、條紋(黃鰭)東方魨(Fugu xanthopterus)、菊黃東方魨(Fugu flavidus)、墨綠東方魨(Fugu basilewskianus)、網紋東方魨(Fugu reticularis)、紫色東方魨(Fugu porphyreus)、蟲紋東方魨(Fugu vermicularis)雙斑東方魨(Fugubimaculatus)、豹紋東方魨(Fugu pardalis)、星點東方魨(Fugu niphobles)、鉛點東方魨(Fugualbopumbeus)、橫紋東方魨(Fugu oblongus)、弓斑東方魨(Fugu ocellatus)、圓斑東方魨(Fuguorbimaculatus)、暈環東方魨(Fugu coronoidus)等東方魨；叉鼻魨屬(Arothron)河豚，如星斑叉鼻魨(Arothron stellatus)、紋腹叉鼻魨(Arothron hispidus)、黑斑叉鼻魨(Arothronnigropucntatus)等；以及以下河豚魚種類，包括密溝魨(Liosaccus cutaneus)、粒突箱魨(Ostraciontuberculatus)、翻車魨(Mola mola)、予尾翻車魨(Masturus lanceolatus)、短吻三刺魨(Triacanthusbrevirostris)、尖吻三刺魨(Triacanthus strigilfera)、革魨(Alutera monoceros)、九斑刺魨(Diodonnovemaculatus)、六斑刺魨(Diodon holacanthus)、密斑刺魨(Diodon hystix)、斑鰭短刺魨(Chilomycterus affinis)、暗鰭腹刺魨(Gastrophysus gloveri)、月腹刺魨(Gastrophysus lunaris)。
上述河豚可來自天然海洋，江河及湖泊，或經人工繁育的河豚(包括巴魚)。
經我們對脫毒後的河豚膠藥效學和藥理學的大量動物試驗研究，發現河豚膠具有多種藥理作用和生物活性。其中一些試驗如下(1).河豚膠對無水乙醇致大鼠胃黏膜損傷的保護作用。
(2).河豚膠對幽門結紮大鼠(Shay模型)胃潰瘍的作用。
(3).河豚膠對醋酸灼燒型大鼠胃潰瘍的作用。
(4).河豚膠對利血平誘發的小鼠胃潰瘍的作用。
(5).河豚膠對消炎痛誘發的大鼠胃潰瘍的預防作用。
(6).河豚膠對大鼠乙醇急性肝損傷的保護作用。
(7).河豚膠對CCl4誘發的大鼠肝損傷的保護作用。
(8).河豚膠對環磷醯胺誘發的小鼠白細胞數下降的影響。
(9).河豚膠對大鼠酒精性脂肪肝的影響。
(10).河豚膠在大鼠體內的藥效動力學試驗。
(11).河豚膠對小鼠胃排空的影響。
(12).河豚膠對消炎痛誘發的潰瘍大鼠胃黏膜中前列環素-6-K水平的保護作用。
(13).河豚膠對乙醯膽鹼(Ach)刺激胃酸分泌的抑制作用。
(14).河豚膠對吲哚美辛胃潰瘍大鼠胃黏膜中PGE2含量的影響。
(15).河豚膠對大鼠十二指腸潰瘍的影響。
(16).河豚膠對幽門結紮(Shay)大鼠血清胃泌素的影響。
(17).河豚膠對乙醇性胃潰瘍大鼠胃黏膜NO含量、iNOS活力以及iNOS和cNOS基因表達水平的影響。
(18).河豚膠抗雞胚血管生成(CAM)試驗。
(19).河豚膠抑制明膠酶(GIA)活力試驗。
(20).淡水人工繁殖飼養河豚的毒性測定。
(21).河豚膠急性毒性試驗。
(22).河豚膠長期毒性試驗。
由此對河豚膠的藥理作用和藥效學得出如下重要結論(1).河豚膠呈劑量依賴性對無水乙醇誘發的大鼠胃黏膜損傷有極顯著保護作用。
(2).河豚膠呈劑量依賴性對Shay大鼠胃潰瘍有極顯著預防作用。說明河豚膠對胃酸性胃潰瘍有顯著性預防治療作用。
(3).河豚膠呈劑量依賴性對醋酸灼傷型胃潰瘍有極顯著治療作用。說明河豚膠對慢性胃潰瘍有治療作用，可顯著促進潰瘍部位的癒合。
(4).河豚膠呈劑量依賴性對利血平誘發的小鼠胃潰瘍有極顯著預防治療作用。說明河豚膠對脾虛性胃潰瘍有顯著預防治療作用。
(5).河豚膠呈劑量依賴性對消炎痛誘發的大鼠胃潰瘍有極顯著預防治療作用。說明河豚膠對非甾體抗炎藥引起的胃黏膜損傷潰瘍有顯著預防治療作用。河豚膠對胃黏膜損傷的保護作用可能是通過升高胃黏膜PGE2含量實現的。
(6).河豚膠呈劑量依賴性對大鼠無水乙醇急性肝損傷有極顯著保護作用。
(7).河豚膠呈劑量依賴性對大鼠四氯化碳急性肝損傷有極顯著保護作用。
(8).河豚膠呈劑量依賴性升高環磷醯胺誘發的小鼠血液白細胞數下降。說明河豚膠可增強機體免疫能力，降低化療藥物的副作用。
(9).河豚膠呈劑量依賴性抑制酒精性脂肪肝大鼠肝臟和胃壁層膠原蛋白含量的病理性升高。表明河豚膠可抑制膠原蛋白在肝臟和胃中的病理性合成。
(10).河豚膠在給藥後30分鐘即達最大藥效的96.81％，說明河豚膠起效迅速。而且河豚膠在給藥後18小時仍保持最大藥效的77.78％，說明河豚膠具有長效性。
(11).河豚膠呈劑量依賴性對小鼠胃排空和溴吡斯地明促進胃排空作用有極顯著抑制作用。說明河豚膠可阻斷乙醯膽鹼的作用，抑制乙醯膽鹼對胃平滑肌的收縮刺激。延長食物在胃腸道中的滯留時間，促進食物的消化吸收。
(12).河豚膠可顯著升高消炎痛引起的前列環素-6-K水平降低，實現其胃黏膜細胞保護作用。
(13).河豚膠呈劑量依賴性對乙醯膽鹼刺激的大鼠胃酸分泌有極顯著抑制作用，而且對基礎胃酸分泌也有顯著抑制作用。說明河豚膠對乙醯膽鹼的阻滯作用是其抗胃潰瘍作用重要機制之一。
(14).河豚膠呈劑量依賴性對PGE2含量有顯著升高作用。揭示河豚膠保護、維持胃黏膜PGE2水平和胃黏膜血流量，是其抗潰瘍作用和胃黏膜細胞保護機制之一。
(15).河豚膠對鹽酸組胺和吲哚美辛誘發的大鼠十二指腸潰瘍有極顯著的預防作用。
(16).河豚膠呈劑量依賴性對Shay大鼠血清胃泌素水平升高有顯著抑制作用。揭示河豚膠可抑制胃泌素刺激的胃酸分泌，是其抗潰瘍作用的重要機制之一。
(17).一方面，河豚膠呈劑量依賴性極顯著降低乙醇損傷大鼠胃黏膜中NO水平、iNOS活力以及iNOS基因表達水平，並使NO含量和iNOS活力極顯著降低至正常水平以下。同時另一方面，河豚膠極顯著升高乙醇誘發的cNOS基因表達水平下降，並恢復至正常水平。表明河豚膠對胃黏膜NO水平、iNOS活力、iNOS和cNOS基因表達的差別調節，是其胃黏膜保護、預防和治療胃潰瘍的重要機制之一。
(18).河豚膠可顯著抑制雞胚新生血管的發生。
(19).河豚膠可顯著抑制明膠酶的活性。
(20).淡水人工繁育河豚在各個生長階段無毒。
(21).脫毒河豚膠高度安全。
(22).脫毒河豚膠可長期口服，安全有效。大劑量服用可增加機體體重，增加機體免疫器官重量，提高機體免疫力。
因此，河豚膠對各種因素誘發的動物胃潰瘍、十二指腸潰瘍具有極顯著的預防和治療效果。河豚膠可顯著抑制誘導型一氧化氮合酶iNOS活力及其基因表達，抑制胃黏膜組織中NO含量的病理性升高，顯著升高構成型一氧化氮合酶cNOS的活力及其基因表達，升高源於cNOS的一氧化氮水平，保護胃黏膜；抑制胃泌素的分泌；抑制乙醯膽鹼、組胺等引起的胃酸分泌；升高胃黏膜中前列腺素E2(PGE2)和前列環素-6-K水平；抑制膠原蛋白在肝臟等組織中的病理性沉積；抑制新血管生成和基質金屬蛋白酶活力；降低乙醇和藥物誘發升高的轉氨酶水平和升高化療藥物引起的血液白細胞數降低等多種生物學活性。因此河豚膠可應用於但不限於如消化系統疾病(如胃潰瘍、胃腸道功能紊亂、胃炎、腸炎、各種因素引起的肝損傷、脂肪肝等)、免疫性疾病(如白細胞減少症等)和腫瘤(如胃癌和結腸癌的發生、轉移和生長)等疾病的治療和預防及保健和症狀改善。還涉及用於有cNOS、iNOS、NO、膠原、新血管生成、基質金屬蛋白酶、胃泌素、乙醯膽鹼、組胺、前列環素-6-K或PGE2參與的疾病的預防和治療性藥物及保健品。
可以用公知的方法製成各種形式的河豚膠藥物和保健食品口服製劑。作為具體的劑型，可以舉出片劑(包括糖衣片、包衣片、素片、含片、泡騰片和咀嚼片)，膠囊劑(包括軟膠囊、微囊)，顆粒劑，衝劑，泡騰顆粒劑，散劑(包括凍乾粉)，丸劑(包括滴丸)，控釋片劑(包括腸溶片劑，緩釋片劑)，控釋膠囊劑(包括腸溶膠囊劑，緩釋膠囊劑)，口服液，果味製劑，咀嚼塊，咀嚼條，含塊，糖漿劑，口腔崩解劑，混懸劑，噴霧劑，溶液(包括湯劑)，懸液，凝膠劑，霜劑，乳劑，膏劑，滴劑等。
上述製劑可以按公知的藥物製劑學的製法與食品工藝學和藥理學上允許用於製劑的載體、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、調味劑等一起作為河豚膠醫藥、保健組合物製成製劑。作為適用於固體製劑中的載體及賦形劑，可以作為例子舉出乳糖、葡萄糖、白糖、甘露醇、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、結晶纖維素、甘草粉、龍膽粉等。作為粘合劑，可以作為例子舉出澱粉、明膠、糖漿、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯基吡咯烷酮、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素等。作為崩解劑，可以作為例子舉出澱粉、瓊脂、明膠粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、結晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、藻酸鈉等。作為潤滑劑，可以作為例子舉出硬脂酸鎂、加氫植物油、聚乙二醇等。作為著色劑，例如有允許向醫藥品中添加的葉綠素銅鈉、紅色2號、黃色2號、藍色1號等。作為調味劑，可作為例子舉出薄荷、橙味香精、香芋香精、阿斯巴甜、甜葉菊甙等。
片劑、膠囊和顆粒劑可以根據需要使用下述物質進行包衣白糖、羥丙基纖維素、精製蟲膠、明膠、山梨糖醇、甘油、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、苯二甲酸纖維素醋酸酯、羥丙基甲基纖維素苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸聚合物等。
作為適用於河豚膠液體製劑中的載體、表面活性劑、助懸劑、著色劑、調味劑、穩定劑、消泡劑、抑菌劑、抗氧劑及賦形劑(增稠劑)，可以作為例子舉出水、硬脂酸、月桂酸、阿洛索-OT、司盤類、吐溫類、薄荷油、香精油類、阿斯巴甜、甜菊甙、甘草甜素、冰糖、黃酒、阿拉伯膠、西黃蓍膠、海藻酸鈉、白及膠、果膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇400、明膠、瓊脂、抗壞血酸、依地酸二鈉等。
本發明的有益效果如下本發明有以下8項顯著特徵1.我們發現，河豚膠主要含有的河豚膠原蛋白和/或河豚明膠蛋白及其部分水解產物具有多種預料不到的生物學活性、顯著的藥理活性和保健作用，即河豚膠具有高效性和多效性。因此河豚膠具有醫藥保健應用前景和價值。
2.脫毒的河豚膠不含河豚毒素，也無其它毒性，高度安全可靠，可長期口服或口腔含服。
3.特別需要指出的是，河豚膠之突出特點在於，河豚膠對酒精性胃潰瘍、酒精性胃黏膜損傷、酒精性胃出血、酒精性中毒、物性胃潰瘍、物性胃黏膜損傷、藥物性胃出血、十二指腸潰瘍、結腸炎、急、慢性胃炎、淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃痙攣、胃痛、胃腸功能紊亂、胃動力失調、消化吸收不良、消化吸收不良引起的體重下降、腹脹和腹瀉具有極顯著的預防、治療與保健作用。
河豚膠對各種因素誘發的動物胃潰瘍、胃黏膜損傷、胃出血具有極顯著的預防和治療效果。
河豚膠可極顯著抑制胃泌素的分泌；極顯著抑制乙醯膽鹼、組胺及胃泌素等刺激引起的胃酸分泌；極顯著抑制幽門結紮大鼠(Shay)胃酸、胃蛋白酶的分泌。表明河豚膠對胃酸性胃潰瘍和胃酸過多症具有預防與治療作用，是高效抗胃酸分泌劑。
河豚膠可極顯著升高胃黏膜中黏膜保護因子前列腺素E2(PGE2)和前列環素-6-K水平，表明河豚膠可通過PGs途經保護胃黏膜，舒張血管，改善胃黏膜血流量，對抗缺血性胃黏膜損傷和壞死。
河豚膠可極顯著抑制誘導型一氧化氮合酶iNOS活力及其基因表達，顯著促進構成型一氧化氮合酶cNOS活力及其基因表達，抑制胃黏膜組織中源於iNOS產生的NO含量的病理性升高，升高源於cNOS產生的有益性NO含量，表明河豚膠可保護胃黏膜，舒張血管，改善胃黏膜血流量，對抗缺血性胃黏膜損傷和壞死，抑制炎症和胃腸道腫瘤的發生。因此，河豚膠是高效胃黏膜保護劑。
4.同時需要特別指出的是，河豚膠之另一突出特點在於，河豚膠可抑制膠原蛋白在肝、胃組織中的病理性沉積，顯著抑制明膠酶活性(GIA試驗)和抗新生血管生成(CAM試驗)，說明河豚膠對機體組織膠原蛋白的非正常合成具有抑制作用，可應用於酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化、酒精性肝纖維化、肺和腎組織纖維化、膠原增生性疾病、需新生血管生成疾病以及實體腫瘤發生、發展和轉移的預防與治療。
而且，河豚膠可顯著降低乙醇和藥物誘發升高的血清轉氨酶水平，表明河豚膠可抵禦酒精和藥物對肝組織細胞的損傷作用。因此，河豚膠具有高效肝保護作用。
5.還要特別指出的是，河豚膠之另一突出特點在於，河豚膠可極顯著升高化療藥物引起降低的血液白細胞數，增加免疫器官胸腺的重量，增加體重，說明河豚膠可增強和調節機體免疫功能，改善消化吸收，增強體質，減少化療藥物副作用。因此，河豚膠具有高效免疫調節和保健作用。
因此河豚膠可應用於但不限於對如胃潰瘍、酒精性胃潰瘍、酒精性胃黏膜損傷、酒精性胃出血、酒精性中毒、藥物性胃潰瘍、藥物性胃黏膜損傷、藥物性胃出血、應激性胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性胃炎、慢性胃炎、淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃痙攣、膽汁返流性胃潰瘍、返流性食管炎、結腸炎、消化道出血、胃酸過多、胃腸功能紊亂、胃動力失調、消化吸收不良、消化吸收不良引起的體重下降、胃痛、腹脹和腹瀉；酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化、酒精性肝纖維化、肝硬化、肝纖維化和藥物性肝損傷；免疫功能失調、白細胞減少症、風溼性關節炎、類風溼性關節炎和紅斑狼瘡；胃腸道惡性腫瘤的發生、轉移和增殖，新生血管生成性疾病，其它實體腫瘤的發生、轉移和增殖；腰椎骨質增生、肺纖維化和腎纖維化、膠原蛋白增生性疾病等疾病的治療、預防藥物的製備和保健作用。河豚膠所具有的這些藥理活性和保健作用是新發現的，從未有過的，也未在文獻上發表過。
6.河豚膠藥理作用起效快，口服有效劑量半小時即可達最大藥效的95％以上。因而本發明的河豚膠是速效的。
7.河豚膠藥效作用維持時間長，口服有效劑量18小時後仍可保持最大藥效的75％以上。因而本發明的河豚膠是長效的。
8.河豚膠可顯著抑制胃排空作用，調節胃動力，改善胃腸道消化功能，促進消化吸收，較大劑量對生長期動物體重有顯著的增加作用和促進生長作用。
因此，本發明之河豚膠作為有效成分應用於治療和預防如胃潰瘍、酒精性胃潰瘍、酒精性胃黏膜損傷、酒精性胃出血、酒精性中毒、藥物性胃潰瘍、藥物性胃黏膜損傷、藥物性胃出血、應激性胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性胃炎、慢性胃炎、淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃痙攣、胃痛、膽汁返流性胃潰瘍、返流性食管炎、結腸炎、消化道出血、胃腸功能紊亂、胃動力失調、消化吸收不良、消化吸收不良引起的體重下降、腹脹、腹瀉、酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化、酒精性肝纖維化、肝硬化、肝纖維化、藥物性肝損傷、免疫功能失調和下降、白細胞減少症、類風溼性關節炎、紅斑狼瘡、胃腸道惡性腫瘤發生、生長和轉移、新生血管生成、其它實體腫瘤生長、轉移和增殖、基質金屬蛋白酶活性、腰椎骨質增生、肺纖維化、腎纖維化、膠原蛋白病理性增生等疾病的藥品、保健食品的製造和醫藥、保健應用是新發現的，從未有過的，也未在文獻上發表過。經我們對河豚膠製造工藝學、藥效學、毒理學、定性定量測定方法及質量分析和控制的大量研究，完成了本發明專利。
本發明所述術語「顯著」或「極顯著」乃是指按統計學上所定義的經適當統計學檢驗方法如t檢驗的P值小於0.01或0.001而言。


圖1為河豚膠的對流免疫電泳鑑別試驗出現的沉澱線。
有關附圖的具體內容將結合實施例說明。
具體實施例方式由於河豚毒素在鹼性條件下極不穩定，所以河豚膠製備原料魚皮的最佳預處理脫毒方法是用鹼液處理。由於河豚膠主要成分為蛋白質，易吸潮，因此其最佳口服製劑為顆粒劑、衝劑、凍乾粉、片劑(包衣)、膠囊劑、口服液、滴丸、膠劑(膠片)等。河豚膠口服製劑的最佳用途是用於消化道疾病(胃潰瘍、酒精性胃潰瘍、酒精性胃出血、酒精性中毒、酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化、酒精性肝纖維化、藥物性胃潰瘍、藥物性胃出血、應激性胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急、慢性胃炎、淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃痙攣、胃痛、膽汁返流性胃潰瘍、結腸炎、胃腸功能紊亂、胃動力失調、消化吸收不良、藥物性肝損傷、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌)、免疫功能失調和下降、白細胞減少症的治療與預防。
下面是說明本發明專利的實施例，但是本發明專利不局限於下述這些實施例。如未作特別說明，下述實施例中所用河豚魚、河豚魚皮、魚骨(鰭)均來自人工繁育的河豚。
實施例1把洗淨的河豚魚皮浸泡於含氧化鈣2％的石灰乳中。浸10天，中間換灰4次。浸泡期間，須注意及時換灰，翻動。測pH值，防止脫灰。浸灰結束後，取出漂洗，用鹽酸中和，並在pH3.5～4的情況下保持6小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮放入熬膠鍋內，加入適量的水(不要太多，因皮內已有大量的水)，調節pH6～6.5，然後，在70□下熬膠4小時，放出膠液(頭道膠)。渣再加入適量的水，在0.5公斤/釐米2壓力下再熬膠2次，每次30分鐘，待壓力等於0後，放出膠液。所得的膠液通過離心、濃縮、冷卻、乾燥粉碎，製得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例2500克河豚魚皮浸泡於2000ml0.2mol/L碳酸鈉中。浸16天，中間換灰4次。浸泡期間，須注意及時換灰，翻動。測PH值，防止脫灰。浸灰結束後，取出漂洗，用鹽酸中和，並在pH3.5的情況下保持5小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮放入熬膠鍋內，加入適量的水(不要太多，因皮內已有大量的水)，調節pH6～6.5，然後，在80□下熬膠4小時，放出膠液(頭道膠)。渣再加入適量的水再熬膠2次，每次2小時，放出膠液。所得的膠液通過離心、濃縮、冷卻、乾燥粉碎，過80目篩，製得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例3500克河豚魚皮浸泡於2500ml 0.2mol/L的醋酸中。浸10天，中間換酸4次。浸泡期間，須注意及時換酸，翻動。測pH值，防止脫酸。浸酸結束後，取出漂洗，用NaOH中和，並在pH4的情況下保持5小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮放入熬膠鍋內，加入適量的水(不要太多，因皮內已有大量的水)，調節pH6～6.5，然後，在70□下熬膠4小時，放出膠液(頭道膠)。渣再加入適量的水，再熬膠2次，每次60分鐘，放出膠液。所得的膠液通過離心、濃縮、冷卻、乾燥粉碎，製得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例4500克河豚魚皮浸泡於2500ml 0.8mol/L的醋酸中。浸12天，中間換酸3次。浸泡期間，須注意及時換酸，翻動。測pH值，防止脫酸。浸酸結束後，取出漂洗，洗淨後加入500ml水，勻漿，然後，加入氯化鈉至2.4mol/L終濃度，於8□沉澱4 8小時，所得的沉澱乾燥粉碎，製得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例5把洗淨的河豚魚皮500克浸泡於1500ml含氧化鈣2％的石灰乳中。浸20天，中間換灰4次。浸泡期間，須注意及時換灰，翻動。測pH值，防止脫灰。浸灰結束後，取出漂洗，用鹽酸中和，並在pH3.5～4的情況下保持5～6小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮加入1000ml水，勻漿，勻漿液調節pH3，然後，加入胰蛋白酶至10mg/L，在54□下水解10小時。所得的水解液離心、濃縮、冷卻、乾燥，製得淡黃色河豚膠。
實施例6把洗淨的河豚魚皮500克浸泡於1500ml含氧化鈣2％的石灰乳中。浸15天，中間換灰4次。浸泡期間，須注意及時換灰，翻動。測pH值，防止脫灰。浸灰結束後，取出漂洗，用鹽酸中和，並在pH3.5～4的情況下保持6小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮加入1000ml水，勻漿，向勻漿液中加乙醇至85％終濃度，在4□下沉澱2 4小時。所得沉澱乾燥粉碎，製得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例7把洗淨的河豚魚皮500克浸泡於pH2的1500ml含胃蛋白酶60mg溶液中。浸48小時，中間換浸泡液2次。浸泡期間，須注意及時翻動，測pH值，防止變質。浸泡結束後，取出漂洗，並在pH3.5～4的情況下保持5～6小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮加入1000ml水，在70□下熬膠4小時，放出膠液。渣再加入適量的水，熬膠2次，每次60分鐘，放出膠液。所得的膠液離心、濃縮、冷卻、成形、乾燥，製得淡黃色河豚膠。
實施例8把洗淨的河豚魚骨浸泡於0.2mol/L的鹽酸中，浸10天，中間換酸4次。浸泡期間，須注意及時換酸，翻動。測PH值，防止脫酸。結束後，取出漂洗，用氫氧化鈉中和，再用水漂洗8小時，洗淨後將骨放入熬膠鍋內，加入適量的水，調節pH6～6.5，然後，在95□下熬膠4小時，放出膠液(頭道膠)。渣再加入適量的水，在0.5公斤/釐米2壓力下再熬膠2次，每次30分鐘，待壓力等於0後，放出膠液。所得的膠液通過離心、濃縮、冷卻、成形、乾燥，製得淡黃色成品。
實施例9把去處內臟的河豚魚(包括肉，骨和皮)浸泡於含氧化鈣2％的石灰乳中。浸12天，中間換灰5次。浸泡期間，須注意及時換灰，翻動。測pH值，防止脫灰。浸灰結束後，取出漂洗，用鹽酸中和，並在pH3.5～4的情況下保持8小時，再用水漂洗8小時，洗淨後將皮放入熬膠鍋內，加入適量的水(不要太多，因皮內已有大量的水)，調節pH6～6.5，然後，在85□下熬膠4小時，放出膠液(頭道膠)。渣再加入適量的水，在0.5公斤/釐米2壓力下再熬膠2次，每次30分鐘，待壓力等於0後，放出膠液。所得的膠液通過離心、濃縮、冷卻、成形、乾燥，製得淡黃色成品。
實施例10取河豚魚皮150克、魚骨(鰭)500克混合物，加去離子水2000ml，於95℃加熱提取10小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加去離子水1000ml同樣提取10小時後，將提取液連同提取殘渣勻漿，勻漿液經離心過濾後，所有濾液合併，80℃真空濃縮至250ml。向濃縮液中加氫氧化鈉至終濃度為0.005mol/L，於95℃密封水解6小時後，加鹽酸中和至pH6，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
取該河豚膠乾粉適量用6N鹽酸於110℃密封水解24小時，按Kivirikko方法測定羥脯氨酸含量並折算出膠原含量，結果表明該河豚膠膠原含量為54％。
實施例11取河豚魚骨(鰭)500克，河豚魚皮200克，加去離子水2500ml，於110℃，2個大氣壓力下，加熱提取2小時後，收集提取液，殘渣再用2000ml蒸餾水同樣提取後，粉碎勻漿，離心或過濾後，濾液與第一次提取液合併，合併液真空濃縮至200ml，噴霧乾燥後，得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例12取河豚魚皮50克，加0.1mol/L醋酸500ml，於室溫浸泡2天，傾去浸泡酸液，用去離子水洗去剩餘酸液後，加蒸餾水300ml，勻漿，勻漿液置於不鏽鋼盤中，使勻漿液厚度＜0.5cm，於20Pa，-10℃冷凍乾燥，得灰白色河豚膠凍乾粉。
取該河豚膠乾粉適量用6N鹽酸於110℃密封水解24小時，按Kivirikko方法測定羥脯氨酸含量並折算出膠原含量，結果表明該河豚膠膠原含量為86％。
實施例13河豚魚皮50克，加0.5mol/L醋酸500ml，室溫浸泡24小時後，用去離子水充分洗滌，勻漿，向勻漿液中加氯化鈉至終濃度為3.5mol/L後，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取白色沉澱，沉澱置不鏽鋼盤中，於30Pa，4℃冷凍乾燥，得灰白色河豚膠凍乾粉。
取該河豚膠乾粉適量用6N鹽酸於110℃密封水解24小時，按Kivirikko方法測定羥脯氨酸含量並折算出膠原含量，結果表明該河豚膠膠原含量為84％。
實施例14河豚魚皮150克，加0.2mol/L醋酸1500ml，25℃浸泡6小時，濾取浸泡酸液備用，用去離子水洗滌並刮去魚皮表面色素層後，重新加入上述浸泡酸液，浸泡24小時後，用去離子水充分洗滌，勻漿，向勻漿液中加氯化鈉至終濃度為3mol/1後，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取沉澱，沉澱復溶於0.1mol/L鹽酸中，並加氯化鈉至1.4mol/L，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取沉澱和上清。沉澱置不鏽鋼盤中，使厚度＜0.5cm，冷凍乾燥，得白色河豚膠凍乾粉，此沉澱主要含河豚□型膠原。離心上清補加氯化鈉至3.5mol/L後，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取沉澱，沉澱置不鏽鋼盤中，冷凍乾燥，得白色河豚膠凍乾粉，此沉澱主要含河豚膠□型膠原。
實施例15取河豚魚骨500克，用0.1mol/L鹽酸4000ml，於90℃提取5小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸3000ml同樣提取，如此共提取2次，合併所有濾液與殘渣，勻漿，過濾，濾液於50℃減壓濃縮至約100ml，噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例16取河豚魚骨1500克，用1.0mol/L醋酸4500ml，於45℃加熱提取24小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸4000ml同樣提取，如此共提取3次，合併濾液與殘渣，勻漿，過濾，濾液於70℃減壓濃縮至約300ml，噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例17取河豚魚骨550克，用0.5mol/L醋酸4500ml，於95℃提取10小時後，勻漿，過濾，濾液於60℃減壓濃縮至約200ml，噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例18取河豚魚骨650克，用0.1mol/L醋酸2000ml，於95℃加熱提取10小時後，勻漿，過濾，濾液於50℃減壓除酸並濃縮至約200ml，向濾液中加氯化鈉至終濃度為3.0mol/L後，於10℃以下放置沉澱36小時，離心取白色沉澱，沉澱置不鏽鋼盤中，乾燥粉碎，得白色河豚膠乾粉。
實施例19取河豚魚皮50克，用0.5mol/L醋酸350ml於25℃浸泡48小時，傾去酸液後，用蒸餾水漂洗至近中性，魚皮中加入250ml去離子水勻漿，勻漿液於50℃減壓除酸並濃縮至約100ml，噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例20取河豚魚皮50克，用0.1mol/L氫氧化鈉350ml於35℃提取72小時後，充分水洗，於95℃加熱提取5小時後，勻漿，勻漿液於60℃減壓濃縮至約80ml，噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例21取河豚魚皮50克，用0.005mol/L丙酸350ml，於100℃提取5小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸250ml同樣提取，如此共提取3次，最後用濾液將殘渣勻漿，勻漿液經過濾後，於50℃減壓濃縮至約100ml，噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例22取河豚魚皮50克，用0.005mol/L醋酸350ml，於115℃，2個大氣壓力下，加熱提取30分鐘，過濾，濾液備用，濾渣再加酸300ml同樣提取，如此重複共提取2次，合併所有濾液與殘渣，勻漿，過濾，濾液於50℃減壓除酸並濃縮至約100ml，在進風溫度300℃，出風溫度120℃條件下噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例23取河豚魚皮120克，加0.5mol/L鹽酸1000ml，於50℃浸泡12小時，酸液傾入另一裝有370克河豚魚骨(鰭)的容器中，於60℃浸泡48小時後，粉碎勻漿，勻漿液放置24小時後，過濾，濾液加入上述酸浸泡過的河豚魚皮中，勻漿，勻漿液於70℃減壓濃縮除酸，濃縮液經離心或過濾後，濾液噴霧乾燥得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例24取河豚魚皮100克，加0.2mol/L醋酸800ml，室溫浸泡96小時後，充分勻漿，勻漿液離心或過濾，向離心上清或濾液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為85％，於10℃放置48小時以沉澱河豚膠，離心或過濾即得河豚膠沉澱，濾液回收乙醇，沉澱置不鏽鋼盤中涼幹或於35℃烘箱中烘乾後，粉碎即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例25取河豚魚皮120克，加0.005mol/L氫氧化鈉1000ml，於60℃加熱提取24小時，勻漿，過濾，濾液於70℃減壓濃縮至150ml，冷卻後向濃縮液中緩慢加入12倍體積的丙酮，邊加邊攪拌，於4℃放置24小時，過濾即得河豚膠沉澱，濾液回收丙酮，沉澱於40℃通風烘箱中烘乾後即得河豚膠乾粉。
實施例26取河豚魚皮50克，加0.1mol/L醋酸500ml，25℃浸泡72小時，傾去浸泡酸液，用去離子水充分洗去剩餘酸液後，加去離子水300ml，勻漿，勻漿液置於不鏽鋼盤中，使勻漿液厚度＜0.5cm，於35Pa，-24℃冷凍乾燥，得灰白色河豚膠凍乾粉。
實施例27取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水1500ml，於100℃加熱提取10小時後，過濾，濾液真空濃縮至500ml。向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取8小時後，勻漿，向勻漿液中加醋酸至終濃度為0.5mol/L，於60℃密封水解12小時，水解液經8000g離心後，離心上清真空濃縮至200ml，噴霧乾燥即得河豚膠乾粉。
按Kivirikko方法測定，結果表明，該河豚膠膠原含量為56％。
實施例28取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水1500ml，於120℃，3個大氣壓力下，加熱提取60分鐘，，過濾，殘渣再加水1000ml同樣提取，過濾，如此反覆提取共5次，濾液真空濃縮至500ml。向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於95℃加熱提取8小時後，勻漿，過濾，濾液，濾液在進風溫度250℃，出風溫度85℃條件下噴霧乾燥即得河豚膠乾粉。
實施例29取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水5000ml，於110℃，2個大氣壓力下，提取1小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加水5000ml同樣提取，如此共提取3次，合併所有濾液，真空濃縮至3500ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取10小時後，勻漿，向勻漿液中加鹽酸至終濃度為0.05mol/L，於60℃密閉水解72小時，水解液經8000g離心後，離心上清真空濃縮至300ml，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例30取河豚魚骨(鰭)500克，加0.1mol/L醋酸5000ml，於60℃加熱提取12小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸5000ml同樣提取，如此共提取3次，合併所有濾液，真空濃縮至3500ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取6小時後，勻漿，過濾，濾液真空濃縮至300ml，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例31取河豚魚骨(鰭)500克，加0.005mol/L醋酸5000ml，於120℃，3個大氣壓力下，提取40分鐘後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸5000ml同樣提取，如此共提取3次，合併濾液，真空濃縮至3500ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取10小時後，勻漿，過濾，濾液真空濃縮至300ml，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例32取河豚魚骨(鰭)500克，加0.1mol/L醋酸5000ml，於95℃加熱提取5小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸5000ml同樣提取，如此共提取3次，合併所有濾液，真空濃縮至3500ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於50℃加熱提取24小時後，勻漿，過濾，濾液真空濃縮至300ml，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例33取河豚魚骨(鰭)500克，加0.1mol/L鹽酸5000ml，於室溫浸泡脫酸48小時後，過濾，濾渣再加酸2000ml勻漿，過濾，濾液，中加入河豚魚皮200克，於室溫浸泡48小時後勻漿，過濾，向濾液中加氯化鈉至終濃度為3mol/l後，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取沉澱，沉澱復溶於0.1mol/L HCl中，並加氯化鈉至1.4mol/L，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取沉澱和上清。沉澱置不鏽鋼盤中，使厚度＜0.5cm，冷凍乾燥，得白色河豚膠凍乾粉，此沉澱主要含河豚□型膠原。離心上清補加氯化鈉至3.5mol/L後，於10℃以下放置沉澱48小時，離心取沉澱，沉澱置不鏽鋼盤中，冷凍乾燥，得白色河豚膠凍乾粉，此沉澱主要含河豚膠□和□型膠原。
實施例34取河豚魚骨(鰭)500克，加0.05mol/L鹽酸5000ml，於110℃，2個大氣壓力下，加熱提取30分鐘後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸5000ml同樣提取，如此共提取3次，合併所有濾液，真空濃縮至3500ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於95℃加熱提取6小時後，勻漿，過濾，濾液真空濃縮至300ml，向濃縮液中加固體氯化鈉，使達終濃度為2.4mol/L，於10℃以下放置48小時以沉澱河豚膠，離心或過濾即得河豚膠沉澱，沉澱置不鏽鋼盤中涼幹或於35℃烘箱中烘乾後，粉碎即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例35取河豚魚骨(鰭)500克，加0.001mol/L醋酸5000ml，於50℃加熱提取24小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加酸5000ml同樣提取，如此共提取5次，合併所有濾液，真空濃縮至3500ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於110℃，2個大氣壓力下，提取1小時後，勻漿，過濾，濾液真空濃縮至300ml，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例36取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水2000ml，於100℃加熱提取5小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加水1500ml同樣提取，如此共提取5次，合併所有濾液，真空濃縮至500ml。向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取4小時後，勻漿，勻漿液經過濾後，濾液真空濃縮至200ml，噴霧乾燥即得河豚膠乾粉。
實施例37取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水1000ml，於100℃加熱提取10小時後，過濾，過濾，濾液備用，濾渣再加水1000ml同樣提取，如此共提取5次，合併所有濾液，真空濃縮至1500ml，向濾液中加入河豚魚皮200克，於95℃加熱提取5小時後，勻漿，向勻漿液中加濃HCl至終濃度為0.05mol/L後，於50℃密封水解24小時後，過濾，濾液真空濃縮至200ml，在進風溫度195℃，出風溫度100℃條件下噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例38取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水2500ml，於100℃加熱提取10小時後，離心或過濾，向濾液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取8小時後，勻漿，向勻漿液中加氫氧化鈉至終濃度為0.05mol/L後，於50℃密封水解4小時後，水解液用稀HCl調pH至7以下，用10000Dol.濾膜進行超濾脫鹽，超濾液真空濃縮至200ml，在進風溫度205℃，出風溫度95℃條件下噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例39取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水3500ml，於100℃加熱提取10小時後，離心或過濾，向濾液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取8小時後，勻漿，向勻漿液中加氫氧化鈉至終濃度為0.05mol/L後，於50℃密閉水解4小時後，向水解液中加固體氯化鈉至終濃度為2.4mol/L，於10℃放置48小時沉澱河豚膠，離心得河豚膠沉澱，沉澱置不鏽鋼盤中涼幹或於35℃烘箱中烘乾後，粉碎即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例40取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水1500ml，於100℃加熱提取10小時後，過濾，向濾液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取8小時後，勻漿，向勻漿液中加胃蛋白酶至10mg/L終濃度和濃鹽酸至終濃度為0.05mol/L後，於35℃密封水解16小時後，過濾，濾液於70℃真空濃縮至200ml，噴霧乾燥即得淡黃色河豚膠乾粉。
實施例41取河豚魚皮100克，加0.5mol/L醋酸800ml，室溫浸泡6小時後，濾取酸液，刮去魚皮表面色素，重新置入酸液浸泡48小時後，濾除酸液並充分水洗，加水1000ml勻漿，勻漿液離心，將離心上清液上樣通過裝有10LCM-52纖維素(已經pH4.8醋酸緩衝液平衡)的離子交換柱，用5000ml pH4.8醋酸緩衝液洗柱後，以5000ml 0.5mol/L氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，向洗脫液中補加氯化鈉至2.5mol/L終濃度，於10℃放置48小時以沉澱河豚膠，離心或過濾即得河豚膠沉澱，沉澱脫鹽後，於35℃烘箱中烘乾後，粉碎即得灰白色河豚膠乾粉。
取該河豚膠乾粉適量用6N鹽酸於110℃密封水解24小時，按Kivirikko方法測定羥脯氨酸含量並折算出膠原含量，結果表明該河豚膠膠原含量為96％。
實施例42取河豚魚皮50克，加0.5mol/L醋酸600ml，室溫浸泡6小時後，濾取酸液，刮去魚皮表面色素，重新置入酸液浸泡48小時後，濾除酸液，加氫氧化鈉中和並充分水洗，加水800ml勻漿，勻漿液離心，將離心上清液上樣通過裝有6LDEAE-32纖維素(已經pH7.2醋酸緩衝液平衡)的離子交換柱，用3000ml pH7.2醋酸緩衝液洗柱後，以3000ml 0.5mol/L氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，向洗脫液中補加氯化鈉至2.5mol/L終濃度，於10℃放置48小時以沉澱河豚膠，離心或過濾即得河豚膠沉澱，沉澱脫鹽後，於35℃烘箱中烘乾後，粉碎即得灰白色河豚膠乾粉。。
取該河豚膠乾粉適量用6N鹽酸於110℃密封水解24小時，按Kivirikko方法測定羥脯氨酸含量並折算出膠原含量，結果表明該河豚膠膠原含量為94％。
實施例43取河豚魚骨(鰭)500克，加去離子水5000ml，於110℃，2個大氣壓力下，提取1小時後，過濾，濾液備用，濾渣再加水3000ml同樣提取，如此共提取3次，合併所有濾液，真空濃縮至3000ml，向濃縮液中加入河豚魚皮200克，於100℃加熱提取10小時後，勻漿，過濾，濾液上樣通過裝有12LDEAE-32纖維素(已經pH7.2 Tris緩衝液平衡)的離子交換柱，用8000ml pH7.2 Tris緩衝液洗柱後，以10000ml 0.5mol/L NaCl溶液洗脫，收集洗脫液，向洗脫液中補加氯化鈉至2.5mol/L終濃度，於10℃放置48小時以沉澱河豚膠，離心或過濾即得河豚膠沉澱，沉澱脫鹽後，於35℃烘箱中烘乾後，粉碎即得灰白色河豚膠乾粉。。
取該河豚膠乾粉適量用6N鹽酸於110℃密封水解24小時，按Kivirikko方法測定羥脯氨酸含量並折算出膠原含量，結果表明該河豚膠膠原含量為81％。
實施例44河豚膠對無水乙醇致大鼠胃潰瘍和胃黏膜損傷的保護作用SD大鼠60隻，體重180-200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行。結果見表1。
表1.河豚膠對無水乙醇致大鼠胃黏膜損傷的保護作用(x±SD)
組別 劑量 動物數途徑 潰瘍指數 pvs病理組正常對照組 NS 10ig 7.0±5.2 ＜0.001病理模型組 NS 10ig 120.9±22.6枸櫞酸鉍鉀 100mg/kg 10ig 15.0±6.0 ＜0.001河豚膠 高劑量 10ig 0.0±0.0 ＜0.001中劑量 10ig 4.6±4.5 ＜0.001低劑量 10ig 15.0±4.2 ＜0.001結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對無水乙醇所致的大鼠胃潰瘍和胃黏膜損傷有極顯著保護作用。
實施例45河豚膠對幽門結紮大鼠(Shay模型)胃潰瘍的作用SD大鼠50隻，體重180-200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行。結果見表2。
表2.河豚膠對Shay大鼠胃潰瘍的預防作用(x±SD)組別 劑量 動物數 途徑潰瘍指數 pvs病理組病理模型組NS 10 ig 20.3±1.1西米替丁 80mg/kg10 ip 15.8±1.5 ＜0.05河豚膠高劑量 10 ig 1.7±1.1 ＜0.001中劑量 10 ig 2.7±2.5 ＜0.001低劑量 10 ig 3.6±2.7 ＜0.001結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對Shay大鼠胃潰瘍有極顯著預防作用。說明河豚膠對胃酸性胃潰瘍有顯著性預防治療作用。
實施例46河豚膠對醋酸灼燒型胃潰瘍的作用SD大鼠50隻，體重180-200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行。結果見表3。
表3.河豚膠對乙酸灼燒型胃潰瘍的治療作用(x±SD)組別 劑量 動物數 途徑 潰瘍面積(m2) pvs病理組病理組NS 10 ig 70.1±34.4 組別西米替丁 80mg/kg10 ip 44.7±38.4 ＜0.001河豚膠高劑量 10 ig 12.6±10.6 ＜0.001中劑量 10 ig 17.9±12.2 ＜0.001低劑量 10 ig 15.0±10.1 ＜0.001結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對醋酸灼傷型胃潰瘍有極顯著治療作用。說明河豚膠對慢性胃潰瘍有治療作用，可顯著促進潰瘍部位的癒合。
實施例47河豚膠對利血平誘發的小鼠胃潰瘍的作用昆明種小鼠75隻，體重18～22g，東南大學附屬醫學院實驗動物中心提供。利血平(Reserpin，FlukaAG，2358531085)。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)方法進行。
結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對利血平誘發的小鼠胃潰瘍有極顯著預防治療作用。說明河豚膠對脾虛性胃潰瘍有顯著預防治療作用。
實施例48河豚膠對大鼠乙醇急性肝損傷的保護作用SD大鼠50隻，體重180-200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行。用自動生化分析儀測定血清谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉氨酶(AST)活力。結果見表4。
表4.河豚膠對大鼠乙醇急性肝損傷的保護作用(x±SD)穀草轉氨酶組別 劑量 動物數途徑 谷丙轉氨酶(U)(U)正常組NS10ig41.0±3.1***156.7±8.1***病理組NS10ig59.5±5.2221.3±15.6河豚膠高劑量10ig39.0±1.4***162.0±4.2***中劑量10ig38.7±6.3***156.3±5.7***低劑量10ig49.7±15.0**186.0±20.9*****p＜0.001，**p＜0.01VS病理組結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對大鼠無水乙醇急性肝損傷有極顯著保護作用。
實施例49河豚膠對CCl4誘發的大鼠肝損傷的保護作用；SD大鼠40隻，120g-150g，雌雄各半。南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)方法進行。用自動生化分析儀測定血清谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉氨酶(AST)活力。。
結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對大鼠四氯化炭急性肝損傷有極顯著保護作用，但未使上述兩種肝酶活性降低至正常水平。
實施例50河豚膠對環磷醯胺誘發的白細胞數下降的影響昆明種小鼠75隻，雌雄各半，體重為18-22g，東南大學附屬醫學院實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行。
結果表明，河豚膠呈劑量依賴性升高環磷醯胺誘發的小鼠血液白細胞數下降。說明河豚膠可增強機體免疫能力，降低化療藥物的副作用。結果見表5。
表5.河豚膠對環磷醯胺誘發降低的小鼠血液白細胞數(WBC)的影響(x±SD)組別 劑量 動物數途徑WBC(×109/L)
正常對照組NS 15 ig 5.3±1.1**病理模型組100mg環磷醯胺/kg 15 ig 3.3±1.7河豚膠高劑量 15 ig 6.3±2.0**中劑量 15 ig 4.2±1.9低劑量 15 ig 3.6±1.4##**P＜0.01，VS病理組 ##P＜0.01，VS對照組實施例51河豚膠對大鼠酒精性脂肪肝的影響SD大鼠40隻，體重150g～200g，雄性，東南大學醫學院實驗動物中心提供。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)及相關文獻進行。
結果表明，河豚膠呈劑量依賴性抑制酒精性脂肪肝大鼠肝臟和胃壁層膠原蛋白含量的病理性升高。表明河豚膠可抑制膠原蛋白在肝臟和胃中的病理性合成。
實施例52河豚膠在體內的時間藥效學試驗SD大鼠50隻，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為5組。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》方法進行。
結果表明，河豚膠在給藥後30分鐘即達最大藥效的96.81％，說明河豚膠起效迅速。而且河豚膠在給藥後18小時仍保持最大藥效的77.78％，說明河豚膠具有長效性。
實施例53河豚膠對胃排空的影響昆明種小鼠105隻，體重20-25g，雌雄各半，東南大學醫學院實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法和Shi G.，et.al.Gut，41612-618，1997酚紅法進行。結果見表6。
表6.河豚膠對小鼠胃排空的抑制作用(x±SD)組別劑量動物數 胃中酚紅殘留量(mg)胃排空率(％)標準組 15 7.61±2.78正常對照組 NS 15 1.28±0.7586.0±7.9#溴吡斯地明組0.1mg/kg15 0.47±0.3693.8±4.8*河豚膠高劑量高劑量15 1.66±0.1784.0±11.7***#+溴吡斯地明 +0.1mg/kg河豚膠 高劑量 15 1.86±0.1 75.0±13.3***#中劑量 15 1.70±0.1677.2±10.1***#低劑量 15 1.24±0.5883.2±23.2****P＜0.001，*P＜0.01 VS溴吡斯地明組 #P＜0.05 VS正常對照組結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對小鼠胃排空和溴吡斯地明促進胃排空作用有極顯著抑制作用。說明河豚膠可阻斷乙醯膽鹼的作用，抑制乙醯膽鹼對胃平滑肌的收縮刺激。延長食物在胃腸道中的滯留時間，促進食物的消化吸收。
實施例54河豚膠對消炎痛誘發的潰瘍大鼠胃黏膜中前列環素-6-K水平的保護作用
SD大鼠18隻，體重180～200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)方法進行。
結果表明，河豚膠可顯著升高消炎痛引起的前列環素-6-K水平降低，實現其胃黏膜細胞保護作用。
實施例55河豚膠對乙醯膽鹼(Ach)刺激胃酸分泌的抑制作用SD大鼠，體重220g-260g，隨機分為五組。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)方法進行。
結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對乙醯膽鹼刺激的大鼠胃酸分泌有極顯著抑制作用，而且對基礎胃酸分泌也有顯著抑制作用。說明河豚膠對乙醯膽鹼的阻滯作用可能是其抗胃潰瘍作用機制之一。
實施例56河豚膠對吲哚美辛誘發的大鼠胃潰瘍和胃黏膜中PGE2含量的影響SD大鼠60隻，體重180-200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)方法進行。結果見表7。
表7.河豚膠對吲哚美辛胃潰瘍大鼠胃黏膜中PGE2含量的影響(x±SD)組別 劑量 動物數潰瘍個數 PGE2(pg/mg蛋白)正常對照組NS100 176±79**病理模型組NS1021.1±2.5 79±16枸櫞酸鉍鉀組 100mg/kg 105.8±2.5***170±104*河豚膠高劑量103.6±2.3***198±141*中劑量107.5±3.5***140±63*低劑量109.6±1.9***138±91***p＜0.001，**p＜0.01，*＜0.05 VS病理模型組結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對消炎痛誘發的大鼠胃潰瘍有極顯著預防治療作用。說明河豚膠對非甾體抗炎藥引起的胃黏膜損傷潰瘍有顯著預防治療作用。河豚膠呈劑量依賴性對PGE2含量有顯著升高作用。揭示河豚膠保護、維持胃黏膜PGE2水平和胃黏膜血流量，是其抗潰瘍作用和黏膜細胞保護機制之一。
實施例57河豚膠對大鼠十二指腸潰瘍的影響雄性SD大鼠50隻，體重250-300g，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按《藥理學實驗指南-新藥發現和藥理學評價》(杜冠華譯，科學出版社)和KOJI(Koji，T.，et.al.Gastroenterology，90636-645，1986)方法進行。
結果表明，河豚膠對鹽酸組胺和吲哚美辛誘發的大鼠十二指腸潰瘍有極顯著的預防作用。
實施例58河豚膠對幽門結紮(Shay)大鼠血清胃泌素的影響SD大鼠60隻，體重180-200g，雌雄各半，南京醫科大學實驗動物中心提供。試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行。用放射免疫試劑盒測定血清中胃泌素含量。結果見表8。
表8.河豚膠對Shay大鼠血清胃泌素水平的影響(x±SD)組別劑量 動物數 胃泌素(ng/L)正常對照NS10 3587.5±356.517***病理模型NS10 4431.4±606.86法莫替丁10mg/kg 10 3656.9±389.8**河豚膠 高劑量10 3761.1±325.1**中劑量10 3706.1±498.1**低劑量10 4000.1±288.0****p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 VS病理模型組結果表明，河豚膠呈劑量依賴性對PGE2含量有顯著升高作用。揭示河豚膠可保護、維持胃黏膜PGE2水平和胃黏膜血流量，是其抗潰瘍作用和黏膜細胞保護機制之一。
實施例59河豚膠對乙醇性胃潰瘍大鼠胃黏膜NO含量、iNOS活力以及iNOS和cNOS基因表達水平的影響試驗按衛生部《新藥臨床前研究指導原則彙編》和《中藥新藥臨床前研究指南》方法進行，觀察河豚膠對大鼠乙醇性胃潰瘍胃黏膜保護試驗，觀察河豚膠對大鼠胃黏膜NO含量、iNOS活力以及iNOS和cNOS基因表達水平的影響。NO含量和NOS活力採用聯苯胺螢光分光光度法測定(陳丁丁等聯苯胺螢光分光光度法測定一氧化氮合酶活力.中國藥科大學學報，2∶134～137，2002)；NOS mRNA用Trizol試劑盒提取後採用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳後，EB染色，自動光密度掃描儀檢測記錄NOSs和β-actin cDNA電泳條帶光密度強度，以此作為相應基因表達量。iNOS和cNOS基因表達水平分別用iNOS/β-actin和cNOS/β-actin光密度比值表示。cNOS、iNOS和β-actin引物序列設計按參考文獻設計(Markewitz，B.A.，et.al.J Clin.Invest.912138～2143，1993)。結果見表9。
表9.河豚膠對乙醇性胃潰瘍大鼠胃黏膜NO含量、iNOS活力以及iNOS和cNOS基因表達水平的影響(x±SD)NO含量 iNOS基因表達 cNOS基因表達劑量 iNOS活力組別 (nmol/mg蛋 水平(iNOS/β水平(cNOS/β(g/kg) (nmol/min/mg蛋白)白) -actin) -actin)正常組 NS 2.57±0.29**0.35±0.04**0.34±0.08***0.85±0.09***病理組 NS 3.75±0.78 0.50±0.11 0.86±0.22 0.34±0.12河豚膠 高劑量 0.28±0.06**###0.03±0.01***###0.45±0.17***0.83±0.12***低劑量 0.23±0.03***###0.03±0.00***###0.49±0.11***#0.65±0.15******p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05 VS病理組，###p＜0.001，##p＜0.01，#p＜0.05 VS正常對照組結果表明，一方面，河豚膠呈劑量依賴性極顯著降低乙醇損傷大鼠胃黏膜中NO水平、iNOS活力以及iNOS基因表達水平，並使NO含量和iNOS活力極顯著降低至正常水平以下。同時另一方面，河豚膠極顯著升高乙醇誘發的cNOS基因表達水平下降，並恢復至正常水平。表明河豚膠對胃黏膜NO水平、iNOS活力、iNOS和cNOS基因表達的差別調節，是其胃黏膜保護、預防和治療胃潰瘍的重要機制之一。
實施例60河豚膠抗雞胚血管生成(CAM)試驗雞胚胎的正常發育包括位於卵黃膜內外部血管系統形成，卵黃膜由卵黃(蛋黃)運送營養物以發育胚胎。當河豚膠施於卵黃膜上時，其抗血管生成活性物質可以抑制在卵黃膜內發生的血管形成。
將含有不同量的河豚膠或適當對照物的甲基纖維素圓盤(惰性固體和透明基質)置於卵黃膜血管周邊的外緣上，在此發生血管生成過程。陽性對照是由含有1.5mg/ml 2-甲氧基雌二醇的甲基纖維素圓盤構成。將對照和含河豚膠圓盤置於3天齡胚胎的卵黃膜上。在這一點，只有主血管開始生長至卵黃。同時將含有陰性對照或一定量河豚膠的甲基纖維素圓盤始終置於同一胚胎的卵黃膜上。兩個圓盤以相對於胚胎頭尾軸對稱的方式放置，以便在對比評價河豚膠和陰性對照的功效時減少個體之間的差異。在圓盤放置後24小時評估血管形成，結果表示為其中血管形成受到影響的胚胎的百分比。當河豚膠圓盤與陰性對照(此時已有較多細小血管生成)對比，其血管生長途徑出現偏離或減弱或當在圓盤下觀察不到血管生長時可以認為血管形成受到抑制。結果表明，河豚膠可顯著抑制雞胚新生血管的發生。
實施例61人工繁殖飼養河豚的河魨毒素毒性測定在人工繁育暗紋東方魨和菊黃東方魨的不同生長階段取50g～1250g體重河豚(相當於6月至兩年齡的魚)，解剖分取卵巢、精囊、肝臟、皮膚、血液、骨、肉、心臟、眼球和其餘內臟，剪碎，按1∶3(w/v)加0.2mol/L醋酸勻漿，勻漿液於室溫放置6小時並不時攪動，用1mol/L Na2CO3調pH6～7後，給小鼠ig 0.8ml/20g/次，每8小時一次，共3次(相當於60kg體重的人24小時內攝入2.4kg量)，每種組織勻漿液灌胃5隻小鼠。結果所有小鼠均存活，無一例死亡。證實人工繁育河豚在各個生長階段無毒。
實施例62河豚膠急性毒性試驗試驗按國家食品藥品監督管理局《中藥新藥研究技術要求》方法進行。預試驗結果表明，河豚膠在最大濃度時，測不出急性毒性參數LD50。試驗按下述方法進行昆明種小鼠20隻，雌雄各半，體重18-20g，東南大學附屬醫學院實驗動物中心提供。實驗前小鼠禁食12小時，自由飲水。以小鼠能耐受的最大容積，24小時內ig最大濃度河豚膠溶液3次，給藥後連續觀察7天，記錄動物的反應情況。
實驗結果給藥後連續觀察7天，未見動物死亡。表明河豚膠高度安全。
實施例63河豚膠長期毒性試驗試驗按國家食品藥品監督管理局《中藥新藥研究技術要求》方法，進行河豚膠Beagle犬長期毒性試驗。結果顯示河豚膠高、中劑量對三個月長期毒性試驗犬體重有顯著增加作用。河豚膠高、中、低劑量對試驗犬生化、血常規指標無顯著影響。河豚膠可升高實驗動物胸腺指數，試驗犬其餘臟器係數均顯示正常。
結果表明，河豚膠可長期服用，安全有效。大劑量服用可增加機體體重，增加機體免疫器官重量，提高機體免疫力。
實施例64河豚膠的對流免疫電泳鑑別試驗試驗按如下方法進行①瓊脂糖板的製備將潔淨的電泳平板放置於水平的檯面上，將已經融化的1.2％瓊脂糖倒於平板之上，並將梳齒置於電泳槽內，待膠凝固後，拔出梳齒。②加樣將河豚膠溶液和河豚膠抗血清分別加入到梳齒孔內，注意不要外溢，每孔上樣量10μl。③電泳將已經加樣完畢的平板放置於電泳槽內，同時電極槽內加入巴比妥緩衝液，用濾紙搭橋進行電泳，電泳條件25mA恆流.。電泳最長進行5小時，觀察在此時間內河豚膠供試品出現的免疫沉澱線。結果見附圖1。圖中下半區的白色條帶為河豚膠與其兔抗血清電泳後形成的專一免疫沉澱線，上半區為對照品的膠原蛋白或變性膠原蛋白電泳區，可見無免疫沉澱線形成，對照品來自各種非河豚魚皮，魚鰾，魚骨，明膠，阿膠，豬皮等。表明本鑑別試驗具有專屬性。
實施例65河豚膠總蛋白含量測定按中華人民共和國藥典(2000版)附錄克氏定氮法和Lowry法進行河豚膠蛋白總含量測定，各進行6批次測定，結果表明，河豚膠總蛋白含量均大於70％。
實施例66河豚膠片劑的製備工藝由河豚膠乾粉製備河豚膠片劑的工藝如下將粉狀的河豚膠原料藥與微晶纖維素和澱粉以重量比為1∶(0.8-1)∶(0.25-0.7)混合均勻，過60-80目篩，加入適量乙醇，將混合物製成軟材，過22目篩，得到製片顆粒，在50℃-60℃的條件下通風乾燥，再過20目篩，得到製片顆粒，加入佔片顆粒重量3％-4％的幹澱粉和1％-2％的滑石粉，混合均勻，在壓片機上壓成片劑即得河豚膠片劑。
實施例67河豚膠膠囊的製備工藝由河豚膠乾粉製備河豚膠膠囊的工藝如下將粉狀的河豚膠原藥與澱粉和羥丙纖維素以重量比為1∶(0.4-0.8)∶(0.05-0.16)混合均勻，加10％澱粉漿適量，製成均勻軟材，20目尼龍篩制粒，加入0.016-0.032倍河豚膠乾粉重量的硬脂酸鎂，混勻，裝入3號膠囊。在上述工藝中，羥丙基纖維素做粘合劑，溼法制粒時用量為1％-5％(g/g)，亦可作崩解劑用量為2％-10％。
實施例68河豚膠咀嚼片製備工藝由河豚膠乾粉製備河豚膠咀嚼片的工藝如下將粉狀的原料與氫氧化鎂、甘露醇和糖粉以重量比為1∶(0.24-0.27)∶(0.5-0.7)∶(0.2-0.4)混合均勻，加入5％的聚乙二醇-6000(溶於50％乙醇)液混合制軟材，過14目篩，於55～66℃乾燥，幹粒過16目篩，用0.01-0.02倍河豚膠乾粉重量的硬脂酸鎂與香料和阿斯巴甜混合，然後加到幹粒中，混合10分鐘，用1/2寸平衝壓片。
實施例69河豚膠口服液製備工藝取河豚魚骨(鰭)500克，河豚魚皮200克，加蒸餾水2000ml，於100℃加熱提取10小時後，收集提取液，殘渣再用2000ml蒸餾水同樣提取後，粉碎勻漿，離心或過濾後，濾液與第一次提取液合併，合併液真空濃縮至比重為1.00-1.10，加入尼泊金乙酯，阿斯巴甜，添加蒸餾水至全量，混勻，過濾，灌封於10ml口服液瓶中，滅菌即得。
實施例70河豚膠滴丸的製備工藝取河豚魚骨(鰭)500克，河豚魚皮200克，加蒸餾水2000ml，於100℃加熱提取10小時後，收集提取液，殘渣再用2000ml蒸餾水同樣提取後，粉碎勻漿，離心或過濾後，濾液與第一次提取液合併，合併液真空濃縮至比重為1.01-1.10，加入適量的聚乙二醇6000和尼泊金乙酯，加熱至90～100℃，充分攪拌，轉移至儲液瓶中，密閉並保溫在80～90℃，調節液滴定量閥門，由上往下，滴入10～15℃的液狀石蠟中，將成形的滴丸瀝盡並擦除液體石蠟，乾燥，即得。
實施例71河豚膠膠劑的製備工藝取河豚魚皮切成小塊，與河豚魚骨浸泡洗淨，分次水煎，濾過，合併濾液，用文火濃縮(或加適量黃酒、冰糖、豆油)至稠膏狀，冷凝，切片，陰乾。
實施例72河豚膠含片的製備工藝以河豚膠乾粉為囊心物，聚乙二醇-6000為囊材製成微囊，加入適當賦型劑，直接壓製成口含片。口含片的處方如下河豚膠乾粉45％，活性炭3％，硬脂酸鎂1％，糊精1％，聚乙二醇-6000∶50％。在上述工藝中，聚乙二醇-6000在乾燥狀態下直接壓片，能達到保持囊膜藥穩定性好、易溶，速效的目的，而且對河豚膠異味有良好的屏蔽作用。，有利於含片消化、釋放，發揮藥效；河豚膠微囊有較強的吸溼性和粘性，壓片困難，活性炭的抗粘劑效果最好。
實施例73河豚膠腸溶片的製備工藝由河豚膠乾粉製備河豚膠腸溶片劑的工藝如下腸溶□、□號樹脂包衣液基本包衣處方95％乙醇28kg，去離子水適量，聚丙烯酸樹脂□適量，聚丙烯酸樹脂口適量，蓖麻油0.65L，苯二甲酸二乙酯0.3L，滑石粉適量。
包衣條件By-1000糖衣機，轉速31～32r/min，噴槍與片子間的距離應調節在30～35cm之間，片心硬度4kg以上，片溫30℃左右，風溫℃，空氣壓力0.4～0.5mPa。
河豚膠腸溶片劑的製備將粉狀的原藥與微晶纖維素和澱粉以重量比為1∶(0.8-1)∶(0.25-0.7)混合均勻，過60-80目篩，加入適量乙醇，將混合物製成軟材，過22目篩，得到製片顆粒，在50℃-60℃的條件下通風乾燥，再過20目篩，得到製片顆粒，加入佔片顆粒重量3％-4％的幹澱粉和1％-2％的滑石粉，混合均勻，在壓片機上壓成片劑即得河豚膠片劑。包腸溶衣，分裝，即得。
實施例74河豚膠糖衣片的製備工藝由河豚膠乾粉製備河豚膠片劑的工藝如下將粉狀的原藥與微晶纖維素和澱粉以重量比為1∶(0.8-1)∶(0.25-0.7)混合均勻，過60-80目篩，加入適量乙醇，將混合物製成軟材，過22目篩，得到製片顆粒，在50℃-60℃的條件下通風乾燥，再過20目篩，得到製片顆粒，加入佔片顆粒重量3％-4％的幹澱粉和1％-2％的滑石粉，混合均勻，在壓片機上壓成片劑即得河豚膠片劑。
包衣工序在第一次加足糖漿量(或膠液)，稍轉動糖衣鍋應及時撒入滑石粉，防止粘連發生。在掛隔離層時，要特別注意片心吸水量過多應適當延長乾燥時間，同時也要注意滾動多會磨壞片邊角等情況，包衣1～2層粉衣時需延長乾燥時間，以防止片心水分未除盡，造成儲存期間片劑膨脹出現裂片現象。總的要求是薄層多次，層層乾燥的原則。
實施例75河豚膠泡騰片的製備工藝由河豚膠乾粉製備河豚膠泡騰片的工藝如下本工藝採用微型膠囊製備方法的噴霧吸收乾燥法，煎碳酸氫鈉的聚乙二醇溶液經噴霧器噴霧於盛裝河豚膠乾粉的包衣鍋內，最後過篩，製成河豚膠顆粒。將枸櫞酸、阿斯巴甜過篩，與河豚膠顆粒及富馬酸細粉一起混勻，壓片，壓片時填料處用紅外燈照射。其工藝特點在於聚乙二醇通過微囊包裹的方法將碳酸氫鈉包裹起來；富馬酸既起發泡劑又起水溶性潤滑劑作用；壓片時填料口用紅外燈照射，控制顆粒的適宜溫度，增加顆粒的軟潤性，進一步保證壓片不粘衝。
實施例76河豚膠衝劑的製備工藝取河豚魚骨(鰭)500克，河豚魚皮200克，加蒸餾水2000ml，於100℃加熱提取10小時後，收集提取液，殘渣再用2000ml蒸餾水同樣提取後，粉碎勻漿，離心或過濾後，濾液與第一次提取液合併，合併液真空濃縮至比重為1.10-1.30，加入糖粉、糊精，製成軟材，制顆粒，乾燥，分裝，即得。
實施例77河豚膠凍乾粉的製備工藝取河豚魚皮50克，加0.1mol/L鹽酸500ml，浸泡48小時，傾去浸泡酸液，用蒸餾水充分洗去剩餘酸液後，加蒸餾水300ml，勻漿，勻漿液置於不鏽鋼盤中，使勻漿液厚度＜0.5cm，冷凍乾燥，得河豚膠凍乾粉。分裝，即得。
實施例78河豚膠糖漿劑的製備工藝取河豚魚骨(鰭)500克，河豚魚皮200克，加蒸餾水2000ml，於100℃加熱提取10小時後，收集提取液，殘渣再用2000ml蒸餾水同樣提取後，粉碎勻漿，離心或過濾後，濾液與第一次提取液合併，合併液真空濃縮至比重為1.10-1.30；另取蔗糖，製成糖漿加入濃縮液中，攪勻，分裝，即得。
實施例79河豚膠微囊的製備工藝由河豚膠製備河豚膠微囊的工藝如下河豚膠，用明膠和阿拉伯膠作複合囊材，將河豚膠混懸於阿拉伯膠的水溶液中，在38℃恆溫下攪拌混勻(pH＝3)，再將等溫的明膠溶液緩緩加入，攪拌(pH＝3.24)，兩種親水膠體材料互相交聯形成複合物後，溶解度降低凝聚形成微囊。繼續攪拌10分鐘，加37℃蒸餾水稀釋，等混懸液溫度降至10℃以下時，用甲醛(36％)固化35分鐘，離心洗滌至無甲醛反應，冷凍乾燥得河豚膠微囊，再製成微囊使用。
實施例80河豚膠控釋膠囊的製備工藝將砂糖過篩，選出一定大小的細料，置糖衣鍋中，並翻動，以糖漿為粘合劑，撒入河豚膠乾粉，製成含藥量40％～50％的小丸，將稱重的小丸用膜材料包衣，控制膜重，得到包衣小丸，裝入膠囊中。
實施例81河豚膠膏劑的製備工藝取河豚魚骨(鰭)500克，河豚魚皮200克，加蒸餾水2000ml，於100℃加熱提取10小時後，收集提取液，殘渣再用2000ml蒸餾水同樣提取後，粉碎勻漿，離心或過濾後，濾液與第一次提取液合併，合併液真空濃縮至稠膏狀，加煉蜜適量，攪勻，繼續濃縮成膏狀，即得。
以上是對本發明的描述，應當理解，在不偏離本發明指導的前提下，本領域專業人員有足夠的能力和知識通過用等同物代替本發明的某些內容來進行修改並達到同樣的目的。因此這些顯而易見的改變也被本申請所覆蓋。
權利要求
1.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防胃潰瘍、酒精性胃潰瘍和胃出血、酒精性胃黏膜損傷、藥物性胃潰瘍和胃出血、藥物性胃黏膜損傷、應激性胃潰瘍、膽汁返流性胃潰瘍疾病的藥物中的應用。
2.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防十二指腸潰瘍、結腸炎疾病的藥物中的應用。
3.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防急性胃炎、慢性胃炎、淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃痙攣、胃痛、消化道出血疾病的藥物中的應用。
4.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防胃腸道功能紊亂、胃動力失調、消化吸收不良、消化吸收不良引起的體重下降、腹脹、腹瀉疾病的藥物中的應用。
5.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化、酒精性肝纖維化、肝硬化、肝纖維化、藥物性肝損傷疾病的藥物中的應用。
6.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防免疫功能失調和下降、白細胞減少症、類風溼性關節炎、風溼性關節炎、紅斑狼瘡疾病的藥物中的應用。
7.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防實體惡性腫瘤主要是消化道腫瘤胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌發生、發展和轉移疾病的藥物中的應用。
8.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防新生血管生成性疾病的藥物中的應用。
9.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在製備治療或預防膠原蛋白病理性增生、腰椎骨質增生、肺纖維化、腎纖維化疾病的藥物中的應用。
10.以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製得的河豚膠原蛋白或其變性膠原蛋白以及它們的混合物及其部分水解產物河豚膠作為有效成分在生產製造保健食品中的應用。
全文摘要
河豚膠的醫藥保健用途，涉及以眾所周知的膠原蛋白或明膠蛋白生產工藝從河豚製備的河豚膠原蛋白和/或變性膠原蛋白及其部分水解產物——河豚膠的醫藥保健用途。河豚膠可用公眾所知的各種方法從河豚的魚皮、魚骨或去除內臟的河豚魚提取製備。本發明的河豚膠具有多種藥理活性、藥理作用、醫藥價值，保健價值，可作為有效成分在製備治療和預防消化系統疾病、免疫性疾病和腫瘤的藥物中應用，以及作為保健食品的用途。
文檔編號A61P29/00GK1589900SQ0315284
公開日2005年3月9日 申請日期2003年8月28日 優先權日2003年8月28日
發明者陳丁丁, 高利忠 申請人:南京寶生藥業有限公司