細菌素誘導者肽的製作方法

2023-04-24 04:24:41

專利名稱：細菌素誘導者肽的製作方法
細菌素誘導者肽
背景技術：
發明領域本發明涉及在誘導者細菌存在下刺激由生產者細菌產生細菌素的新型的肽以及 使用所述肽用於細菌素產生的方法。正常的腸道細菌對於任何宿主動物的健康都是重要的。宿主通過由天然細菌生物 相介導的消化代謝過程而受益。從腸道細菌來看，競爭和隨之發生的進化提供營養素和生 存空間並增加繁殖潛能，使得某些菌株和菌種獲得生存優勢。在細菌進化期間，細菌素的 產生已經發生。在給定的競爭利基(competitive niche)中，細菌素對於其他生物體是拮 抗的並因此提供生態優勢。這些生物素一般是低分子量的多肽，並被基於分子量的差異分 類(Klaenhammer，FEMS Microbiol. Rev.，1993 年 12-39-85 卷)。這些化合物可以容易地 被宿主蛋白酶消化成其組成胺基酸。細菌素可能代表得自競爭性排斥的益處中的重要部分 (Nurmi 和 Rantala，Nature (自然)，倫敦，1973 年，第 241 卷，210-211)。Nurmi和Rantala(1973，同上)最早描述了通過使用得自健康的成年禽糞便的未 確定的細菌菌群控制沙門氏菌在新孵化的雛雞中的定殖中的競爭性排斥的優點。該途徑對 於目前涉及合成抗生素的耕作方法而言是有吸引力的備選方案。得自黏膜的競爭性排斥 菌群被描述為得自健康的成年母雞的腸黏膜內膜刮屑的厭氧培養物(Stern等，美國專利 5，451，400，公布於1995年9月)。此未確定的菌群在雞中提供良好的對於沙門氏菌的定 殖防護，但是僅提供不穩定的彎曲桿菌(Campylobacter)的定殖控制(Stern，Poult. Sci, 1994年，第73卷，402-407)。競爭性排斥出現在野生禽類腸道中並有助於健康的腸道生態。微生物產生各種顯示抗菌性質的化合物。一類這樣化合物，細菌素，由具有類似於 離子載體抗生素的作用機制的殺菌蛋白質組成。細菌素常具有抵抗與該細菌素的生產者密 切相關的菌種的活性。它們在從複雜的微生物群落(例如腸道、口腔或其他的上皮表面)分 離出來的細菌菌種中的廣泛存在，表明細菌素在細菌生態系統中的種群動態方面可能具有 調節作用。細菌素被定義為由細菌產生的具有生物活性的蛋白部分以及殺菌作用的化合物 (Tagg 等，細菌學評論(Bacteriological Reviews)，1976 年，第 40 卷，722-256)。其他的特 徵可以包括(1)窄譜抑制活性，集中於密切相關的菌種；(2)與特定細胞受體附著；(3)質 粒攜帶的細菌素產生和具有宿主細胞細菌素免疫性的遺傳定子。未完全確定的拮抗物質被 稱為「細菌素樣物質」。一些有效抵抗革蘭氏陽性細菌，相反不抵抗革蘭氏陰性細菌的細菌 素，具有較廣譜的活性。已有建議術語細菌素，當被用於描述由革蘭氏陽性細菌產生的抑制 劑時，應該符合⑴是一種肽，⑵具有殺菌活性(Tagg等人，同上)的最低標準。為了經濟上可行地在商業上利用細菌素，在產生期間將產量最優化是必要的 (Chen 和 Hoover，食品科學和食品安全綜述(Comprehensive Reviews in Food Science andFood Safety)，2003年，第2卷，82-100)。Chen和Hoover宣稱發現在生長介質中，針對 尼生素(nisin)生產的關鍵因素是維持最優化的pH以及針對每種產生細菌素的菌株或多 種菌株補充具有特定的營養物的介質。
Knutsen 等人(細菌學雜誌(Journal of Bacteriology)，2004 年，第 186 卷 (10), 3078-3085)公開了一種27個胺基酸的細菌素誘導肽(BIP)，其誘導肺炎鏈球菌 (Streptococcus Pneumoniae)中細菌素的產生。Di印等人(分子生物學(Molecular Biology) 2003年第47 (2)卷，483-494)公開了許多革蘭氏陽性細菌，所述細菌已被報導 為應用所謂的基於肽信息素的信號轉導途徑來調節來自為數眾多的乳酸菌的，稱為細菌 素的抗微生物肽的產生。其還公開了誘導細菌素產生的肽信息素，PInA。Van Belkum和 Stiles (Nat. Prod. Rep.，2000年，第17卷，323-335)公開了一些細菌素需要調節基因的產 物來產生它們。他們宣稱這些基因編碼一種分泌的誘導肽以及與組氨酸激酶和響應調節因 子同源的蛋白質。該參考文獻進一步公開了一些由誘導肽誘導的II類細菌素，而其他的例 如肉食桿菌素B2(Carnobacteriocin B2)和乳桿菌素P (Sakacin P)是由誘導肽誘導或者 由所合成細菌素自誘導的。儘管已經發現各種在細菌中誘導細菌素產生的肽，本領域中仍存在對於採用在體 外增加細菌素產生的量的肽的細菌素商業化生產的需要。本發明提供與現有技術中的肽不 同的肽並提供大量生產用於商業化用途的細菌素的方法。
發明簡述因此，本發明的一個目的是提供在體外刺激細菌素產生的肽。本發明的又一目的是提供在體外刺激體外細菌素產生，並且具有VKGLT (SEQID N0 1)的羧基端序列的肽。本發明的另一目的是提供具有胺基酸序列MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT (SEQ ID NO 3)的肽。 本發明另一個目的是提供具有胺基酸序列TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT (SE Q ID NO 5)的肽。本發明再一個目的是提供具有胺基酸序列WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT (SEQ ID NO 7)的肽。本發明的另一目的是提供體外增加細菌素產生的方法，其中具有VKGLT(SEQID NO 1)的羧基端序列的肽被加至產細菌素細胞的培養物中。本發明又一個目的是提供用於體外增加細菌素0R-7的產生的方法，其中具有SEQ ID NO 3 的肽被加至唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius) PVD-32 (NRRL B-30514)細胞 的培養物中。本發明的另一目的是提供用於體外增加細菌素50-52的產生的方法，其中具有 SEQ ID NO 5 的肽被加至屎腸球菌(Enterococcus faecium)LWP 50-52 細胞(NRRLB-30746) 的培養物中。本發明再一個目的是提供用於體外增加細菌素760的產生的方法，其中具有 SEQID N0 7 的肽被加至倉鼠鏈球菌(Str印tococcus cricetus)LWP 760 細胞(NRRL B-30745)的培養物中。本發明的另一目的是提供通過進一步包括誘導者細胞系而增加由生產者細胞系 產生細菌素的方法。本發明再一個目的是提供通過進一步包括誘導者細胞系捲曲乳桿菌
4(Lactobacillus crispatus) LWP 252 (NRRL B-30884)而增加由生產者細胞系唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)PVD-32 產生細菌素 0R-7 的方法。
本發明再一個目的是提供通過進一步包括誘導者細胞系嗜酸乳酸桿菌 (Lactobacillus acidophilus) LWP 320 (NRRL B-30510)而增加經生產者細胞系屎腸球菌 (Enterococcus faecium)LWP 50-52 產生細菌素 50-52 的方法。本發明再一個目的是提供通過進一步包括誘導者細胞系嗜酸乳酸杆 菌(Lactobacillus acidophilus)LWP 320而增加經生產者細胞系倉鼠鏈球菌 (Streptococcuscricetus) LWP-760 產生細菌素 760 的方法。 本發明其他的目的和優勢從下述說明中將會變得明顯。
微生物的保藏唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius),標明為 NRRL B_30514(菌株 PVD32)，於2001年8月3日保藏；倉鼠鏈球菌(Str印tococcus cricetus)，標明為 NRRL B-30745 (菌株 LWP 760)，以及屎腸球菌(Enterococcus faecium)標明為 NRRL B-30746(菌株LWP-50-52)於2004年5月3日保藏；而嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)，標明為NRRL B-30510 (菌株LWP 320)於2001年8月3日保藏。捲曲乳 桿菌(Lactobacilluscrispatus)，標明為 NRRL B_30884(菌株 LWP 252)於 2005 年 11 月 4日保藏。所有上述菌株已按照布達佩斯條約的規定保藏於美國農業部農業研究服務中 心專利培養物保藏中心(國家農業應用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research),1815N. University Street, Peoria,Illinois 61604)。
附圖簡述

圖1A和IB是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦⑶後對信號肽和細菌素0R-7直接 檢測的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)覆蓋以確定哪個或哪幾個條 帶與抗微生物活性對應，並確定分子量和等電點。在圖1A中第1道——2，100-12, 500範 圍的 LMW分子量標記(Amersham Pharmacia Biotech) :2，100 ；5，780 ；8，400 ；12，500Da。包 含純的細菌素0R-7的第2道的條帶對應抗菌活性，生長抑制的區域具有約5. 5kDa的質量。 包含純的來自PVD-32的信號肽的第3道的條帶具有約2. 5kDa的質量。在圖1B中，包含純 的細菌素0R-7的第1道對應抗菌活性；生長抑制的區域具有約8. 4的pi。包含純的來自 PVD-32的信號肽的第2道的條帶具有約7. 9的pi。第3道包含pi標準物(蛋白質測試混 合物，I 標記蛋白，Serva) 10. 0,9. 2,8. 1,6. 9,5. 5,4. 3。圖2A和2B是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦⑶後對信號肽和細菌素50_52直接 檢測的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個或哪幾個條帶對應抗菌活性，並確定分 子量和等電點。在圖1A中第1道——約2，100-12, 500範圍的LMW分子量標記(Amersham Pharmacia Biotech) :2，100 ；5，780 ；8，400 ； 12，500Da。包含純的細菌素 50-52 的第 2 道的 條帶對應抗菌活性，生長抑制的區域具有約3. 9kDa的質量。包含純的針對LWP-50-52的 信號肽的第3道的條帶具有約3. lkDa的質量。在圖2B中，包含純的細菌素50-52的第1 道對應抗菌活性；生長抑制的區域具有約8. 4的pi。包含純的來自LWP-50-52的信號肽的 第2道的條帶具有約8. 1的pi。第3道包含pi標準物(蛋白質測試混合物，I標記蛋白，
5Serva) :10· 0、8· 1、7· 9、6· 4、5· 5、4· 3、4· 1 以及 3. 8。圖3Α和3Β是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦⑶後對信號肽和細菌素760直接檢 測的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個或哪幾個條帶對應抗菌活性，並確定分子 量和等電點。在圖3A中，第3道顯示約2，100-12, 500範圍的LMW分子量標記(Amersham Pharmacia Biotech) :2，100 ；5，780 ；8，400 ； 12，500Da。包含純的細菌素 760 的第 1 道的條 帶對應抗菌活性，生長抑制的區域具有約5. 5kDa的質量。包含純的來自LWP760的信號肽的 第3道的條帶具有約2. IkDa的質量。在圖3B中，包含純的細菌素760的第1道的條帶對 應抗菌活性；生長抑制的區域具有約9. 5的pi。包含純的來自LWP-760的信號肽的第2道 的條帶具有約8.9的pi。第3道包含pi標準物(蛋白質測試混合物，I標記蛋白，Serva) 10.0,8. 1,7. 9,6. 4,5. 5,4. 3,4. 1 以及 3. 8。
發明詳述腸感染在人中的重要性已經被日益充分地認識到，家禽汙染和人感染之間的關係 也有詳盡記載。通過幹預家禽加工廠消除這種健康危險的能力也是眾所周知的。在肉仔雞 產生和加工過程中，含有病原體的糞便物轉移到肉上，並繼續存在於加工食品的廚房中。競爭性生物的代謝物可能有助於控制病原體例如空腸彎曲桿菌和沙門氏菌。唾 液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，標明為 NRRL B-30514 (菌株 PVD32)，倉鼠鏈球 菌(Sti^ptococcus cricetus)，標明為 NRRL B-30745 (菌株 LWP 760)，以及屎腸球菌 (Enterococcus faecium)，標明為 NRRL B-30746 (菌株 LWP-50-52)產生新細菌素，所述新 細菌素是2003年8月21日遞交的待決美國專利申請10/644，927以及2003年5月1日遞 交的待決美國專利申請10/426，688的主題，所述專利均通過引用整體包括在本文中。這些 菌株還產生體外刺激所述菌株產生更高量的細菌素的新肽。本發明提供新信號肽以及產生所述肽的菌株，新誘導者菌株、胺基酸序列以及使 用所述的新肽和誘導者菌株的方法。唾液乳桿菌，PVD-32 (NRRL B-30514)產生信號肽SEQ ID NO 3。它是一種好氧且 革蘭氏陽性的桿菌，並且能夠在約37°C生長。所述菌株在營養瓊脂或平板計數瓊脂(Plate Count Agar)上生長產生不規則形狀的邊緣。在約37°C需氧培養約24小時後，所述的菌落 是白色的且直徑約3mm。屎腸球菌，LWP 50-52 (NRRL B-30746)產生信號肽SEQ ID NO 5。它是一種兼性好 氧菌和革蘭氏陽性球菌，並且能夠在約37°C生長。所述菌株在營養瓊脂或平板計數瓊脂上 生長產生不規則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養約24小時後，所述的菌落是灰色的且直 徑約2mmο倉鼠鏈球菌，LWP-760 (NRRL B-30745)產生信號肽SEQ ID NO 7。它是一種兼性好 氧菌和革蘭氏陽性球菌，並且能夠在約37°C生長。所述菌株在營養瓊脂或平板計數瓊脂上 生長產生規則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養約24小時後，所述的菌落是灰色的且直徑 約 Imm0嗜酸乳酸桿菌，LWP 320 (NRRL B-30510)，是這樣的誘導者菌株，它是兼性好氧菌 和革蘭氏陽性球菌，並且能夠在約37°C生長。所述菌株在營養瓊脂或平板計數瓊脂上生長 產生不規則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養約24小時後，所述的菌落是白色的且直徑約3mm ο捲曲乳桿菌LWP 252 (NRRL B-30884)是這樣的誘導者菌株，它是好氧菌和革蘭氏 陽性球菌，並且能夠在約37°C生長。所述菌株在營養瓊脂或平板計數瓊脂上生長產生規則 形狀的邊緣。在約37°C需氧培養約24小時後，所述的菌落是灰色的且直徑約1mm。來自產細菌素菌株的信號肽被分離並純化。生產者細胞主要通過ABC轉運系統 分泌 II 類細菌素(Haverstein 等，Mol. Microbiol.，第 16 卷，229-240，1995 ；Gajic 等， J.Biol. Chem.，第36卷，34291-34298，2003)。這類細菌素中的一些的分泌是由於由位於 細胞質膜上的Sec轉位酶激活的信號肽發生的(Cintas等，Appl. Environ. Microbiol.， 第 63 卷，4321-4330，1997 ；Doi 等，J. Biosci. Bioeng.，第 93 卷，434-436，2002 ；Leer 等， 微生物學(Microbiology)，第 141 卷，1629-1635，1995 ；Martinez 等，微生物學，第 145 卷，3155-3161，1999 ；Tomita 等，J. Bacteriol.，第 178 卷，3585-3593，1999 ；Worobo 等， J. Bacteriol.，第 177 卷，3143-3149，1995 ；以及Herranz 等，J. Appl. Environ. Microbiol.， 第71卷(4) ,1959-1963，2005)。信號肽的另一功能可能與細菌現象「群體感應(quorum sensing) 」 有關(De Kievit 等，感染與免疫(Infection and Immunity)，第 68 卷(9)， 4839-4849，2000 ；Dunny 等，在微生物信號傳遞與通信(Microbial Signaling and Communication)中，England 等編，英國劍橋大學出版社(University Press, Cambridge, United Kingdom), 117-138,1999 ；Dunning 禾口 Leonard, Annu. Rev. Microbiol.,第 51 卷， 527-564，1997 ；以及 Kleerebezem 等，Mol. Microbiol.，第 24 卷，895-904，1997)。信號肽單 獨或與誘導菌株的代謝物一起激活生產者中的組氨酸蛋白，由此增加細菌素的產生。為了 獲得最大化的肽產生，產生信號肽的細胞，例如PVD 32，LWP 50-52以及LWP 760，在選自由 苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸及其混合物所組成的組的胺基酸所補充的M9肉湯中培養約2-10 小時。對於包括在所述組合物中的每種胺基酸，本發明優選的實施方案包括在約0. 01%到 約0. 範圍內的胺基酸的量。約10%的布氏肉湯介質導致產生較低濃度的信號肽。採用硫酸銨沉澱，隨後(1)採用Superose 12的高分辨色譜的凝膠過濾；和(2)辛 基-瓊脂糖凝膠6B Fast Flow (快速流動)疏水作用色譜而將信號肽從培養物上清液中分 罔出來。本發明的信號肽被用於在誘導者細菌存在時體外增加由生產者細胞的細菌素產生。所述的信號肽可以在誘導者和生產者細菌的培養期間的任何時刻添加。若給予本文的 發明的詳細說明，本領域的普通技術人員可以容易地確定何時添加所述信號肽以獲得與僅 含所述的肽和生產者、或僅含生產者和誘導者細菌的培養物的細菌素產生相比高水平的細 菌素產生。當使用信號肽和抵抗空腸彎曲桿菌(C. jejuni)和腸炎沙門氏菌 (S. enteritidis)的誘導者細菌菌株時產生的細菌素的拮抗活性採用斑點試驗來評定。所 述步驟包括取約10微升體積的各種濃度(yg/ml)的平板接種在預先接種有靶細菌細胞 的血補給彎曲菌瓊脂(Campylobacter Agar )或營養瓊脂(MPA或後蛋白腖瓊脂(Meta Peptone Agar))上的純細菌素製備物。含空腸彎曲桿菌培養物的平板於約42°C在微需氧條 件下生長。含腸炎沙門氏菌的平板於約37°C在需氧條件下生長。細菌素的活性以每1毫升 製備物任意單位(AU)在其上出現可見的培養物生長抑制區域表示(Henderson等，生物化 學和生物物理存檔(Archives of Biochemistry and Biophysics)，第 295 卷，5-12，1992，通過引用併入本文)。比活也可以以每毫克純細菌素任意單位表示。本發明的信號肽包括由細菌素分泌細菌產生的任何具有VKGLT(SEQ ID NO 1)的羧基端序列的肽，當被加至包括生產者細菌或生產者細菌和誘導者細菌的培養物時，所述 肽增加細菌素的產生。為了本發明的目的，誘導者細菌被定義為任何這樣的細菌，所述細菌當與產細菌 素細菌——生產者細菌一起——連同與生產者的信號肽一起培養時，將細菌素的產生增加 到超過僅含所述生產者細菌和其信號肽的培養物的細菌素的產生。為了本發明的目的，術語「肽」意為至少兩個或更多個胺基酸或胺基酸類似物的化 合物。所述胺基酸或胺基酸類似物可以通過肽鍵相連。在另一個實施方案中，胺基酸可以通 過其他鍵，例如酯，醚等相連。肽可以是任何結構構型，包括線性，分支，或環狀構型。本文所 用的術語「胺基酸」指天然或合成的胺基酸，包括D或L光學異構體，以及胺基酸類似物兩者。
本發明的肽衍生物和類似物包括但不限於包含作為一級胺基酸序列的的那些，所 述肽的所述胺基酸序列的全部或部分包括改變的序列，其中，功能上等同的胺基酸殘基替 代所述序列中的殘基導致保守胺基酸替代。例如，序列中的一個或更多個胺基酸殘基可以由具有相似極性的另外的胺基酸替 代，所述具有相似極性的另外的胺基酸起功能等同物的作用，導致沉默改變。序列中胺基酸 的替代物可以選自該胺基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水)胺基酸包括丙氨 酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香環結構的 胺基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨 酸，酪氨酸，天門冬醯胺，和穀氨醯胺。帶正電荷的(鹼性)胺基酸包括精氨酸，賴氨酸，和組 氨酸。帶負電荷的(酸性)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。預期這種改變不會顯著影響聚 丙醯胺凝膠電泳確定的分子量或等電點。非保守胺基酸替代也可以被引入以替換胺基酸， 使之具有特別偏好的性質。例如，Cys可以被引入到可能的位置以與另一個Cys形成二硫 橋。Pro可以因其特別平面的結構而被引入。本發明的肽可以被化學合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽縮合 (peptidecondensation)技術，或任何其組合製備，並且可以包括天然的和/或合成的氨基 酸。用於肽合成的胺基酸可以是使用Merrifield的原創的固相程序的標準去保護、中和、 耦聯和洗滌方法(J. Am. Chem. Soc，第85卷，2149-2154，1963)的標準Boc (N°-氨基保護
丁基氧羰基)胺基酸樹脂，或鹼敏感的Na-氨基保護的9-芴基甲氧羰基(Fmoc) 胺基酸(Carpino 和 Han，J. Org. Chem.，第 37 卷，3403-3409，1972)。此外，本發明的方法 可以使用本領域技術人員熟知的其他Na-保護的基團。固相肽合成可以用本領域的普通 技術(參見例如 Stewart 和 Young，Solid Phase Synthesis (固相合成)，第二版，Pierce ChemicalCompany, Rockford, 111. , 1984 ；Fields 禾口 Noble, Int. J. Pept. Protein Res.,第 35卷，161-214，1990)，或用自動合成儀完成。下述實施例僅僅是為了進一步舉例說明本發明，並非要限制由權利要求確定的本 發明的範圍。
實施例1屎腸球菌LWP50-52、倉鼠鏈球菌LWP-760以及唾液乳桿菌PVD-32菌株的細胞被平板接種在含有約300mL下列介質的燒瓶中布氏肉湯，10 %布氏肉湯或如下表1所示的由 胺基酸補充的M9。在約37°C振蕩培養約2、4、6和8小時。旋轉速度約為120rpm。約_4°C 下將培養液的等分試樣在約6000Xg離心約15分鐘。通過用約40%的(NH4)2SO4溶液在 約4°C沉降蛋白大約24小時，隨後通過使用Superose-12高分辨色譜凝膠過濾並選擇低分 子量級份而將蛋白分離。這些級份被施於辛基-瓊脂糖凝膠6B Fast Flow(快速流動)疏 水作用色譜柱並用約0. IM Tris緩衝液中，pH 5. 1的0. 4-0. 9M的K2HPO梯度洗脫。結果 在下面示於表1中。從表1可見，從生產者PVD 32,LffP 50-52以及LWP 760分離的肽是低 分子量的並且主要在含飢餓法介質的培養物中積累(M9+指明的胺基酸)。表1來自菌株 PVD-32.LffP-50-52以及LWP-760的誘導者肽的分離和純化 如斑點試驗所確定的，對於PVD-32的分離的信號肽具有微弱的抵抗空腸彎曲杆 菌和腸炎沙門氏菌的拮抗活性。其活性是約200AU/ml，並且如SDS-PAGE電泳所確定的，其 分子量是約2. 5kDa。其等電點(pi)是約7. 9 (圖IA和1B)。如斑點試驗所確定的，針對LWP50-52的分離的信號肽不具有抵抗空腸彎曲桿菌 和腸炎沙門氏菌的拮抗活性。如由SDS-PAGE電泳所確定的，其分子量是約3. lkDa，其等電 點是約8. 1 (圖2A和2B)如斑點試驗所確定的，針對LWP-760的分離的信號肽不具有對空腸彎曲桿菌和腸 炎沙門氏菌的拮抗活性。如由SDS-PAGE電泳所確定的，其分子量是約2. lkDa，其等電點是 約 8. 9 (圖 3A 和 3B)。
實施例2為了確定從PVD-32細胞中分離的信號肽對細菌素0R-7產生的效力，PVD-32細胞在燒瓶中用約300ml大約10%的布氏肉湯培養。將約Iml含有大約109CFU/ml的PVD-32 細胞懸浮液加至所述的肉湯，並添加大約Iml含有約109CFU/ml的LWP 252細胞懸浮液，還 有約0. 10mg/ml,0. 01mg/ml或0. 001mg/ml的PVD 32信號肽。對照樣品不含所述信號肽。 一些樣品含不同濃度的信號肽和生產者菌株，不含誘導者菌株。兩個樣品含0. lmg/ml來自 LffP 760的信號肽或0. lmg/ml來自LWP-50-52的信號肽之一，以及誘導者和生產者菌株兩 者。所述燒瓶採用大約120rpm的攪拌速度在約37°C培養大約14小時。結果總結在以下的 表2中。
在14小時結束時，來自培養物的上清液和1毫升再生瓊脂糖凝膠SP FastFlow 一 起放入500ml (ν/ν 500 1)離心燒瓶中。在攪拌下將其在室溫溫育大約1小時。然後用 約IOOml ρΗ約6. 4的0. 2Μ TRIS-HCl緩衝液洗滌懸浮物。通過用約IOOml ρΗ約5. 8的約 0. 2Μ的K2HPO4在約7，000 X g離心約10分鐘洗提細菌素。細菌素級份抵抗空腸彎曲桿菌和 腸炎沙門氏菌的拮抗活性用上面描述的斑點試驗評定。細菌素級份的純度水平用SDS-PAGE 確定。級份的等電點用等電聚焦確定。對於所有細菌素級份的蛋白質濃度用分光光度計在 215nm確定。結果表示在下面的表2中。如表2中所見，與LWP-252 (誘導者)在約0. Olmg純化的來自PVD-32的信號肽一 起培養PVD-32(生產者)將細菌素0R-7的產量增加到達到1升培養液約214. 5mg。添加分 離自菌株LWP 50-52和LWP 760的信號肽不增加相對對照的細菌素0R-7的產量。這表明 這樣的事實，即信號肽對生產者是強烈特異性的。當所述信號肽、生產者和誘導者同時引入 培養液時，細菌素的合成增加。為評定所述信號肽在按比例放大的培養下對於細菌素產生的作用，在含大約6 升培養液的生物反應器中生長生產菌株和誘導菌株。培養物和所述信號肽的濃度比例是 109CFU/ml 的 PVD-32 (生產者菌株)、109CFU/ml 的 LWP-252 (誘導者菌株)以及 0. Olmg/ml 的純化的來自PVD-32的信號肽。在約8、10、12和14小時的培養後分離細菌素0R-7。見表 3。純化方案如上所述。實驗重複三次。表2從PVD-32分離的信號肽對細菌素0R-7產生 的影響
表3 桉比例放大條件下牛產者菌株PVD-32和誘導者菌株LWP 50-52在PVD-32信號肽存 在下的培養
對照V-61 生物反應器，10%布氏肉湯，PVD-32，LWP252，在 pH 6. 9，37°C，150r. p. m.下， 培養14小時。信號肽V-61生物反應器，10%布氏肉湯，PVD-32，LffP 252，PVD-32信號 肽-0.2mg在pH 6. 9，37°C，150r.p.m.下，培養14小時。在從PVD-32分離出的特定信號 肽的存在下PVD-32 (生產菌株)和LWP 252 (誘導菌株)的共同培養物允許每升培養液約 214-225毫克的細菌素0R-7的產生。
實施例3為了確定從LWP 50-52中分離的信號肽對細菌素50_52產生的效力，如實施例2 所描述的在37°C培養LWP 50-52。將約Iml含有約109CFU/ml的LWP 50-52細胞懸浮液加 至10%的布氏肉湯，將約109CFU/ml的誘導者菌株LWP-320加至所述肉湯，並且還添加約 0. 10mg/ml,0. 01mg/ml，或0. 001mg/ml的LWP 50-52信號肽。對照樣品不含所述信號肽。一 些樣品含不同濃度的信號肽和生產者菌株，不含誘導者菌株。兩個樣品含0. 10mg/ml來自 LffP 760的信號肽或0. 10mg/ml來自PVD-32的信號肽之一，以及誘導者和生產者菌株兩者。 所述燒瓶採用約120rpm的攪拌速度在約37°C培養約14小時。結果總結在以下的表4中。細菌素50-52的分離包括兩步(1)從培養液的上清液中分離細菌素，以及(2)從 誘導菌株和生產菌株兩者的細胞沉澱中分離細菌素。在步驟1中，收穫所述培養物並通過 在約10，OOOXg離心約15min以沉澱所述細胞來分離。上清液被施於辛基-瓊脂糖凝膠 4FastFl0W(快速流動)柱，採用約20mM pH約7. O的K2HPO4的洗脫緩衝液以重新獲得所 述細菌素。來自步驟2的細胞沉澱被懸浮在pH約5. 6的具有約0.7%的NaCl的磷酸鹽緩 衝液(洗脫緩衝液)中，並將所述的懸浮液混合併溫育約20分鐘。溫育後，將懸浮液在約 10，OOOXg離心約15分鐘。採用含約IOmM的Tris-HCl和約125mM的NaCl，pH約7. 5的 洗脫緩衝液，用在Superose SP Fast Flow上的離子交換色譜，從所述的上清液中分離細菌 素。所述細菌素級份抵抗空腸彎曲桿菌和腸炎沙門氏菌的拮抗活性在斑點試驗中評定。細 菌素的純度水平用SDS-PAGE確定。所述級份的等電點用等電聚焦確定。對於所有細菌素 級份的蛋白質濃度用分光光度法在約215nm確定。表4從LWP 50-52分離的信號肽對細菌 素50-52產牛的影響
如從表4可見，在約0. Olmg/mL來自LWP 50-52的信號肽的存在下同時培養LWP50-52 (生產 者菌株)和LWP 50-52 (誘導者菌株)約8小時將細菌素50-52的產量增加到直到1升培 養液約353. Img0添加分離自PVD-32和LWP 760的信號肽相對於對照不增加細菌素50-52 的產量。應該注意到如果信號肽在培養開始大約2小時後引入培養液，總的培養時間為約 12小時，細菌素的合成被最大化地增加。 為評定所述信號肽在按比例放大的培養下對於細菌素生產的影響，在含有約6升 介質的V-6升生物反應器中培養液的生物反應器中生長生產菌株和誘導菌株。對於10%的 布氏肉湯、LWP 50-52,LffP 320，維持如表5的培養物和所述信號肽的濃度比例，在培養約2 小時後添加0. 01mg/ml的LWP 50-52信號肽。如上所述，細菌素50-52的分離在按如上所述 培養約8、10、12和14小時後進行。對照含有pH約6. 9，在約37°C，以及約150rpm的10% 的布氏肉湯、LffP 50-52、LffP 320。在培養約12小時後分離細菌素50-52。對於第二個條 件，除在培養2小時後添加大約0.22mg的LWP 50-52信號肽之外，所述條件是相同的。結 果下面示於表5。每個條件重複3次。^t 5. LffP 50-52信號肽的存在下牛產者LWP 50-52 和誘導者菌株LWP-320的培養
在LWP 50-52信號肽的存在下與LWP-320 —起培養LWP 50-52，所述的LWP 50-52信號肽在 培養開始約2小時後引入，在大約12小時的培養後導致約360mg/升的細菌素50-52的產生。
實施例4為了確定從LWP-760中分離的信號肽對細菌素760產生的效力，如實施例2所描 述的在約37°C培養LWP-760。將約Iml含有大約109CFU/ml的LWP-760細胞懸浮液加至 約10%的布氏肉湯，並在培養時或在培養開始約2，4，6小時後添加大約Iml的0. lmg/ml, 0.01mg/ml，或0.001mg/ml的LWP-760信號肽製備物。對於另一系列變量，將約Iml含有約 109CFU/ml的LWP-760細胞懸浮液加至約10%的布氏肉湯，將大約Iml含有大約109CFU/ml 的誘導者菌株LWP-320細胞懸浮液加至所述肉湯，並在培養時或在開始培養約2，4或6小 時後添加大約Iml的大約0. lmg/ml, 0. Olmg/ml，或0. 00lmg/ml的LWP-760信號肽製備物。 下一系列條件包括含有大約109CFU/ml的約Iml的LWP-760細胞懸浮液被加至約10%的布 氏肉湯，將大約Iml含有大約109CFU/ml的誘導者菌株LWP-320細胞懸浮液加至所述肉湯， 並在培養開始時添加約Iml大約0. lmg/ml的純化的LWP-50-52信號肽或純化的PVD-32信 號肽的製備物。對照在約10%布氏肉湯中含有約Iml含大約109CFU/ml的LWP-760細胞懸 浮液以及含大約109CFU/ml的誘導者菌株LWP-320細胞懸浮液。採用在約10，OOOXg下離心約15分鐘分開細胞和培養液來分離細菌素760。上 清液被施於辛基瓊脂糖凝膠4Fast Flow(快速流動)柱以重新獲得所述細菌素，並採用 約15mM的pH約6. 3的K2HPO4洗脫緩衝液洗脫。細胞小團被懸浮在pH約5. 6的約0. 7% 的NaCl的磷酸鹽緩衝液(洗脫緩衝液)中，並將所述的懸浮液混合併溫育約20分鐘。溫 育階段後，將懸浮液在約10，OOOXg下離心約15分鐘。上清液被施於Superose SP Fast Flow (快速流動)柱以分離所述細菌素，採用約25mM的Tris-HCl以及約90mMNaCl的pH約 6.4的洗脫緩衝液。所述細菌素級份抵抗空腸彎曲桿菌和腸炎沙門氏菌的拮抗活性在如上 所述的斑點試驗中評定。細菌素760的純度水平用SDS-PAGE確定。等電點用等電聚焦確 定。蛋白質濃度用分光光度法在約215nm確定。結果在下面的表6中展示。表6LWP 760 信號肽對細菌素760產牛的影響
如從表6可見，誘導者菌株LWP 760和誘導者菌株320與約0. Olmg來自LWP 760的信號肽 的培養在4小時的培養中將細菌素760的產量增加到達到1升培養液大約693mg。引入來 自PVD 32和LWP 50-52的信號肽相對於對照不增加細菌素760的細菌素生產的產量。
為評定所述信號肽在按比例放大的培養下對於產生細菌素的作用，在有6升10% 的布氏肉湯的V-6升生物反應器中生長LWP 760和LWP 320。維持如上表7中的產生510 毫克/升的細菌素760的條件的培養物和所述信號肽的濃度比例。在培養約8、10、12和14 小時後分離細菌素760。最大的細菌素產生發生在培養12小時之後(下表7)。表7.桉比 例放大的條件下在LffP信號flt的存在下牛產者菌株LffP 760和i秀導者菌株LWP-320的培養
對照V-61 生物反應器，10%布氏肉湯，LWP 760, LffP 320，在 pH 6. 9，37°C，150r. p. m.下， 培養12小時。信號肽V-61反應器，10%布氏肉湯，LWP 760, LffP 320, LffP 760信號肽-在 培養2小時後添加0. 22mg, pH 6. 9，37°C，150r. p. m.，培養12小時。
實施例5針對所述信號肽的胺基酸序列由Edman降解確定，按產生商的說明使用491cLC自 動測序儀(Applied Biosystems, La Jolla, Calif.)。每種信號肽的分子量的確定是通過 具有電噴霧離子化質譜(API IIITAGA 6000E，CJEX，Mumbai，印度)的基質輔助基質解吸和 電離-飛行時間質譜儀(MALDI-T0FMS)按產生商的說明進行的。結果示於下表8中。激 8. Mmm 0R-7, LWP50-52以及LWP760的氨某酸序歹U及其相應的信號月太
胺基酸序列分子量
(Da)a
細菌素KTYYGTNGVHCTKNSLWGKVR1KNMKYDQNTTYMGRLQDIL
LGWATGAFGKTH5， 123
0R-7SEQ ID NO 2
PVD 32MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT2，347
信號肽SEQ ID NO 3
細菌素TTKNYGNGVCNSVNWCQCGNVWASCNLATGCAAWLCKLA3，932
50-52SEQ ID NO 4
LWP 50-52 TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT3，065
信號肽SEQ ID NO 5 前述詳細描述是為了舉例說明的目的。這些細節僅僅是為了該目的，本領域技術 人員可以做出變化而不會背離本發明的精神和範圍。
權利要求
一種具有SEQ ID NO 1的羧基端胺基酸序列的肽。
2.一種具有SEQ ID NO 3的胺基酸序列的肽。
3.一種具有SEQ ID NO 5的胺基酸序列的肽。
4.一種具有SEQ ID NO 7的胺基酸序列的肽。
5.一種用於增加細菌素產生的方法，包括a.向培養物體系添加產細菌素細菌和誘導者細菌，b.添加具有SEQID NO 1的羧基端胺基酸序列的肽，以及c.培養所述細菌和所述肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
6.一種用於刺激具有SEQ ID NO 2的細菌素的產生的方法，包括a.向培養物體系添加產細菌素細胞系NRRL-B-30514和誘導者細胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO 3的肽，以及c.培養所述細菌和所述肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
7.一種用於刺激具有SEQ ID NO 4的細菌素的產生的方法，包括a.向培養物體系添加產細菌素細胞系NRRLB-30746和誘導者細胞系NRRLB-30510，b.向所述體系添加具有SEQIDNO 5的肽，以及c.培養所述細菌和肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
8.一種用於刺激具有SEQ ID NO 6的細菌素的產生的方法，包括d.向培養物體系添加產細菌素細胞系NRRLB-30745和誘導者細胞系NRRLB-30510，e.添加具有SEQID NO 7的肽，以及f.培養所述細菌和所述肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
9.一種用於刺激具有SEQ ID NO 2的細菌素的產生的方法，包括a.向培養物體系添加產細菌素細胞系NRRL-B-30514和誘導者細胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO 1的羧基端胺基酸序列的肽，以及c.培養所述細菌和所述肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
10.一種用於刺激具有SEQ ID NO 4的細菌素的產生的方法，包括g.向培養物體系添加產細菌素細胞系NRRLB-30746和誘導者細胞系NRRLB-30510，h.向所述體系添加具有SEQID NO 1的羧基端胺基酸序列的肽，以及i.培養所述細菌和所述肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
11.一種用於刺激具有SEQ ID NO 6的細菌素的產生的方法，包括j.向培養物體系添加產細菌素細胞系NRRL B-30745和誘導者細胞系NRRL B-30510,k.添加具有SEQ ID NO 1的羧基端胺基酸序列的肽，以及l.培養所述細菌和所述肽一段時間以實現增加的所述細菌素的產生。
全文摘要
由產細菌素細菌產生的新型的肽在體外刺激細菌素的產生。為了實現細菌肽產生的增加，在新的誘導者細菌和具有VKGLT的羧基端序列的肽的存在下培養所述生產者細菌。
文檔編號A61K38/04GK101848723SQ200680051931
公開日2010年9月29日 申請日期2006年12月8日 優先權日2005年12月8日
發明者B·V·葉魯斯拉諾夫, E·A·斯韋託奇, N·J·斯特恩, V·P·列夫查克, V·V·佩雷列金 申請人:由農業部部長代表的美利堅合眾國;國家應用微生物和生物技術研究中心