含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用的製作方法

2023-04-24 07:23:36

專利名稱：含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種物質的新用途，具體涉及一種含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為新型植物生長調節劑的應用。
背景技術：
葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，廣泛存在於高等植物的葉綠體中，是光合作用的物質基礎。化學結構上，葉綠素是一類螯合金屬鎂的化合物，植物葉片中含有大約0. 25%的總葉綠素，其構成主要有葉綠素a、葉綠素b、葉綠素C、葉綠素d等多種異構體，天然提取的葉綠素是這些異構體(單體)的混合物，這些單體異構體的共同點是具有脫鎂葉綠素母環(phorbin)結構；葉綠素具有豐富的化學反應性，與過渡金屬形成螯合物是葉綠素的一類重要反應，由此能獲得一類具有應用價值的產品即葉綠素金屬衍生物，這些產品已廣泛使用於食品及化妝品(A.M.Humphrey，CHLOROPHYLL, Food Chemistry 5(1980)57-67)。食品調色劑葉綠素銅即以葉綠素為原料先脫除螯合鎂，然後採用銅(Cu+2) 鹽在有機溶劑條件下與葉綠素反應製得，以相似的方法很容易製備二價金屬Mn、Zn、Fe、 Co、Ni等或其相應三價金屬的衍生物(過渡金屬葉綠素的合成和光譜研究，自然科學進展， 1999(9)5 405 412 ；常如波，王夢亮，細菌葉綠素過渡金屬配合物的合成和光譜研究，山西大學學報(自然科學版)28(2) :169 172，2005)。葉綠素水解得到含有羧基的降解產物(統稱葉綠酸)是葉綠素具有重要應用價值的另一類重要的反應。由於葉綠素為多種異構體混合物，因此其水解所得葉綠酸產物也是成分極為複雜的混合物，研究表明，依據不同反應條件(如酸鹼度、溫度、反應時間、溶劑等)葉綠素的水解得到的都是多種不同成分比例混合的葉綠酸產品，鹼性反應條件水解得到含有螯合鎂的葉綠酸產品，而酸性反應條件，則水解得脫鎂葉綠酸產品。由於成本的原因，商品化葉綠酸產品採用葉綠素鹼性水解製備而得。葉綠酸產品中各成分結構差異在於邊鏈及羧基數量各不相同，但都具有二氫卟吩(chlorin)或脫鎂葉綠素(phorbin)的母核環，因而易與金屬離子結合生成金屬螯合物。與葉綠酸的複雜成分一樣，其葉綠酸金屬螯合物仍然是多種不同成分的混合物(S. Chernomorsky,Variability of the composition of chlorophyllin,Mutation Research, 324 (1994) 177-178)，且成分比葉綠素更為複雜。儘管組成的各成分結構均含同樣的母核，僅在邊鏈存在差異，但混合態的葉綠酸、各單體葉綠酸成分與其相應的金屬螯合物在生物活性方面卻表現出較大的差異或具有完全不同的性質， 這些都與葉綠酸成分的複雜性及螯合物結構有關。此外，螯合產物中金屬-酸組成比的多變性也是產生性質差異的重要原因，這即與製備條件技術方法有關，也與參與螯合的金屬離子價態及離子半徑存在一定關聯，二價金屬離子由於半徑較大，其螯合物中金屬含量不僅難以達到1 1摩爾比且含量常有較大波動，如葉綠酸銅鈉鹽及葉綠酸鐵鈉鹽(食品用途)商品，產品質量標註的銅含量和鐵含量分別為4-6 %和彡2 %，遠低於9. 2 %及8. 2 %的 1 1螯合摩爾比的金屬含量。
葉綠酸金屬螯合物已廣泛應用於日用化學工業和食品(A. M. Humphrey, CHLOROPHYLL, Food Chemistry 5(1980)57-67)。重要的大批量商品化產品主要是用作食品調色劑的葉綠酸銅鈉鹽及葉綠酸鐵鈉鹽(M. Ishidate, Jr, T. Sofuni, K. Yoshikawa, M. Hayashi, T. Nohmi, M. Sawada And A. Matsuoka, Primary Mutagenicity Screening Of Food Additives Currently Used In Japan,Fd Chem. Toxic. Vol. 22,No. 8,pp. 623 ~636, 1984)，此外，葉綠酸金屬螯合物還作為藥物廣泛使用於臨床。但是，目前葉綠素及其葉綠酸的金屬螯合物在農業方面的應用不多見，作為植物生長調節劑的使用研究還未見文獻報導。葉綠酸金屬螯合物由葉綠酸與金屬鹽在一定條件下製備而得，先脫除葉綠酸中的螯合鎂，再以其他金屬所取代而製得(張廣明，許德餘等，葉綠素降解產物金屬絡合物的合成及其對6°Co輻射小鼠的放射保護作用，藥學學報Acta Pharmaceutica Sinica 1998， 33 (10) 748 754)，由於水溶性原因，葉綠酸金屬螯合物的非螯合羧基通常被鹼化成鹽製備成水溶性產品以方便使用。其製備方法已有大量研究報導，如食品調色劑銅葉綠酸鈉的合成(JP57177064)，猛(III)葉綠酸和鐵(III)葉綠酸(V. V. Borovkov，J. M. Lintuluoto and Y. Inoue, Convenient Method for Efficient Iron and Manganese Ion Insertion into Various Porphyrins under Mild Conditions, Synlett 1999 ; 1999 :61-62)，食品及藥物用途的鐵葉綠酸鈉的製備(王立娟，錢學仁，竹葉葉綠素鐵鈉的製備及性質研究，林產化學與工業，2005 (25) 3 89 9 ，具有生物活性的葉綠酸金屬衍生物鋅葉綠酸(鋅葉綠酸 a的合成及初步臨床應用)、鈷(II)葉綠酸(葉綠素a鈷(II)-煙醯胺的合成)、鉻(III) 葉綠酸(鉻葉綠酸鈉的合成及臨床試用初探)等，鐵葉綠酸鈉鹽也能夠由傳統中藥蠶沙製備，其優勢是價格低、品質好質量穩定。葉綠酸含有多種異構體成分，是組成複雜的混合物產品。市售葉綠酸銅鈉鹽標明的成分分別含有葉綠酸二酸銅鈉鹽(二氫卟吩-e4銅鈉鹽)、葉綠酸三酸銅鈉鹽(二氫卟吩_e6銅鈉鹽)，同時還含有其他近10種二氫卟吩類結構螯合銅的鈉鹽成分。不同商品來源的產品，依據工藝技術及原料其混合二氫卟吩成分的比例有所不同(Alan Mortensen， Asger Geppel， HPLC-MS analysis of the green food colorant sodium copper chlorophyl1 in，Innovative Food Science and Emerging Technologies 8(2007)419-425)。氯化葉綠酸鐵則由葉綠酸與三氯化鐵反應製得，主要含有氯化葉綠酸二酸鐵(氯化二氫卟吩_e4合鐵)、氯化葉綠酸三酸鐵(氯化二氫卟吩_e6合鐵)和氯化葉綠酸a單甲酯鐵等成分(Y. Nonomura,等，High-performance liquid chromatographic separation of iron (III)chlorophyllin,Journal of Chromatography A，721 (1996) 350-3 )，由市售的氯化葉綠酸鐵產品可分離獲得這三種單體化合物，而通常稱為氯化葉綠酸鐵的產品是以這三種單體化合物為主要成分的多種成分混合物。很久以來已經發現，鋅、錳、銅、鐵等過渡金屬是植物生長必須的微量營養元素，是植物體內促進光合作用、呼吸作用以及物質轉化作用等各種活性酶或輔酶的組成部分，在植物體內含量介於0.2 200mg/kg之間，現代研究表明許多過渡元素如鉻、鈷、鎳等和部分稀土元素也具有調節/促進植物生長作用，然而這些金屬元素還沒有作為植物生長調節劑的應用報導。鋅、錳、銅、鐵等過渡金屬元素通常以無機鹽或簡單絡合型化合物作為微量元素肥料使用，其實際施用量達每畝1 3500克不等，由於產品劑型簡單、使用環境複雜及較難把握的施用方法，長期使用即易引起植物毒性且可能造成難以治理的環境汙染。植物生長調節物質的應用是近代植物生理學及農業技術的重大進展之一，雖然植物內源性生長調節活性物質在極低濃度下(< Ιμπιο /L)即顯示強的活性，但其含量極微、 難以提取製備，因而價格高昂，因此，非植物內源性的生長調節物質即成為研究的重點。植物生長調節劑有天然提取和人工合成兩大類，目前，有100多種產品投入市場應用，已成為提高和改善農產品產量品質的一項重要技術方法(傅華龍等，植物生長調節劑的研究與應用，生物加工過程，2008 (6) 4 :7 1 。植物生長調節劑一般具有低濃度促進而高濃度抑制植物生長的特性，須以狹窄的劑量範圍使用才能夠發揮正常功效，這導致實際應用存在諸多限制和不便；植物內源性激素具有天然的代謝途徑和方式，不易積蓄，與其相比，目前使用的外源性合成類植物生長調節劑，使用劑量較高濃度偏大、且代謝途徑不清、化學性質穩定，殘留較多或殘效期長，隨著應用範圍的不斷擴大，其殘留問題已引起人們的高度重視 (趙敏等，植物生長調節劑對農作物和環境的安全性，環境與健康雜誌，2007 (M) 5 :370 372)，我國已經規定，任何綠色食品生產加工過程，不得以肥料和農藥的形式使用化學合成的植物生長調節劑(中華人民共和國農業行業標準NY-T 393-2000綠色食品農藥使用準則；NY-T 394-2000綠色食品肥料使用準則)。研究、開發劑量小、性質穩定、使用方便的植物生長調節劑已成為該領域的發展趨勢，而無毒、無副作用且不影響植物正常代謝途徑和方式的高效安全產品是植物生長調節劑研究的重點難點。

發明內容
本發明的目的是提供一種含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為新型植物生長調節劑的應用。本發明是一種無毒、無副作用且不影響植物正常代謝途徑和方式的高效安全的植物生長調節劑。完成上述發明任務的方案是一種含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為新型植物生長調節劑的應用。本發明所述作為植物生長調節劑的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物，為葉綠素類金屬螯合物，包含葉綠素金屬螯合物、葉綠酸金屬螯合物及由葉綠酸(混合物)分離所得單體成分的金屬螯合物。這些金屬螯合物中，優選葉綠酸金屬螯合物。本發明所述的葉綠素金屬螯合物，皆具有優良的植物生長調節活性。本發明所述的葉綠素金屬螯合物，可以常規方法以葉綠素、或葉綠酸、或脫鎂葉綠酸、或經葉綠酸組分中分離所得的單體成分為配體與過渡金屬鹽製備而得。本發明所述的葉綠素金屬螯合物，根據配體的來源，所製備的金屬螯合物即可是混合物，也可是單體化合物。混合物類型金屬螯合物包括葉綠素和葉綠酸為配體製備的金屬螯合物；單體類型金屬螯合物包括經葉綠酸組分中分離所得的單體成分為配體製備的金屬螯合物。本發明優選價廉易得的混合物類型金屬螯合物。本發明所述的葉綠素金屬螯合物，所用的葉綠素是以天然植物為原料提取的具有脫鎂葉綠素母環(phorbin)結構的綠色色素。本發明所述的葉綠酸金屬螯合物，所用的葉綠酸為葉綠素經水解得到的多種二氫卟吩類成分的混合物。本發明所述的單體類型葉綠酸金屬螯合物，所用的單體葉綠酸成分包括二氫卟吩_e4、二氫卟吩_e6和脫鎂葉綠酸a單甲酯。本發明所述的含有葉綠素金屬衍生物的植物生長調節劑，使用的金屬離子包括 氧化態二價或三價的過渡金屬錳、鐵、銅、鋅離子，優選三價錳離子和鐵離子。過渡金屬離子與葉綠素或葉綠酸或葉綠酸的單體成分生成摩爾比11或12的螯合物。本發明所述的含有葉綠素金屬衍生物的植物生長調節劑，是配製成0. OOlppm IOOppm的葉綠素金屬衍生物的溶液使用。根據使用濃度的具體要求，可以直接加水配製； 所需濃度較高或不易溶解的溶液，可以少量鹼溶解樣品或先以少量乙醇溶解，然後加水稀釋配製而成。發明技術的說明本發明體外試驗意外發現，所使用的新型植物生長調節劑(濃度1. Oppm IOOppm)可顯著抑制葉綠素酶對葉綠素的降解(底物濃度324ppm，0. 36mmol/L)，其IC5tl範圍13. 84 85. 46ppm，且抑制率依樣品濃度的升高而遞增，具有典型的競爭型抑制特點； 而對比試驗發現血卟啉(Hemin，氯化血紅素，氯化卟啉鐵，鐵卟啉)溶液對葉綠素酶降解葉綠素無影響，類似結構的血卟啉分子無體外葉綠素酶抑制活性。綠豆苗期葉綠素酶抑制實驗證明，0. Ippm濃度的本發明所用新型植物生長調節劑溶液對綠豆葉片的葉綠素酶活性具有明顯抑制作用，系列化合物的葉綠素酶抑制率達 4. 25% 24. 44%。植物生理試驗證明，本發明使用的新型植物生長調節劑不僅能夠降低葉綠素酶活力、提高植物葉綠素含量，還能誘導鹽脅迫下植物葉片S0D、CAT和POD活力的上升，同時促進抗氧化物質脯氨酸的含量升高，從而減輕鹽脅迫下植物葉片的氧化損傷，增強作物抗逆性。栽培及大田試驗表明，0. OOlppm 10. Oppm溶液可用於浸種、扦插或作物田間灌溉；0. Ippm 10. Oppm溶液用於噴灑；2. Oppm IOOppm溶液用於樹幹注射，以促進種子萌發、提高發芽率、增加根長根數、促進不定根生長，加快幼苗生長、增強抗逆性、提高葉綠素含量、增加產量，延緩樹葉草坪退黃落葉時間，改善花木觀賞效果。本發明使用的新型植物生長調節劑溶液試驗表明，配製的溶液在使用濃度下pH 範圍5. 0 7. 0，溶液性質較穩定，溶液配製避光條件下2小時後仍達90%以上含量，能夠發揮植物生長調節劑的作用效果，並方便攜帶運輸和使用，產品實用性強。相同條件下(避光)濃度相近的血卟啉對照溶液2小時後含量降低過半，實際濃度不足初始濃度的50%。本發明使用的新型植物生長調節劑以現有製備技術生產，技術路線多樣方法簡單工藝成熟，且原料來源豐富，成本低廉，即可以天然綠色植物葉片提取的葉綠素為原料製備，也可以市場購得的葉綠酸類產品如葉綠酸鎂鈉鹽(或稱葉綠素鎂鈉鹽)、葉綠酸銅鈉鹽(或稱葉綠素銅鈉鹽)、葉綠酸鐵鈉鹽(或稱葉綠素鐵鈉鹽)或脫鎂葉綠酸為原料製備，其葉綠酸類單體金屬螯合物的製備即可由混合物類型金屬螯合物產品分離獲得，也可以單體配體與金屬鹽反應製得。本發明的優點1、安全無毒，本發明使用的新型植物生長調節劑來源天然，無人畜毒性，更不包含植物無法代謝的其他有害成分，且劑量低用量少，不易積累殘留，因此安全性好。2、活性強、效果好，且作用性能較廣泛，如能夠提高植物葉綠素含量、促進生根、提高種子發芽率、增強作物抗逆性、增加作物產量等。
3、綠色環保，在保證產量前提下使用中可適量減少化肥用量，有效降低化學品的各種危害。4、方便使用，適合於農林業的多種普通使用方法，如浸種(浸泡)、灌溉、葉面噴灑、注射等。劑量濃度要求較寬泛，正負接近10倍以上濃度偏差使用也不致引起明顯減產等不良效果。5、價廉易得性質穩定，產品容易製備生產，原料來源廣泛成本低廉，產品性質穩定使用方便，生產質量可控可靠，易於推廣應用。
具體實施例方式實施例1 葉綠素酶抑制活性(體外試驗)準確稱取由新鮮綠豆葉製成的丙酮粉 1. OOg,以25mL磷酸緩衝液(pH 7. 0 7. 5)抽提4. 5h後4°C離心lOmin，取上清液即為葉綠素酶液，活性酶濃度0. 14mmol/L，底物葉綠素濃度130ppm。測定0. 4ppm 25. Oppm各濃度葉綠酸金屬衍生物樣品溶液的葉綠素酶抑制率(甘志軍，王曉雲，鄒琦.小麥葉綠素酶生化動力學特性研究.西北植物學報，2003，23 (5) :750 754.)，並計算IC5tl值，系列樣品 IC50結果見下表系列樣品的葉綠素酶抑制活性IC5c;
權利要求
1.一種含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用。
2.根據權利要求1所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物選自葉綠素金屬螯合物、葉綠酸金屬螯合物及由葉綠酸混合物分離所得單體成分的金屬螯合物。
3.根據權利要求1所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的葉綠素是以天然植物為原料提取的具有脫鎂葉綠素母環結構的綠色色素。
4.根據權利要求2所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物為葉綠酸金屬螯合物。
5.根據權利要求4所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的葉綠酸為葉綠素經水解得到的多種二氫卟吩類成分的混合物。
6.根據權利要求1所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的單體類型葉綠酸金屬螯合物中，單體葉綠酸成分選自二氫卟吩_e4、二氫卟吩_e6或脫鎂葉綠酸a單甲酯。
7.根據權利要求1所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的金屬衍生物中的金屬離子包括氧化態二價或三價的過渡金屬錳、鐵、銅或鋅離子。
8.根據權利要求7所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的氧化態二價或三價的過渡金屬錳、鐵離子，選自三價錳離子和鐵離子。
9.根據權利要求7或8所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，所述的過渡金屬離子與葉綠素或葉綠酸或葉綠酸的單體成分生成摩爾比1:1或1:2的螯合物。
10.權利要求廣9之一所述的含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用，其特徵在於，該植物生長調節劑是配製成0.001 ppm IOOppm的溶液使用。
全文摘要
含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物作為植物生長調節劑的應用。含有葉綠素及其水解產物的金屬衍生物選自葉綠素金屬螯合物、葉綠酸金屬螯合物及由葉綠酸混合物分離所得單體的金屬螯合物。葉綠素是以天然植物原料提取的具有脫鎂葉綠素母環結構的綠色色素。葉綠酸為葉綠素經水解得到的多種二氫卟吩類成分的混合物。單體類型葉綠酸成分選自二氫卟吩-e4、二氫卟吩-e6或脫鎂葉綠酸a單甲酯。金屬離子包括氧化態二價或三價的過渡金屬錳、鐵、銅或鋅離子。本發明的植物生長調節劑安全無毒，低殘留，活性強、效果好，能夠提高植物葉綠素含量、促進生根、提高種子發芽率、增強抗逆性、增加產量。產品性質穩定，質量可控可靠，易於推廣應用。
文檔編號A01P21/00GK102273467SQ20111017643
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者任勇, 張列峰, 王一凡, 王樂天, 童敏, 蔣慧, 金佳敏, 陳黎明 申請人:南京師範大學, 南京百特生物工程有限公司