微生物發酵正烷烴生產長鏈α.ω-二羧酸的方法

2023-04-23 23:57:36 1

專利名稱：微生物發酵正烷烴生產長鏈α.ω-二羧酸的方法
技術領域：
本發明是關於微生物發酵從正烷烴生產長鏈α.ω-二羧酸，特別是從正十七烷發酵生產十七碳二羧酸的方法。
十七碳二羧酸是人工合成名貴香料靈貓的重要原料。由於用化學方法生產十二碳以上的長鏈二羧酸比較困難，因此採用微生物發酵生產長鏈二羧酸已成為人們的研究課題。眾所周知，隨著碳原子數的增加，長鏈正烷烴以及與其對應的二羧酸的溶解度會越來越小。在利用微生物發酵的方法中，由於作為底物的正十七烷和產物十七碳二羧酸在水中溶解度更小，因此比生產十二-十五碳的長鏈二羧酸難度更大。一般來講微生物最容易氧化十六碳以上的正烷烴和二羧酸，因而要積累十六碳以上的二羧酸，提高其產量仍是有待於解決的難題。
在USP4339536和USP4624920中都公開了利用微生物發酵生產長鏈二羧酸的方法，其中前者是用熱帶假絲酵母同化直鏈烴生產長鏈二羧酸。從實例中可以看出，用該法生產的最高碳數的長鏈二羧酸為十三碳二羧酸，產量達45克/升。後者則是用Mycobacteriumsp.KSM-B-33從6-22碳正烷烴、脂肪酸及其衍生物在40-50℃較高溫以及通氣條件下，在有氮源和碳源的培養介質中發酵製備6-22碳二羧酸的方法。在其實例中只提供了在50毫升或500毫升搖動試管中，用異丙基十六酸、甲基十六酸、正十六烷等作為碳源制10-16碳二羧酸的方法，其中十四碳二羧酸的最高產量為16毫克/升培養液，十六碳二羧酸的產量僅為3毫克/升培養液。
日本植村南海男用一株熱帶假絲酵母突變株M2030從各種單一烷烴生產相應鏈長的二羧酸，其中從正十七烷發酵生產十七碳二羧酸，在3升發酵罐上產量為70克/升，正十七烷投入量為30%(V/V)，正十七烷轉化率不上海沈永強等人用熱帶假絲酵母N-15高濃度的靜止細胞(菌濃15×10°/毫升)轉化正十七烷成十七碳二羧酸時，達到101克/升，轉化率63.1%(《植物生理學報》1980，Vol.6，No.1)。另外中科院微生物所曾用熱帶假絲酵母突變株U3-21以生長細胞和靜止細胞從10-18碳各種正烷烴發酵和轉化生成10-18碳二羧酸，其中十七碳二羧酸的產量分別為41.8克/升和52.5克/升。從以上已有技術可以看出，微生物發酵生成長鏈二羧酸特別是十七碳二羧酸的產量有待於進一步提高，才能適應工業化生產的需要。在本發明之前曾提交的申請號為87105445的，申請中提供了能夠高產十六碳α.ω-二羧酸的發酵菌株和發酵方法，本發明的目的是提供更適於工業化生產的一種兩端氧化長鏈正烷烴特別是正十七烷能力強而β-氧化能力弱的新的熱帶假絲酵母突變菌株和相應的發酵方法從而進一步提高了十七碳二羧酸的產量。
本發明所用的菌株為熱帶假絲酵母突變株(CandidatropicalismutantNP-260)，是以一株兩端氧化正烷烴生成長鏈二羧酸能力較強的熱帶假絲酵母(參見《微生物學報》20(1)88-93，1980)為出發菌株，通過亞硝酸鈉和紫外線的多次誘變獲得的。本發明所用的菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCNo.0139。
本發明的種子培養基有(1)10個巴林的麥芽汁加2%瓊脂製成的固體斜面;(2)烷烴種子培養基包含KH2PO46-10克/升，玉米漿2-4克/升，蔗糖2-5克/升，酵母膏3-6克/升，尿素2-5克/升，重蠟40-60毫升/升，自來水配製，PH值5左右。
培養種子的過程為取一接種環NP-260酵母菌體，塗布在麥芽汁固體斜面上(15×180試管，每支裝液量6-7毫升，放成斜面)於28-30℃培養40小時。取一支上述培養好的NP-260菌種全部刮入30ml/250ml三角瓶的烷烴種子培養基中，於28-30℃在220轉/分的旋轉搖床上培養36-44小時，作為一級種子，再把培養好的一級種子20-25毫升接入300ml/3000ml三角瓶或500ml/5000ml三角瓶的烷烴種子培養基中，在28-30℃180轉/分旋轉搖床上培養2天，作為發酵罐的發酵種子。
用本發明的突變菌株熱帶假絲酵母NP-260生產長鏈α.ω-二羧酸，特別是十七碳二羧酸的具體方法是把發酵種子接入PH5.0-8.5最好為7.0-7.6的含有10-40%(V/V)12-20個碳原子的正烷烴和90-60%(V/V)發酵培養基的混合液中。發酵培養基的組成為鹼金屬磷酸鹽5-14克/升，最好為6-10克/升，氯化鈉0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，最好為0.8-1.3克/升，酵母膏0.5-4克/升，最好為2-3克/升，玉米漿0.5-2克/升，丙烯酸0.2-3毫升/升，最好為0.5-2毫升/升，維生素10-100毫克/升，最好為30-60毫克/升，以及其它一些公知的營養源。將上述混合物在24-32℃，更適宜的溫度為28-30℃下維持48-170小時，然後將產生的α.ω-二羧酸進行分離提純。在發酵開始時混合液中正烷烴的含量為10-20%(V/V)，然後在適當時間補加正烷烴，以發酵液的正烷烴濃度始終≥5%(V/V)為準。鹼金屬磷酸鹽可從KH2PO4NaH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4之中選擇一種。維生素可以選用維生素A或B。
發酵結束後，將發酵液加熱至85℃左右，加入NaOH調節PH值至10左右，趁熱除去菌體。清液放置冷卻後析出大量十七碳二羧酸鈉鹽結晶，傾出結晶母液(在16-18℃，十七碳二羧酸含量在1%左右)。鈉鹽結晶用少量自來水清洗，抽乾。結晶母液減壓濃縮後用同法處理收集十七碳二羧酸鈉鹽，將以上所得鈉鹽溶於沸水中，調節PH值為10-12進行脫色，抽濾;濾液加水稀釋後加熱至90-100℃，加入硫酸酸化，PH值為2-3，靜置冷卻結晶過夜，然後抽濾水洗，烘乾，得到白色片狀十七碳二羧酸結晶。
用本發明的熱帶假絲酵母突變株NP-260和發酵方法，可得到產量較高的12-20碳α.ω-二羧酸，特別是十七碳α.ω-二羧酸。用本方法發酵6天，十七碳二羧酸產量最高可達133克/升，轉化率60%以上。
實例一(1)取一接種環的NP-260，塗布在15×180大試管麥芽汁固體斜面上，在28℃培養2天;
(2)取上述菌種一支，接入裝有30毫升烷烴種子培養基的250毫升三角瓶中於28-30℃在220轉/分的旋轉搖床上培養40小時。烷烴種子培養基中KH2PO48克/升，酵母膏5克/升，玉米漿3克/升，蔗糖3克/升，尿素3克/升，重蠟50毫升/升，自來水配製，PH值5.0。
(3)在裝有15毫升發酵培養基的500毫升三角瓶中，接入4毫升上述種子液，在200轉/分旋轉搖床上發酵4天，每24小時用氫氧化鈉調一次PH值至7.5-8.0。發酵培養基含NaH2PO410克/升，酵母膏1.5克/升，玉米漿1克/升，氯化鈉1克/升，尿素1克/升，正十七烷150毫升/升，自來水配製，調節PH值為7.2。在110℃下滅菌30分鐘。發酵結束後，用鹽酸調節PH值至2-3，用100毫升乙醚提取後蒸去乙醚，得到十七碳二羧酸白色結晶。用標準氫氧化鈉溶液滴定，計算出發酵液中十七碳二羧酸含量為83.3克/升。
實例二種子培養基成分和培養方法同實例1。發酵培養基中KH2PO48克/升，氯化鈉1克/升，酵母膏2克/升，玉米漿1克/升，尿素1克/升，正十七烷200毫升/升。接入4毫升種子液，發酵4天。每24小時調一次PH值為7.5-8.0。發酵結束，用鹽酸調節PH值至3，用100毫升乙醚提取然後蒸去乙醚得到十七碳二羧酸白色結晶。用標準氫氧化鈉溶液滴定，計算出發酵液中十七碳二羧酸含量為87.7克/升。
實例三(1)取一接種環NP-260菌體，塗布在15×180的大試管麥芽汁固體斜面上，共6支，28℃培養2天;(2)把上述培養2天的一支大斜面菌種接入裝有30毫升麥芽汁培養基的250毫升三角瓶中，共6瓶，在28℃下220轉/分的旋轉搖床上培養2天;(3)把(2)中培養的麥芽汁種液1瓶接入裝有210毫升烷烴種子培養基的3000毫升三角瓶中，(種子培養基成分KH2PO46克/升，酵母膏3克/升，玉米漿3克/升，蔗糖3克/升，重蠟50克/升，尿素3克/升)，共6瓶在28℃，180轉/分的旋轉搖床上培養40小時左右;(4)把(3)中培養的種液接入一個裝有8升發酵培養基的16立升自動控制罐中，其中含有KH2PO464克，氯化鈉8克，酵母膏16克，玉米漿8克，丙烯酸8毫升，維生素B12150毫克，尿素8克，消泡劑8克，溶於5升自來水中，用氫氧化鈉調節PH值至7.5，以及1.2升正十七烷，在121℃滅菌30分鐘後，29-30℃時接種;(5)接種後，在30℃攪拌速度500-700轉/分，通氣量1∶1-1∶1.5，罐壓10-15磅/釐米2的條件下發酵140小時，其中在第三、四、五天各補加入400毫升正十七烷。發酵24小時後用氫氧化鈉調PH值至7.6。從48小時起，PH值自動控制在7.5直至發酵結束。(6)發酵結束後加入12升水加熱，升溫至80℃，加入氫氧化鈉調節PH值至12以後，離心分出殘餘正十七烷和菌體，清液濃縮，冷卻結晶，過濾，收集十七碳二羧酸的鈉鹽結晶，然後精製得到白色十七碳二羧酸的鈉鹽結晶。測得十七碳二羧酸為133克/升，轉化率61.8%，精製總收率77.6%。
用氣相色譜法對十七碳二羧酸進行定性分析(儀器型號日本島津GC7A)，如

圖1，表1、圖2所示。圖1中1-6分別為已知十一-十六碳二羧酸的峰，根據該譜圖作出表1以及表示碳數規律的圖2，由此可判斷圖1中7為十七碳二羧酸。圖3為十七碳二羧酸純度分析色譜圖(儀器型號同上)，測得其純度為95.4%。
表1注死時間Vo是0.30分
權利要求
1.一種利用微生物發酵生產長鏈α.ω-二羧酸的方法，包括菌種篩選，種子液的培養，發酵轉化，產物分離提純等步驟，其特徵在於(1)把用熱帶假絲酵母突變株NP-260(CandidatropicalismutantNP-260CGMCCNO.0139)培養成的種子液接入PH值為5.0-8.5含有10-40%(V/V)12-20個碳原子的正烷烴和90-60%(V/V)發酵培養基的混合液中。發酵培養基的組成為鹼金屬磷酸鹽5-14克/升，氯化鈉0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，酵母膏0.5-4克/升，玉米漿0.5-2克/升，丙烯酸0.2-3毫升/升，維生素10-100毫克/升。(2)上述混合物在24-32℃下維持48-170小時。(3)將產生的α.ω-二羧酸進行分離提純。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於開始發酵時混合液中正烷烴的含量為10-20%(V/V)，然後在發酵過程中補加正烷烴，使發酵液的正烷烴濃度始終≥5%(V/V)。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於發酵培養基的組成中鹼金屬磷酸鹽6-10克/升，尿素0.8-1.3克/升，酵母膏2-3克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，維生素30-60毫克/升。
4.根據權利要求1，2的方法，其特徵在於所說的正烷烴含有15-17個碳原子。
5.根據權利要求1，2的方法，其特徵在於正烷烴含有17個碳原子。
6.根據權利要求1，3所述的方法，其中鹼金屬磷酸鹽是KH2PO4或NaH2PO4或K2HPO4或Na2HPO4。
7.根據權利要求1，3所述的方法，其中的維生素最好是維生素A或維生素B。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是發酵的溫度控制在28-30℃，發酵液的PH值控制在7.0-7.6。
全文摘要
一種利用微生物發酵正烷烴生產長鏈α·ω-二羧酸的方法，特別是高產十七碳二羧酸的方法。把一株熱帶假絲酵母的突變株NP-260培養成的種子液接入pH值5.0-8.5的含有10-40％(V/V)12-20個碳原子的正烷烴和90-60％(V/V)發酵培養基的混合液中。發酵培養基的組成為鹼金屬磷酸鹽5-14克/升，氯化鈉0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，酵母膏0.5-4克/升，玉米漿0.5-2克/升，丙烯酸0.2-3毫升/升，維生素10-100毫克/升。上述混合物在24-32℃下維持48-170小時，然後將產生的α·ω-二羧酸進行分離提純。
文檔編號C12P7/44GK1046757SQ89102548
公開日1990年11月7日 申請日期1989年4月27日 優先權日1989年4月27日
發明者陳遠童, 龐月川 申請人:中國石油化工總公司, 中國科學院微生物研究所