測定方法和裝置的製作方法

2023-04-23 19:52:41 2

專利名稱：測定方法和裝置的製作方法
測定方法和裝置本發明涉及用於檢測分析物存在的方法和裝置。更特別地，本發明涉及用於檢測針對多態性同種抗原(如HLA抗原)和/或主要組織相容性複合體(MHC)的其他產物的免疫球蛋白的存在的方法和裝置。移植和/或輸血程序常常需要篩選受試者是否存在可能結合存在於捐贈者組織或血液上的捐贈者抗原的抗體；這些捐贈者抗原的實例是HLA抗原。本領域已知的用於HLA測試的方法包括補體依賴性淋巴細胞毒性(⑶C)測試，其中用捐贈者的淋巴細胞培養接受者的血清，接著與補體一起培養。然後通過用眼睛分辨死細胞和活細胞來估算細胞毒性的水平。這種方法是勞動密集性的，需要活細胞，可能是非特異性的，並且需要主觀評價。免疫測定，例如，利用免疫系統的機制，其中應答致病的或生物體外來的抗原的存在而產生抗體。這些抗體和抗原，即免疫反應物，能夠彼此結合，因此引起高特異性的反應機制，這可以用來確定生物樣品中的特定抗原的存在或濃度。已經描述了用於檢測抗-HLA抗體的酶聯免疫吸附測定(ELISA) (Zaer等， Transplantation 63 :48-51(1997)；美國專利 6046013&美國專利 5482841),藉此將從集合的血小板或類淋巴母細胞細胞系純化的I類HLA分子固定於測定板的孔中並可以用於檢測抗-HLA抗體，由此該系統的讀出是測試板孔中的光密度變化。Barnardo等 (Transplantation，2000年8月15日；70 (3) :531-6)證實了單個重組HLA，而不是來自集合的細胞或血小板的抗原，可以用於檢測HLA抗原的ELISA形式中。最近，Jar-How在美國專利5948627中教導了 HLA抗原可以附著於微珠上並且可以利用流式細胞計數器，Luminex平臺或用於檢測結合的抗HLA抗體的相似的裝置在流體 ELISA測定中進行檢測。這些抗體檢測方法緩慢並且需要昂貴的專用實驗室設備，如光密度平板閱讀器或流式細胞計數裝置。缺乏快速的重點照護檢驗意味著用於同種抗體篩選的所有樣品必須進行貯存並分批檢驗，導致用於移植的不穩定的病房用血液、血液製品和器官的使用延遲。側向流動測試或免疫色譜測定已經存在有些時間了。它們是膠乳凝聚測試中所用技術的合理延伸，膠乳凝聚測試首先是由Singer和Plotz在1956年研發的。側向流動測試的益處包括快速測試(通常少於10分鐘)、易於使用(通常就在樣品中蘸一下)、長期穩定性，這使其適於全世界使用。在它們最簡單的形式中，側向流動測試是吸水試紙條，其中樣品通過由吸水試紙條一端的吸收墊產生的毛細管作用沿著試紙條流動。隨著樣品穿過試紙條，其遇到了有色試劑，通常是已經結合了特異性結合成員(通常是蛋白質或抗體)的微粒。塗覆的微粒與樣品混合併結合其配體。珠子-分析物複合體通過試紙條，遇到已經預先用抗體或抗原處理過的線條或區域。根據樣品中存在的分析物，有色試劑結合在測試線或區域中。側向流動測試可以與競爭性測定或夾層測定那樣來進行。通常描述兩種類型的色譜免疫測定。在一種類型中，檢測人流體(尿液、血液、血漿、血清和唾液)中含有的蛋白質或小分子分析物。 分析物包括hCG、FSH、LH、CKMB, TSH、肌鈣蛋白、肌肉球蛋白、癌蛋白、病毒/細菌蛋白、半抗原、治療藥物和濫用藥物。在其他色譜免疫測定中，待檢測的分析物是與以下如病毒/細菌蛋白(HIV、A肝和C肝、幽門螺桿菌、EBV、Rubella、CMV、HSV、登革熱、Lyme、Chagas, TB、弓形蟲、自身免疫抗原等)或過敏原(花粉、黴菌、粉塵/蟎類、食物、動物上皮細胞等)等物質特異性反應的人抗體。為了在側向流動測試中檢測抗體，可以使用各種形式；兩種常用的方法是競爭性的或非競爭性的。競爭性的形式依賴於通過標記的競爭性試劑阻止待測試的分析物在試紙條上的測試區結合；用於分析物的陰性測試是由標記的競爭性試劑在測試區引起的顏色變化而產生的。在競爭性測試中，沿著測試區進一步檢測到無關標記，表明測定已經進行了工作。在競爭性測定中，測試區可以包含抗原或抗體；如果使用抗原，則競爭性標記的試劑是抗-抗原，其與測試抗體在測試區競爭結合。如果在競爭性測定的測試區使用了抗體，則競爭性試劑是標記的抗原，允許該抗原結合測試樣品中的配體並且因此阻止其在測試區的結合。由於以下情況陰性視覺結果實際上是測試的陽性結果並且因此看上去是違反直覺的， 尤其是對於外行，因此競爭性測定沒有非競爭性測定那麼普遍。在非競爭性測定中，陽性測試區是用於分析物的陽性測試在這些非競爭性測試中，測試區可以是分析物或分析物的抗體。如果測試區是分析物(抗原)，則可移動的標記試劑通常是抗-免疫球蛋白。在該測試中，移動相中的抗-免疫球蛋白將樣品中的所有免疫球蛋白進行標記，標記的免疫球蛋白通過試紙條，並且如果存在抗原的抗體，則在測試區被捕獲，導致測試區的顏色變化。如果在測試區使用抗-免疫球蛋白，則標記的移動相為測試分析物，其結合樣品中的抗體，通過試紙條並且被測試區的抗-免疫球蛋白捕獲。側向流動測定是實驗室測試有用的產物，因為它們是潛在快速的並且經濟的測定臨床分析物存在的方法。然而，現有的裝置存在它們的問題，並且現有的設計並不適用於所有分析物。為了改進側向流動測定裝置，已經描述了改進的一步測定裝置和方法。例如，May 等的美國專利 5，602，040，5，622，871，5，656，503，6，187，598 和 6，228，660 描述了有助於一步側向流動測定方法的裝置、試劑盒和方法。提供了一種測試試紙條，上面含有乾燥的標記試劑，其通過液體生物樣品釋放成可移動形式。標記的試劑特異性地結合待檢測的分析物， 形成複合體，並且液體樣品沿著側向流動基質的移動通過毛細管作用將複合體傳送至檢測區。無關的血液成分可能引起側向流動測定中的幹擾。I^dhia等在專利 TO/2007/063423中公開了用於檢測IgE的兩步法，由此裝置的外殼含有用於除去全血成分 (如，細胞材料)的濾器，這使得可以在全血中使用該裝置。更具體地，側向流動測試中的問題是樣品中大量的IgG，這可能干擾其他類別(如 IgE)的檢測。為了解決這一問題，Hubscher等在美國專利6，528，325中公開了一種更特異性的用於檢測人血清中的IgE抗體的裝置和方法，其中使用了有助於一步技術的側向流動測定。獲自體液的測試樣品與金標記的抗原反應，並且所得到的複合體穿過膜並沿著側向流動試紙條移動。沿著測試試紙條的特定位置中形成的有色線條表示測試樣本中類別特異性抗體的存在。在Hubscher等公開的更具體的實施方案中，側向流動測定具有加入樣品墊的IgG反應蛋白(例如，蛋白A或IgG的抗體)，以與樣品中所含的IgG複合，使得IgG複合體的分子量高於1. 0百萬。這個大的複合體明顯比IgA、IgM和IgE的移動慢，由此使這些抗體在IgG之前反應。因此，這個發明對於IgG的檢測不再工作，因為IgG的移動性被阻礙，導致未結合的IgG阻斷了特異性結合的IgG的捕獲。因此，對檢測同種抗原的抗體的改進方法，包括快速、方便且精確的用於測定抗體的方法存在著需求。本發明的目的是克服或減輕一個或多個與現有技術相關的問題。沒有一篇現有技術教導或公開了適用於多態性抗原(如，MHC或HLA抗原)的抗體或血小板糖蛋白的快速且靈敏的測試的快速而有效的側向流動方法。根據本發明的第一個方面，提供了一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的流通測定裝置，該裝置包括與結合墊(conjugate pad)和芯吸墊(wicking pad)液體連通的多孔膜，所述結合墊具有用於檢測特定分析物的檢測部件，所述多孔膜具有檢測區，其中固定了第一種捕獲試劑，該捕獲試劑被構造成結合在分析物和分析物-結合物複合體的至少一部分，以產生檢測信號。本發明提供了一種改進的用於檢測抗體的快速方法，其使得使用者可以快速地評價生物樣品中抗體(例如，HLA抗原的抗體)的存在或不存在，並且在其他實施方案中，還可以測定抗體的特異性。測試可以是臨床重點照護檢驗(POC)測試，和/或基於手指戳刺的基於家庭的POC測試，由此患者可以在家裡檢查抗體狀況。該測試包括將來自受試者的生物流體加入側向流動裝置中含有相關抗體的生物流體沿著裝置流動並且接觸結合了有色的、螢光和/或金微粒的抗原配體。分析物結合的抗體的檢測發生在測試線上，由此固定相同或相似的抗原通過抗體結合兩個位置(珠子和試紙條)的抗原來固定抗體-抗原-顆粒聚集物，並且通過有色珠子的視覺存在來表示陽性測試。在本申請中，應當清楚使用HLA 抗原只是舉例說明，並且是多態性同種抗原系列的優選實施方案，並且本發明包括用於檢測任何同種抗原的任何同種抗體的側向流動測試。優選地，對照區位於多孔膜上的檢測區的下遊並且具有固定在對照區內的第二種捕獲試劑。在一個實施方案中，結合墊位於檢測區的上遊，並且具有檢測探針，該檢測探針具有用於分析物的特異性結合膜。檢測部件優選包括視覺標記物，如有色的顆粒和/或直接連接的發色團和/或螢光團，用於結合併標識/標記配體，使得可以檢測分析物。結合墊含有發出分析物存在信號的檢測部件。結合墊還可以包括其他不同的檢測部件群，包括用於在對照區顯示的部件。檢測部件可以是納米顆粒，例如，直徑5-150nm的納米顆粒，更特別地，部件具有20至60nm的直徑，以促進標記物-分析物結合物的移動。合適的檢測部件包括由金屬膠體(如銀和金膠體)、螢光顆粒、碳、聚苯乙烯和染色的膠乳顆粒製得的那些。在一個實施方案中，將含有分析物的樣品沉積在結合墊上，與檢測部件相互作用， 並且朝向用於檢測的檢測區移動。術語「上遊」和「下遊」指的是相對於樣品從測定裝置上的沉積點的流動方向的物
品位置。術語「分析物」通常指的是待檢測的物質。例如，分析物可以包括多態性抗原，如MHC或HLA抗體或血小板糖蛋白、半抗原、抗體，及其組合。分析物包括但不限於毒素、有機化合物、蛋白質、肽、微生物、胺基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物、藥物中間體或副產物、細菌、病毒粒子和上述任何物質的代謝產物或針對上述任何物質的抗原或免疫球蛋白。術語「測試樣品」通常指的是懷疑含有分析物的材料。術語「液體連通」指的是液體及其內含物(包括分析物等)能夠從一個區域移動至另一個區域的能力。例如，測試樣品可以包括從來源直接獲得的材料，以及使用技術預先處理的材料， 這些技術如但不限於過濾、沉澱、稀釋、裂解、蒸餾、混合、濃縮、滅活幹擾成分、添加試劑等。 測試樣品可以源自生物來源，如生理流體，包括血液、間質液、唾液、眼睛分泌物、腦脊髓液、 汗液、尿液、乳汁、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、陰道分泌物、月經、精液、糞便、羊水等。芯吸墊優選與膜液體連通，並且由於墊子的毛細管作用給液體移動提供驅動力。因此，本發明提供了一種檢測涉及移植和血液製品灌輸的多態性抗原的臨床相關抗體的測試裝置。受過訓練的技師或未受過訓練的人員可以容易地使用測試裝置，並且優選只需要將樣品施加至樣品墊上(例如，來自手指戳刺的血液或血樣或血清樣品)，並且此後在觀察到分析結果之前，使用者只需要很少或不再需要動作。理想地，應當快速地觀察到分析結果，在十分鐘或更短時間內。本發明涉及用於檢測移植或灌輸同種抗原的抗體的快速實驗室和重點照護檢驗方法。同種抗原是物種中以可替換(等位基因)形式存在的抗原，因此包括將一種形式轉移至缺少這種形式的物種成員中時的免疫應答；這些的實例包括抗人白血球抗原(HLA)抗體以及針對人血小板抗原(HPA)的血型抗體和紅血球抗體。個體在懷孕過程中，或通過輸血或血小板灌輸或之前的器官移植，可能對同種抗原變得敏感。暴露於HLA同種抗原可以產生抗體應答，該應答可以是免疫球蛋白類別中的任何一種，但通常是IgG、IgM，或很少是 IgA。個體中同種抗原的檢測在許多臨床情況下是重要的，如灌輸和移植。測定對HLA等位基因的敏感性的測試與組織和器官移植相關，其中對抗捐贈者的HLA抗原的接受者抗體的存在預示著移植排斥的高風險。對移植後抗-HLA抗體的測試也可能是臨床相關的，因為抗-HLA抗體的出現或提高可能與移植排斥相關。檢測免疫球蛋白的IgG類別是最重要的，因為這個類別對於移植成功是危害最大的，並且因此大部分抗體檢測系統依賴於IgG 檢測。移植領域中的標準實踐是相對一組選定來代表人群的HLA抗原來測試所有潛在的接受者，並且測定相對其血清是反應性的HLA等位基因的百分比。該方法是漫長的並且成本高，在一些情況下，獲得非常快速的結果是重要的。如果樣品未具有HLA抗體，在常規測試中可能就浪費了時間和金錢，因此對快速且廉價的鑑定有害抗體存在的篩選測試存在著需求。此外，血液或血液製品(如全血)或血小板灌輸內多態性抗原(如HLA)的存在可能引起接受者灌輸相關的急性肺損傷(TRALI)，如果灌輸含有抗-HLA抗體；因此，本發明非常適合篩選和鑑定血液製品中的有害抗體。裝置可以是簡單的量杆，藉此將樣品墊插入血清樣品或血樣樣品中。或者，可以進一步包括外殼，在樣品墊上具有孔隙，使得可以添加樣品，並且在測試區具有窗口，用於觀察結果。或者，可以將多重測定結合單個血清或血液收集裝置，如通過多重分析物尿液分析裝置(如檢測濫用藥物的尿杯)所證明的。在這最後一個實施方案中，可以預期裝置將裝有1至50個測試試紙條，每個測試試紙條具有1至50個同種抗原區，允許一次測試高達2，500個單個同種抗原。裝置接收器可以接受一定體積的用於分析的試劑，並且同時使特定的量施加至每個單獨的測試中。在另一個實施方案中，可以將測試裝置整體地與血液製品收集袋一起使用，以產生血液製品的同種抗體狀態的視覺指示。根據本發明進一步的方面，提供了一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，該方法包括i)提供一種流通測定裝置，其包括與結合墊和芯吸墊液體連通的多孔膜，該多孔膜限定了 a)檢測區，其中固定了第一種抗體，該抗體被構造成結合在分析物和結合的檢測部件之間形成的複合體，以產生檢測信號；b)對照區，其中固定了第二種抗體，當其包含在對照區內時能夠產生對照信號；ii)使含有分析物的測試樣品接觸結合的檢測部件；和iii)檢測所述檢測信號。根據本發明進一步的方面，提供了用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的試劑套盒，其包括a)如上所述的裝置；b)洗滌緩衝液和/或追蹤緩衝液；和c)檢測部件。根據本發明進一步的方面，提供了用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，包括a)將含有分析物的樣品接觸檢測部件；b)通過洗滌除去未結合的檢測部件和/或其他材料；c)提供流通裝置，其具有檢測區和對照區，檢測區內固定了第一種抗體，該抗體被構造成結合在分析物和結合的檢測部件之間形成的複合體，以產生檢測信號，對照區內固定了第二種抗體，當其包含在對照區內時能夠提供對照信號；d)使含有分析物的測試樣品接觸結合的檢測部件；和e)檢測所述檢測信號。現在將參照附圖來描述本發明的特定實施方案，只是舉例說明，其中圖Ia和b是根據本發明的側向流動測定裝置的示意圖；圖加和b是圖Ia和b的側向流動測定裝置的示意圖；圖3顯示了根據本發明的量杆測試。圖4顯示了根據本發明的實施例16的兩級測定的結果；和圖5顯示了根據本發明的實施例17的兩級測定的結果。本發明的裝置10最低限度包括側向流動裝置或側向流動量杆，該裝置或量杆包括

圖1中所示的組成部分，即任選的血液分離墊12、芯吸墊14、結合墊16、含有固定的抗原 (測試分析物)和對照分析物的有背襯的測試試紙條18，20、22、M分成測試區和對照區以及安置在支持物觀上的吸收墊26。可以提供未封裝的測試試紙條，作為量杆測試，由此只需要將樣品墊浸入分析物中，或者；側向流動測試裝置可以包含在塑料外殼中，外殼使試紙條變得不明顯，就顯示樣品墊、測試區和對照區；在這個實施方案中，通過滴在暴露的樣品墊窗口上來施加樣品。或者，側向流動裝置中帶有多個對不同分析物特異性的側向流動量杆，並封裝在普通的容器中，使得可以對單個樣品同時進行多個測試。作為多態性系列的實例來使用HLA抗原，並且本發明涉及用於檢測任何同種抗體的側向流動測試。在第一個實施方案中(如圖2中所示的)，側向流動測試用於同時檢測和區分針對多態性I類HLA抗原的免疫球蛋白和另一個檢測區中的II類抗原。測試裝置由任選的血液濾膜、含有移動相標記試劑的結合墊、通常由尼龍或硝基纖維素製得的使施加的樣品移動至固定了配體的測試和對照區的有背襯的測試試紙條和吸收用過的樣品並促進沿著試紙條芯吸的吸收墊組成。第一個實施方案利用了移動相，其中測試珠子是結合從捐贈者集合通過親和性純化的I類HLA抗原的特定顏色的聚苯乙烯珠；將另一種有色珠子，不同於第一種珠子的顏色，結合Π類抗原。選擇捐贈者的集合，使得集合中代表了大部分常見的 HLA抗原。將相同集合的抗原以高濃度塗覆在獨立的位置上，形成兩條測試線；I類測試區和II類測試區。將測試珠沿著邊在結合墊上乾燥，對照珠群，優選利用第三種顏色的珠子， 覆蓋抗生物素蛋白鏈菌素。對照區由結合牛血清白蛋白(BSA)的生物素組成。在陽性測試中，將樣品施加至樣品墊上。使用血液分離濾器，如Vivid血漿分離膜(Pall Ltd)，使樣品是血液或血清或可能含有抗體的任何其他生物流體；含有抗體的組分穿過血漿分離膜進入結合墊中，由此免疫球蛋白遇到HLA抗原並與其結合。然後測試試紙條的芯吸作用牽引含有樣品的珠子、免疫球蛋白和對照珠沿著試紙條移動。隨著結合抗體的珠子遇到固定的抗原，珠子/免疫球蛋白複合體將變成固定的。該相是基於IgG和IgM免疫球蛋白對抗原各自具有兩個和十個化合價來工作的。因此，在IgG結合的情況下，IgG分子的一個部分結合移動相，而該分子的其他部分結合固定相。在陰性測試的情況下，沒有抗原覆蓋的珠子固定在測試區。然而，抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的珠子通過生物素配體固定在測試試紙條的遠端。利用此來顯示所有試劑已經正確地穿過測試區。在第一個實施方案中，測試鑑定了同種抗原集合的抗體的存在或不存在。在第二個實施方案中，單個或多個抗原的各種組合可以用於鑑定抗體的特異性。例如，通過重組生物學方法製得的單個抗原或從細胞膜分裂並通過親和性純化的單個抗原或單個捐贈者抗原(一個個體的抗原的綜合)可以施加於移動相、測試區或兩者中。在這個實施方案中， 將單個施加於固定區中，每個區一種同種抗原，而將相同的單個抗原，或相關抗原類別的集合，結合移動區中的珠子。因此，免疫球蛋白結合移動區中的抗原，並且被攜帶至測試區；陽性測試結果將表示單個抗原的特異性抗體的存在。可以使用多個測試區，每個測試區含有不同的單個抗原或多個抗原。同樣，在第三個實施方案中，肽片段可以用於鑑定表位。在第四個實施方案中，測試的獨特特徵，S卩，移動抗原和固定抗原之間夾入的樣品免疫球蛋白，使得可以在兩個位置使用兩種不同的抗原並且因此可以檢查交叉反應性的免疫學現象。在這個測試中，移動相將展示抗原，例如，A0101，多個固定的測試區將展示一個測試區(最遠端的測試區)中的相同抗原和其他測試區中的相關(交叉反應性)抗原，例如，測試區1、2&3可能各自含有A3601、Al 101和AO101。該測試的基礎是二價IgG分子的每個臂是相同的，但每個單獨的臂可以以不同的親和性或親合力結合不同同種抗原上的相似表位，本領域技術人員稱為交叉反應性。在該測試中，如果抗體於A0101和A3601是交叉反應性的，則二價抗體將珠子與測試區2和3中的抗原結合起來。如果抗體在A0101和AllOl之間是反應性的，則結果將在區域2和3顯示出陽性反應。這樣，可以詳細分析同種抗原的特異性，從其獲得的信息對於本領域技術人員監控患者在移植或灌輸情況下的抗體應答是有臨床價值的。因為第一個至第四個實施方案中的測試沒有區分免疫球蛋白類別(IgG、IgM等) 或同種型(IgGl、IgG2等)，因此可以使用第五個實施方案，由此可以使用另外的指示劑來顯示抗體存在的類別或同種型。在這個實施方案中，將標記的類別或同種型特異性的抗體， 例如，抗-IgG加入結合墊中，或此後加入追蹤緩衝液中，由此標記的抗體將特異性地識別測試區中存在的珠子-抗體-抗原複合體的類別或同種型。標記的抗體將需要具有不同於任何標記的抗原或對照的標記，使得可以通過視覺來區分。該標記可以是不同顏色的顆粒或直接標記的螢光標記物，如Cy3或Cy5，或是任何其他通過適當刺激可以視覺觀察到的螢光團。可以使用圖1中所示的組成部分來構建側向流動裝置。任選的血液分離層系統 (acts)是從全血中除去特定物質(特別是凝塊、纖維蛋白和細胞材料)的濾器，使含有抗體的級分(血漿)進入下一個相中(芯吸墊)。濾器通常由浸漬pyols的滲透性玻璃纖維構成，pyols使血液成分凝結，防止不溶性成分傳送，如美國專利5725774中所述的，典型實例使Vivid 血漿分離膜(Pall Ltd)。在不存在血液分離濾器的情況下，通常不推薦將側向流動裝置與全血一起使用。接下來的階段是樣品墊，其起作用將分析物轉移至含有結合物的墊子。結合墊通常由玻璃纖維構成，這使得配體-珠子結合物在上面乾燥，以這樣的方式使得移動分析物階段到達時，珠子不受玻璃纖維固體支持物的影響，並且分析物、配體-珠子和液體成分轉移至吸水性的測試試紙條上。測試試紙條用於將反應物和液體從結合墊區域轉移至遠端吸收墊，並使這些成分接觸試紙條上離散區域中分散的固定試劑(測試和對照區)。試紙條應當由任何可以使試劑以受控方式穿過試紙條的材料製得，受控方式可以使反應物接觸測試區和對照區。測試試紙條通常由多孔膜製得，多孔膜由丙烯酸共聚物、醋酸纖維素、硝基纖維素、尼龍、聚醚碸(PES)、聚丙烯、聚碸、聚四氟乙烯(PTFE)或聚偏二氟乙烯(PVDF)構成。通常將測試區和對照區噴霧並乾燥在Imm寬區域的膜上，對照區通常遠離測試區，以確保完全的測試。遠端吸收墊可以由任何吸收材料製得，其足以能夠吸收加入的總液體體積。裝配的試紙條可以和通常的側向流動測試那樣包含在塑料外殼內，或可以沒有外殼和「量杆」那樣使用，在這種情況下，將近端插入分析物流體中，並使其沿著量杆進行芯吸，以完成測試。參照圖3，提出以下實施例，以給本領域普通技術人員提供完整的怎樣形成和使用本發明的公開內容和描述，並且不是用來限制發明人所認為的發明的範圍，也不是用來表示以下的實驗就是所進行的全部的或僅有的實驗。已經進行了嘗試來確保關於所用數字的精確性，但應當說明一些實驗錯誤和偏差，除非另外指出。對於本發明的工作實施例，構建了三個不同的裝置。用於所有測試的測試膜來自 Sartorius ；UniSart CN140由硝酸纖維素多態性物構成(背面有層壓的不能滲透的襯底材料)，零件號碼1UN14ER050025 裝置1含有測試試紙條，測試試紙條含有由I類HLA抗原的集合組成的單個測試區，和由生物素組成的分開的遠端對照區；第二個裝置由II類HLA抗原的集合和分開的遠端對照區組成，該對照區由生物素組成；第三個裝置含有兩個測試區， 由此將I類和II類抗原施加於兩個不同的測試區中，遠端對照區為生物素。在每個情況下，作為親和性純化的人MHC抗原從GTI Inc (Waukesha, WI 53186 USA)購得HLA抗原，並且以0. 75mg/ml的濃度來施加I類和II類抗原結合，並且施加的速率使得測試裝置接受大約0. 5ul/裝置。在每種情況下，將來自儲液的蛋白質稀釋於含有5% (w/v)BSA和20% (w/ ν)蔗糖的0. OlM硼酸鹽緩衝液中。硼酸鹽緩衝液是混合的0. Sg氯化鈉，3. 81g Borax (焦硼酸鈉)和1升蒸餾水，調節至PH8. 5，並在使用前高壓滅菌。通過施加2mg/ml的BSA-生物素結合物來構建生物素對照區，速率為傳送大約0. 5ul/裝置。將測試配體和對照劃上條紋後,將膜風乾,然後通過施加來自 SurModics, Inc. (Eden Prairie, USA) ^ Stabilcoat 來阻斷。對於測試的移動相，將來自GTI Inc的相同I類和II類抗原集合結合Bangs Labs DC02B Dark Blue聚苯乙烯微球體，其具有-COOH活性基團和0. 43um的平均直徑。用於這的實驗方案如下1.將50ul珠子(10%濃縮物)與1450ul洗滌緩衝液混合。2.在 21000_21500g 離心 4 分鐘。3.洗滌珠子&重複離心兩次，並且重懸浮於洗滌緩衝液中。4.除去上清液並且重懸浮於125ul的洗滌緩衝液中(如果可能，對於該階段，使用 200ul吸液管-通過再一次的溫和洗滌作用)。5.在連續旋轉下，在35°C下培養兩小時。6.加入125ul阻斷緩衝液。7.邊旋轉邊培養30分鐘。8.按照之前的離心4分鐘。9.除去上清液並且重懸浮於750ul洗滌緩衝液中。10.洗滌珠子&重複離心兩次，並且重懸浮於洗滌緩衝液中，再次離心，除去上清液，並且重懸浮於250ul貯存緩衝液中。貯存在4°C。「洗滌緩衝液」是ph8. 5的硼酸鹽緩衝液。「阻斷緩衝液」是使用硼酸鹽緩衝液製備的，包含4% BSA w/v。「貯存緩衝液」還是基於硼酸鹽緩衝液，包含5% BSA和20%蔗糖w/v(+0. 01%疊氮化鈉作為防腐劑)。將固定相(剝離並阻斷的試紙條)裝配成量杆將玻璃纖維結合墊連接在近端，將吸收墊連接在遠端。將量杆貯存在環境溫度下，直至使用。實施例1至15顯示為量杆測試(參見圖幻，即，沒有將測試試紙條密封在標準塑料側向流動外殼中，然而，可以理解相似的方法和程序可以用於成品中，作為商品用於銷售。本領域技術人員將會理解側向流動製造中所用的試劑濃度，和所用的測試樣品的體積可以在任何臨床上成功的產品中有所不同。實施例1實施例1是用於比較目的的未經測試的側向流動量杆。對於圖3中顯示的實施例2-5，將Iul結合I類的測試珠子和0. 5ul 0. 32um抗生物素蛋白鏈菌素珠子CP01B/8891 (Bangs Labs)的1 %溶液施加於結合墊上。隨後，使用 Gilson移液管將40ul血清樣品(由牛津組織定型實驗室，牛津贈送，並且已知含有HLA抗體)施加於結合墊上。用含有ν/ν吐溫20的PBS緩衝液來「追蹤」樣品，通過將40ul追蹤緩衝液加入96-孔微量滴定平板的孔中，並將試紙條放入孔中，使得結合墊吸收追蹤緩衝液，這使得血清和珠子-結合物垂直沿著試紙條向上，穿過測試線和對照線，併到達吸收墊上。當出現對照線時，在10分鐘內完成測試。實施例2-4實施例2-4是未稀釋、1/10(在PBS中稀釋)和1/50稀釋測試的相同抗-B18血清樣品。所有樣品顯示出陽性I類測試線，強度隨著樣品稀釋而變弱。實施例5實施例5是針對DR2和DQl的II類抗體陽性的樣品，因此這對於I類測試線恰好是陰性的。實施例6和7實施例6和7使用在測試區剝離的僅含有II類的試紙條，並且對照區還是生物素。對於圖3中所示的實施例6-7，按照之前所述的，使用Iul II類結合的測試珠和0. 5ul 0. 32um抗生物素蛋白鏈菌素珠子的溶液。樣品6是I類抗血清，恰好顯示為相對II類線是陰性的，而測試7顯示了含有II類抗體的血清的成功鑑定。實施例8-15這些實施例利用了含有不同組合的I類和II類抗體的測試試紙條。對於圖3中所示的實施例8-15，使用了 Iul結合I類和Iul結合II類的測試珠子，和0.5ul 0.32um抗生物素蛋白鏈菌素珠子的溶液。通過第一個位置(d.)的線來證明抗-I類的存在，通過第二個位置(e.)的陽性線來證明II類的抗體。一些測試血清對I類和II類抗體的存在都是陽性的，並且因此顯示出兩條陽性線，相反，樣品15是沒有顯示出I類或II類抗體的陰性對照樣品。兩階段測定用於HLA抗體的側向流動測定的可替換形式包括兩階段測定，其中在施加於側向流動裝置的反應區之前，將分析物接觸HLA配體。這種方法的優勢在於可以使抗原接觸樣品抗體，並且可以在珠子-抗原-免疫球蛋白複合體穿過側向流動裝置之前，除去無關蛋白或其他材料。這種方法還使得可以將測定用於可替換的檢測方法中。以下顯示了這些中的一些實例。實施例16兩階段測定變化1為了測試兩階段測定，按照所述的實驗方案將1類HLA蛋白結合膠乳微粒。將結合的顆粒與對照生物素化的膠乳顆粒1 1混合。將Iul的珠子混合物加入以下的陽性和陰性測試樣品中。1) 50ul抗-HLA II類(DRB)單克隆(陰性對照)2)50ul HLA 1類陰性血清(陰性測試)3) 50ul PBS吐溫中的50ul抗-HLA A2單克隆抗體(陽性測試)4) 50ul抗-1類HLA陽性的血清(陽性測試)通過在14，300rpm下離心5分鐘，使每個測試沉澱，並且丟棄上面的上清液。然後將膠乳顆粒重懸浮於50ul PBS吐溫中並在測試側向流動試紙條上運行。這些試紙條上的測試線是鼠抗人IgG，形成用於陽性樣品的陽性對照。測試線是抗生物素蛋白鏈菌素對照線，其結合未結合的珠子，顯示測試已經完成。結果顯示於圖4中。該兩階段測定中的測試線可以是與這種情況下相同的抗-IgG，或者是任何其他類別或同種型特異性的實例，如抗IgM，抗IgG/A/M，抗同種型，如IgGl、2、3或4。實施例17兩階段測定變化2 ； 二價抗原測試將來自實例χ的相同血清和單克隆在可替換的試紙條上運行，試紙條在測試線上含有濃縮的HLA蛋白，來替代之前所述的「二價」測試中的抗體。結果顯示於圖5中。一或兩階段測定的其他變化包括使用第二種抗體的夾層測定；在該實施例中，如果樣品含有HLA結合的抗體，將HLA覆蓋的珠子接觸蛋白樣品。然後將珠子-抗體複合體接觸並結合分離緩衝液或結合墊中的抗人抗體。這些第二種抗體的實例可以是任何鼠抗人 IgG、山羊抗人IgG或雞抗人IgG。可以使用任何物種的抗人免疫球蛋白，並且同樣這些可以是類別或同種型特異性抗體。為了檢測珠子-HLA-抗體-第二層複合體，在測試線使用抗-物種抗體；因此如果將雞抗人用作第二層，測試線將由合適的抗雞抗體組成，這將固定複合體，產生陽性應答。
權利要求
1.一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的流通測定裝置，該裝置包括與結合墊和芯吸墊液體連通的多孔膜，所述結合墊具有用於檢測和結合特定分析物的檢測部件，所述多孔膜具有檢測區，其中固定的第二種捕獲試劑被構造成結合分析物-結合物複合體的至少一部分，以產生檢測信號。
2.如權利要求1中所要求的裝置，其中所述分析物包含HLA抗原、多態性蛋白或在移植或灌輸情況下可能引起抗體應答的蛋白片段，如MICA、MICB、KIR、主要組織相容性抗原 (MIHAg)、粒細胞抗原(HNA系列)、血小板抗原(ΗΡΑ系列)、內皮細胞-單核細胞抗原(如 P-選擇蛋白、E-選擇蛋白)、CD31和輸血抗原，如Lewis、Rhesus、MN、I/i和HT-A，或針對其的免疫球蛋白。
3.如權利要求1或2中所要求的裝置，其中所述測試可以用於鑑定針對多態性分析物的免疫球蛋白的存在或不存在。
4.如權利要求3中所要求的裝置，其中所述多態性分析物包括包含許多表型的多種抗原的混合集合或針對其的免疫球蛋白。
5.如權利要求1、2或3中所要求的裝置，其中所述裝置可以用於鑑定針對來自多態性系統的單個分析物的免疫球蛋白或針對其的免疫球蛋白的存在或不存在。
6.如權利要求5中所要求的裝置，其中所述分析物包括單個HLA抗原，如A0101、A0201 等，或表示臨床相關表位的單個抗原的肽片段。
7.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中所述分析物或配體包括可能源自多個組合來源以產生表示基因座上的所有多態性抗原的蛋白集合的抗原，或源自單個個體的抗原，或單個抗原，如重組抗原，或抗原的一個或多個片段，如一個或多個肽，或針對其的免疫球蛋白。
8.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中所述檢測區含有不連續的多個抗原。
9.如權利要求6中所要求的裝置，其中所述分析物包括一個區域中的I類HLA抗原，第二個區域中的II類HLA抗原，使得可以檢測個體內多個免疫球蛋白特異性，或針對其的免疫球蛋白。
10.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中所述檢測區可以含有與移動相相同的配體。
11.如權利要求1至10任一項中所要求的裝置，其中所述檢測區含有與移動相相關的抗原或表位，使得可以通過使第一個抗原的表位與第二個抗原上的表位連接來檢測免疫交叉反應性，由此所述表位可以是相似的或不同的。
12.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中所述移動相由可移動顆粒組成，可移動顆粒可以為膠乳、聚苯乙烯、聚碳酸酯、膠態金屬或其他可以在側向流動測試區中檢測到的可移動顆粒。
13.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中所述樣品墊可以由能從全血中分離出血清並使血清在所述裝置上流動的材料組成。
14.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中所述移動相可以由多個有差別地標記的顆粒組成，這些顆粒可以在不同檢測區中得以區分。
15.如權利要求14中所要求的裝置，其中所述標記的顆粒包括I類HLA抗原、II類HLC 抗原和/或對照抗原。
16.如權利要求15中所要求的裝置，包括附著於紅色顆粒上的I類HLA，附著於藍色顆粒上的II類HLA，附著於黑色顆粒上的對照抗原。
17.如權利要求14、15或16中所要求的裝置，其中其他可移動試劑，如針對免疫球蛋白的標記的抗體可以用於雙重標記反應，使得能區分抗體類別或同種型。
18.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中使用移動相中顆粒上的無關標記，如生物素或抗生物素蛋白鏈菌素和遠端對照檢測區中的相關配體來測試所述裝置的正確流動。
19.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其特徵在於該裝置用於移植前或移植後監控以及篩選血液和其他血液製品中抗體的存在，其中所述裝置包括可以未封裝提供的樣品墊、結合墊、測試試紙條和吸收墊，作為量杆測試，由此將樣品墊浸入分析物中。
20.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，包括a.夕卜殼b.樣品墊c.結合墊d.膜，其上具有標記的一個或多個反應區，和e.吸收墊。
21.如權利要求1至20任一項中所要求的裝置，裝有多個對不同的分析物具有特異性並裝在總的容器中的其他裝置，使得可以對於單個樣品同時進行多個測試。
22.如之前任一項權利要求中所要求的裝置，其中可以通過眼睛或通過測量測試區和對照區強度以獲得可以產生定量或半定量結果的數字輸出的裝置來辨別結果。
23.一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，包括i)提供一種流通測定裝置，其包括與結合墊和芯吸墊液體連通的多孔膜，該多孔膜限定了 a)檢測區，其中固定了第一種抗體，該抗體被構造成結合分析物和結合的檢測部件之間形成的複合體，以產生檢測信號；b)對照區，其中固定了第二種抗體，當包含在對照區內時，能夠產生對照信號； )使含有分析物的測試樣品與芯吸墊接觸；和iii)檢測所述檢測信號。
24.一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的試劑套盒，包括a)如權利要求1至22任一項或多項中所要求的裝置；b)洗滌緩衝液和/或追蹤緩衝液；和c)檢測部件。
25.如權利要求M中所要求的試劑盒，進一步包括用於收集樣品並且含有所述檢測部件的容器。
26.一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的方法，包括a)使含有分析物的測試樣品接觸檢測部件；b)通過洗滌除去未結合的檢測部件和/或其他材料；c)提供一種流通測定裝置，其具有(i)檢測區，其中固定了第一種抗體，該抗體被構造成結合在分析物和結合的檢測部件之間形成的複合體，以產生檢測信號，和(ii)對照區， 其中固定了第二種抗體，當包含在對照區內時，能夠提供對照信號；d)使結合檢測部件的洗滌過的分析物接觸所述裝置；和e)檢測所述檢測信號。
27. 一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或量的兩階段測定法，包括 第一階段，包括a)使含有分析物的測試樣品接觸檢測部件；b)通過洗滌除去未結合的檢測部件和/或其他材料； 和第二個階段，包括c)提供一種流通測定裝置，其具有(i)檢測區，其中固定了第一種抗體，該抗體被構造成結合在分析物和結合的檢測部件之間形成的複合體，以產生檢測信號，和(ii)對照區， 其中固定了第二種抗體，當包含在對照區內時，能夠提供對照信號；d)使結合檢測部件的洗滌過的分析物接觸所述裝置；和e)檢測所述檢測信號。
全文摘要
本發明涉及用於檢測分析物存在的方法和裝置。更特別地，本發明涉及用於檢測針對多態性同種抗原(如HLA抗原)和/或主要組織相容性複合體(MHC)的其他產物的免疫球蛋白的存在的方法和裝置。
文檔編號G01N33/569GK102439450SQ201080022456
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月31日 優先權日2009年3月31日
發明者B·J·帕斯, D·查威爾, M·邦斯 申請人:生物廣益有限公司