一種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸毒性的方法

2023-04-23 18:31:21

專利名稱：一種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸毒性的方法
技術領域：
本發明涉及ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸毒性的方法，屬於環境檢測技術領域。
背景技術：
由於具有疏水疏油性等非常獨特的物理化學性質，全氟辛烷磺酸(PFOS)被廣泛的應用於エ業、商業和個人消費品中，如可用作疏水疏油抗汙劑(地毯、紡織、室內裝璜、皮革、紙質產品等)、阻燃劑(航空航天、消防) 、表面活性劑(滅火泡沫、鹼性清潔劑)、光致抗蝕劑(半導體エ業)、電鍍抗霧劑、相紙抗靜電劑、塗料添加劑等，並可作為殺蟲劑、除草剤、潤滑劑、粘合劑和化妝品的成分等。目前，在廢水和汙泥、地表水、地下水、海水、海底沉積物和飲用水(自來水)中都檢測到了不同濃度的PFOSt5PFOS除具有抗酸、抗鹼、抗氧化劑和抗還原劑的能力，能耐水解、光解、生物降解等作用，還可以通過食物鏈積累，其在生物體內的蓄積水平遠高於有機氯農藥和ニ噁英等持久性有機汙染物。近年來關於檢測PFOS的生態毒性的研究主要集中在小鼠等哺乳動物以及斑馬魚、大型蚤等水生生物，現存方法中PFOS處理濃度遠高於自然界中PFOS的存在濃度，很難真實反應自然環境中PFOS的生態幹擾。且實驗周期長，不易觀察對後代的影響，試驗成本較高。輪蟲是廣泛分布於各類水體中的ー類浮遊動物。它們以藻類、細菌等為食物，同時又是魚類幼苗和某些無脊椎動物等的良好餌料。輪蟲繁殖快，對藻類食物的同化效率高達20-80 %，在水生態系統的物質循環和能量流動中起重要的樞紐作用。而且，輪蟲與其它枝角類和橈足類等競爭食物，影響水生生物群落的組成。輪蟲的分布廣泛、繁殖迅速、世代時間短，其存活、繁殖和行為等對環境理化因子的變化敏感，以輪蟲為受試生物進行的毒理實驗過程的標準化等使其成為水生態毒理學研究的模式生物之一，並被廣泛用於水環境的監測。1999年，美國環保局正式把萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲分別作為淡水和海水汙染的指示動物列入國家測試標準(ASTM，1999)。目前，在輪蟲的水生態毒理學研究中主要涉及的是重金屬離子化合物、雌激素、多氯聯苯、多環芳烴、及農藥類汙染物，而PFOS對輪蟲的毒性的未見報導。本發明提供了一種可以通過輪蟲的生命表變化來判斷PFOS毒性的方法，材料易得、實驗周期短、便於觀察PFOS對後代以及整個種群的影響、測試用量少、成本低。

發明內容
本發明的目的在於提供ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，即通過檢測輪蟲在PFOS存在的情況下其無性生殖策略、有性生殖策略及個體大小的變化來檢測PFOS毒性的目的；此方法用很少的測試液、在較短的時間內、以簡單的實驗過程體現了輪蟲的各發育階段和輪蟲生活史的全過程(如發育、性成熟、種群增長和生殖)；除此之外，還能估計到子一代輪蟲的生殖能力。本發明所採用的技術方案如下所述
ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，包括步驟如下I)輪蟲的培養用輪蟲培養液對輪蟲進行「克隆」培養，以綠藻培養液培養的、處於指數增長期的淡水緑藻為餌料，培養時間為六個月以上，實驗前用輪蟲培養液對輪蟲進行兩周以上的預培養，培養在20±1°C、持續光照條件下進行；2)急性毒性試驗將全氟辛烷磺酸(PFOS)設為100. 0、1 0. 0、1.0、0. I和O. 01mg/L 5個濃度梯度，每個梯度設置4個重複，另設I個空白對照，從預培養的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置於培養皿中進行培養，2h後收集孵化出的輪蟲幼體，將輪蟲幼體放入六孔板中，加入測試液，試驗在20± I°C、無光照的恆溫培養箱中進行，採用機率単位法分別求得其LC50 值；3)測定不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響通過種群增長率實驗評價不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響，96h後，對每個試管中輪蟲的非混交雌體、混交雌體和不帶卵雌體分別進行計數，然後全數返回原培養器皿繼續培養24h，之後對混交雌體所攜帯的休眠卵及試管底部沉積的休眠卵進行計數；4)測定不同濃度PFOS對輪蟲生殖策略的影響設置了不同濃度PF0S，另加I個空白對照(輪蟲培養液)用於生命表實驗，記錄輪蟲產第一枚卵所需的時間；並測量其體長體寬，檢測PFOS對其生長發育的影響；之後記錄輪蟲的產卵數、孵化出的幼體數和母體存活情況，並記錄第二代幼體非混交雌體與混交雌體的比例，由此進行水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的測定。本發明的方法中，所述的輪蟲培養液為MBL培養液。本發明的方法中，步驟4中所述的PFOS濃度為O. 01,0. I和I. Omg/L。本發明的方法中，所述輪蟲優選為萼花臂尾輪蟲。
具體實施例方式下面將結合實施例進行詳細說明，以對本發明方法的目的、特徵和優點有更深入的了解。以下的實施例具體解釋本發明，本發明的範圍不受實施例的限制。實施例I本實施例涉及到利用萼花臂尾輪蟲檢測水中PFOS毒性的方法，包括如下步驟，其中步驟4中所述的PFOS濃度為O. Olmg/L。I.輪蟲的來源和培養首先採集受試萼花臂尾輪蟲，實驗室內用輪蟲培養液對其進行「克隆」培養，以綠藻培養液培養的、處於指數增長期的淡水緑藻(C. pyrenoidosa)為餌料，培養時間為六個月以上，實驗前用改良的輪蟲培養液配方(USEPA，1985)的輪蟲培養液對輪蟲進行兩周以上的預培養，預培養時每天投餵密度為I. OXlO6ceIls · ml/1的綠藻，培養在20±1°C、持續光照條件下(30001x)。2.急性毒性試驗全氟辛烷磺酸(PFOS)購自Sigma-Aldrich,^ (PFOS)設為 100. 0,10. O、I. 0,0. I和0. 01mg/L 5個濃度梯度，每個梯度設置4個重複，另設I個空白對照(EPA培養基)。測試液的配製採用母液稀釋的方法，先用蒸餾水配製I. Og/L的母液，然後用EPA培養基(不含藻食物)稀釋得到不同濃度的PFOS測試液，從預培養的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置於培養皿中進行培養，2h後收集孵化出的輪蟲幼體，每10個輪蟲幼體放入容積為IOmL的六孔板中，加入5mL測試液，試驗在(20±1)で、無光照的恆溫培養箱中進行，採用機率単位法分別求得其LC50值。3.不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響通過種群增長率實驗評價不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響，該實驗在六孔板中進行。在每個孔中放入齡長小於2h的輪蟲幼體15個，並添加配製好的各濃度PFOS溶液至10ml，餌料為I. OX 106cells/L的綠藻，PFOS濃度設置為5組，分別為O. 125,0. 25、
O.5、I. 0、2. Omg/L並設I個對照組(培養液不含 PF0S);每組均設4個重複，實驗在溫度為(20±1)°C的恆溫培養箱中進行。實驗過程中，每12h懸浮沉積於試管底部的藻類食物，每24h更換內含I. OX 106cells/L綠藻的測試液，96h後，對每個試管中輪蟲的非混交雌體、混交雌體和不帶卵雌體分別進行計數，然後全數返回原培養器皿繼續培養24h，之後對混交雌體所攜帯的休眠卵及試管底部沉積的休眠卵進行計數，種群增長率試驗結果顯示O. 125mg/L的PFOS對輪蟲種群增長率影響差異不顯著，其餘四種濃度(O. 25、0. 5、1.0、2.0mg/L)的PFOS對輪蟲種群增長率影響差異顯著。4.不同濃度PFOS對輪蟲生殖策略的影響選用濃度為O. 01mg/L的PFOS用於生命表實驗，生命表實驗在特製的24孔塑料板中進行，每孔中放入一個齡長在2h內的幼體，加入ImL的測試液，實驗開始的48h內，每隔3h觀察一次，記錄輪蟲產第一枚卵所需的時間；32h時測量其體長體寬，檢測PFOS對其生長發育的影響；之後每8h觀察一次，記錄輪蟲的產卵數、孵化出的幼體數和母體存活情況，並移去幼體至96孔板，記錄第二代幼體非混交雌體與混交雌體的比例；每間隔24h將存活的母體轉移到新鮮的測試液中，實驗結果顯示0. 01mg/L的PFOS處理延長了輪蟲幼體階段歷時，降低了種群中的混交雌體百分率，進而影響下一代種群中雌雄比例，對產卵量無明顯影響。實施例2以濃度為O. lmg/L的PFOS溶液來代替實施例I中的步驟4中O. 01mg/L的PFOS溶液，其他條件同實施例I。實驗表明，0. lmg/L的PFOS處理延長了輪蟲幼體階段歷時、縮短了輪蟲的平均壽命、降低了種群中的混交雌體百分率，進而影響下一代種群中雌雄比例，對產卵量無明顯影響。實施例3以濃度為I. 0mg/L的PFOS溶液來代替實施例I中的步驟4中0. 01mg/L的PFOS溶液，其他條件同實施例I。實驗表明，I. 0mg/L的PFOS處理抑制了輪蟲的生長、延長了輪蟲幼體階段歷時、縮短了輪蟲的平均壽命、降低了種群中的混交雌體百分率，進而影響下ー代種群中雌雄比例，且大大抑制了輪蟲的產卵量。實施例1，2，3實驗結果如表I所示表I.暴露在不同濃度PFOS下(mg/L)的萼花臂尾輪蟲的幼體期時間(T)、平均壽命(ML)、平均產卵量(EQ)及混交雌體數/非混交雌體數的比例(MF/AF)。
權利要求
1.ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，包括步驟如下 1)輪蟲的培養 用輪蟲培養液對輪蟲進行「克隆」培養，以綠藻培養液培養的、處於指數增長期的淡水緑藻為餌料，培養時間為六個月以上，實驗前用輪蟲培養液對輪蟲進行兩周以上的預培養，培養在20 ± Iで、持續光照條件下進行； 2)急性毒性試驗 將全氟辛烷磺酸(PFOS)設為100. O、10. O、I. 0、0. I和O. 01mg/L 5個濃度梯度，每個梯度設置4個重複，另設I個空白對照，從預培養的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置於培養皿中進行培養，2h後收集孵化出的輪蟲幼體，將輪蟲幼體放入六孔板中，加入測試液，試驗在20±1°C、無光照的恆溫培養箱中進行，採用機率単位法分別求得其LC50值； 3)測定不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響 通過種群增長率實驗評價不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響，96h後，對每個試管中輪蟲的非混交雌體、混交雌體和不帶卵雌體分別進行計數，然後全數返回原培養器皿繼續培養24h，之後對混交雌體所攜帯的休眠卵及試管底部沉積的休眠卵進行計數； 4)測定不同濃度PFOS對輪蟲生殖策略的影響 設置了不同濃度PF0S，另加I個空白對照(輪蟲培養液)用於生命表實驗，記錄輪蟲產第一枚卵所需的時間；並測量其體長體寬，檢測PFOS對其生長發育的影響；之後記錄輪蟲的產卵數、孵化出的幼體數和母體存活情況，並記錄第二代幼體非混交雌體與混交雌體的比例，由此進行水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的測定。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的輪蟲培養液為MBL培養液。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於步驟4中所述的PFOS濃度為O.01,0. I和1.Omg/し
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述輪蟲為萼花臂尾輪蟲。
全文摘要
本發明涉及一種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)生物毒性的方法，屬於環境檢測技術領域。具體是選用輪蟲作為模式生物，此種生物分布廣泛、繁殖迅速、世代時間短，存活、繁殖和行為等對環境理化因子的變化敏感；通過不同濃度的PFOS水溶液對輪蟲種群密度的改變評價其對生態系統的影響，然後以其對輪蟲生活史的影響確定PFOS的作用機制。本發明克服了目前測定水中PFOS生物毒性中周期長、操作複雜的困難，提供了一個簡便、靈敏、系統的檢測水中PFOS毒性的方法，該方法方便、快速、成本低廉。
文檔編號G01N33/00GK102692478SQ20121017360
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者孫棟, 張利蘭, 牛軍峰 申請人:北京師範大學