一種磷酸肌酸的生產方法
2023-04-23 18:50:46
專利名稱：一種磷酸肌酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種磷酸肌酸的生產方法，特別是一種酶法生產磷酸肌酸的方法。
近年來，人們發現磷酸肌酸具有重要的藥理作用，它是一種重要的心肌保護劑。大量的動物模型和臨床實驗已經證明它可以用於治療心肌梗死，以及在心臟外科手術中減輕手術給病人心肌功能帶來的損傷。因此，磷酸肌酸對改善病人心肌的能量代謝有重要意義。
目前磷酸肌酸的製備有合成和從肌肉提取兩種方法。就合成法而言，化學合成法條件苛刻，成本高、產率低，而且由於大量使用酸鹼等化學試劑會對環境造成破壞。就生物合成的酶法而言，則具有反應條件溫和、反應速度快和專一性強等優點。在用酶法製備磷酸肌酸過程中，曾有用粗酶製劑作為酶原的發明，參見專利號為IT1044765的專利文獻。該發明由於採用糖酵解中的某一物質，例如3-磷酸甘油酸，作為反應起始底物來生產磷酸肌酸，因此用的是包括肌酸激酶在內的複合酶體系，即動物肌肉細胞漿的粗抽提液。使用這樣的粗酶體系，由於參與反應的酶較多，各種酶所要求的最適條件不同，因此不能保證同時滿足所有酶的最適條件。最終結果是影響磷酸肌酸的產率。另外，用動物肌肉細胞漿製備的粗酶體系作為酶源，勢必要加入較多的酶蛋白到反應體系中，這些酶蛋白在提純時則成為一種必須分離除去的雜質，這給分離純化帶來困難。
本發明的目的在於提供一種磷酸肌酸的生產方法，生產過程可以監控，成本低，產率高，產物分離純化容易，不對環境造成汙染。
本發明是這樣實現的一種磷酸肌酸的生產方法，包括下述步驟①製備肌酸激酶酶製劑；②配製反應物溶液反應物溶液中ATP的濃度為15-30mM，肌酸的濃度為ATP濃度的2-10倍，鎂離子的濃度是ATP濃度的1-5倍，加入緩衝劑後調pH至7.5-10；③將反應物溶液在15℃-45℃保溫；④加酶進行酶促合成反應在上述反應物溶液中加入濃度為10-5-10-3mM的肌酸激酶，酶反應過程中不時加入稀鹼，測定pH值並維持其恆定，當反應液的pH不再發生變化時，終止反應；⑤磷酸肌酸的分離純化用離子交換樹脂吸附並洗脫磷酸肌酸。
所述酶反應過程中步驟②中反應物溶液中加入的緩衝劑為氨基乙酸，其濃度為10mM。
所述酶反應過程中步驟③中的反應物溶液在25℃-40℃保溫。
所述酶反應過程中步驟④中加入稀鹼後維持pH值在8-10。
所述酶反應過程中步驟⑤採用的是陰離子交換樹脂吸附及洗脫，洗脫以0.01-0.05ml/ml樹脂/min的流速通過上述陰離子樹脂交換柱，採用電解質鹽類作為洗脫劑進行梯度洗脫並收集磷酸肌酸組分。
所述酶反應中還可以包括下述步驟⑥將磷酸肌酸從大體積洗脫劑中分離並製備成磷酸肌酸鈉鹽。
本發明是利用從動物肌肉提取的肌酸激酶，以三磷酸腺苷和肌酸在最適酶反應條件下生產磷酸肌酸的過程。針對粗酶體系的缺點，我們採用較為純淨的肌酸激酶製劑作為酶原，以它的直接底物三磷酸腺苷作為初始底物，不僅保留了酶法的優點，而且使純化和對反應的控制都更為便利。
肌酸激酶在哺乳動物肌肉細胞漿中的含量是很高的。我們進行生產磷酸肌酸的酶反應，由於反應體系只含一種生成磷酸肌酸的酶，因此容易控制酶反應條件，保證了磷酸肌酸的產率；由於我們所用酶的純度較高，因此酶的用量較少，減少了雜蛋白混入產品的可能性，提高了產品的純度。
ATP的製備在中國已是成熟的技術，ATP是一容易開發和找到的產品，使用ATP比使用其它物質，如三磷酸甘油酸，作為肌酸的磷酸源成本更低。由於ATP是經肌酸激酶反應使肌酸磷酸化的直接底物，所以反應完成後的產物分離便變得相對簡單，這樣也有利於提高產品的純度。
本發明生產過程使用了監測酶反應程度的監測手段。由於在肌酸激酶反應過程中不斷地放出H+，這給整個酶反應過程的監測提供了條件。根據酶反應過程中pH的變化，隨時加入稀鹼液以便保持酶反應在恆定的鹼性條件下進行。根據稀鹼液耗量的多少及反應過程中pH的變化，可以判斷反應是否完成及完成的程度。
本發明在操作過程中省去了使酶失活這一通常步驟，從而避免了磷酸肌酸在該處理過程中的分解。
上述特點使本發明大大不同於以前的相關發明。按照本發明製備磷酸肌酸，不僅使得磷酸肌酸的生產能夠在溫和和可調控的條件下進行，而且產率穩定，生產規模可以根據需要自行確定。
為實施本發明的方法，肌酸激酶可來源於哺乳動物的肌肉。為了得到高活力的酶製劑，應該使用新鮮的動物肌肉。酶的製備和測活方法請參照「Methods inEnzymology」II.pp605-610。
反應混合物中磷酸肌酸產率，通過液相色譜法測定。離子交換柱是Mono QHR 5/5，緩衝液A是10mM K2HPO4，pH8.0；緩衝液B是50mM K2HPO4，pH8.0，0.5M NaCl；梯度是30分鐘達到0-75％緩衝液B。測試儀器可用AKTA液相色譜儀或其它HPLC譜儀。產物產率由所得分離圖譜中ADP和ATP在260nm峰的面積比來確定，參考文獻Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，83，4162-4166，1986.。
為了使酶反應能在一較為恆定的條件下進行，應該在酶反應液中加入少許緩衝物質，使其具備一定的緩衝能力。為此目的優選使用氨基乙酸-NaOH緩衝液。酶反應可在pH7.5-10間進行。合適的溫度是15-45℃，優選25-40℃。酶反應時間可以根據反應條件來改變，但通常是30分鐘-5小時，優選時間是1.5-3小時。
本發明獲得的磷酸肌酸可以很容易地回收。例如，反應結束後，反應液可用離子交換樹脂分離提取，所得磷酸肌酸組分可進一步從酒精和水的混合物中經重結晶得到所需產品。
實施例1.一種製備磷酸肌酸的方法，包括下述步驟(1)製備肌酸激酶酶製劑原則上，哺乳動物的肌肉都可作為肌酸激酶製劑的來源。我們使用的是兔肌。製備步驟包括1).使兔急性致死取兔肌。兔肌應儘量去除筋膜和結締組織，並將其剪成碎塊，應避免有水混入；2).加入10mM KCl溶液，用高速搗碎機將兔肌搗成勻漿並在低溫下抽提攪拌30分鐘，離心取上清液；3).加入固體NH4Cl使溶液濃度達到100 mM；4).加入95％冷乙醇使其終濃度達至60％並在20℃下攪拌抽提2小時，使不耐受酒精的蛋白沉澱並離心除去；5).加入硫酸鎂使肌酸激酶在酒精中沉出；6)用乙酸鎂溶液抽提肌酸激酶的鎂鹽沉澱；7).在肌酸激酶的乙酸鎂抽提液中加入冷乙醇，收集36-50％沉澱組分，溶於稀檸檬酸銨溶液中，分別對該溶液及稀NH4OH透析，高速離心所得上清液就是肌酸激酶製劑。測定酶製劑的濃度和比活力，放入低溫冰箱保存待用。
(2)配製反應物溶液在含1260ml下述反應物的反應器中來進行酶反應ATP20mM，肌酸58mM，乙酸鎂25mM，氨基乙酸10mM。
(3)將反應物溶液加溫至30℃。
(4)加酶進行酶促合成反應在上述反應物溶液中加入肌酸激酶，使其濃度為33.3×10-4mM，酶反應在pH9.0下進行約3小時。為維持pH之恆定，應不時加入稀鹼。反應進行中要不斷攪拌。當反應液的pH不再發生變化時，停止反應。反應完畢後，用AKTA液相色譜儀給出的260nm處ADP和ATP峰面積之比來確定反應產率。反應產率通常可達80％左右。
(5)磷酸肌酸的分離純化反應完畢後，反應液通過Dowex I或相類似的強陰性離子交換樹脂。上述酶反應液為1610ml。該反應液通過一12.5×5cm的層析柱，接著用上柱緩衝液衝洗該柱。按260毫微米處的光吸收變化計算，吸附率可達99％；按210毫微米處的光吸收變化計算，吸附率是85％。
實施例2上述實施例1製備磷酸肌酸的方法中，步驟(2)反應物溶液中ATP的濃度為15mM，肌酸的濃度為30mM，緩衝劑Tris5mM，其它條件同實施例1。步驟(3)的溫度為25℃。步驟(4)中，調pH至10反應時間為3小時。該反應磷酸肌酸產率為77％。
實施例3上述實施例1製備磷酸肌酸的方法中，步驟(2)反應物溶液中ATP的濃度為30mM，肌酸的濃度為300mM，反應物溶液中鎂離子的濃度是50mM，緩衝劑Tris15mM。步驟(3)的溫度為40℃。步驟(4)中，調PH至8.0反應時間為1.5小時。該反應磷酸肌酸產率為78％。
實施例4製得的磷酸肌酸經過置換反應可獲得磷酸肌酸鈉鹽。
權利要求
1.一種磷酸肌酸的生產方法，其特徵在於包括下述步驟①製備肌酸激酶酶製劑；②配製反應物溶液反應物溶液中ATP的濃度為15-30mM，肌酸的濃度為ATP濃度的2-10倍，鎂離子的濃度是ATP濃度的1-5倍，加入緩衝劑後調pH至7.5-10；③將反應物溶液在15℃-45℃保溫；④加酶進行酶促合成反應在上述反應物溶液中加入濃度為10-5-10-3mM的肌酸激酶，酶反應過程中不時加入稀鹼，測定pH值並維持其恆定，當反應液的pH不再發生變化時，終止反應；⑤磷酸肌酸的分離純化用離子交換樹脂吸附並洗脫磷酸肌酸。
2.根據權利要求1所述的磷酸肌酸的生產方法，其特徵在於所述酶反應過程中步驟②中反應物溶液中加入的緩衝劑為氨基乙酸，其濃度為10mM。
3.根據權利要求1所述的磷酸肌酸的生產方法，其特徵在於所述酶反應過程中步驟③中的反應物溶液在25℃-40℃保溫。
4.根據權利要求1或2或3所述的磷酸肌酸的生產方法，其特徵在於所述酶反應過程中步驟④中加入稀鹼後維持pH值在8-10.5。
5.根據權利要求1或2或3所述的磷酸肌酸的生產方法，其特徵在於所述酶反應過程中步驟⑤採用的是陰離子交換樹脂吸附及洗脫，洗脫以0.01-0.05ml/ml樹脂/min的流速通過上述陰離子樹脂交換柱，採用電解質鹽類作為洗脫劑進行梯度洗脫並收集磷酸肌酸組分。
6.根據權利要求1或2或3所述的磷酸肌酸的生產方法，其特徵在於所述酶反應中還可以包括下述步驟⑥將磷酸肌酸從大體積洗脫劑中分離並製備成磷酸肌酸鈉鹽。
全文摘要
本發明的名稱是一種磷酸肌酸的生產方法。屬於酶法生產磷酸肌酸的技術領域。目的在於提供一種磷酸肌酸的生產方法，生產過程可以監控，成本低，產率高，產物分離純化容易，不對環境造成汙染。本發明的步驟包括①製備肌酸激酶酶製劑；②配製反應物溶液；③將反應物溶液在15℃－45℃保溫；④加酶進行酶促合成反應；⑤磷酸肌酸的分離純化。本發明利用從動物肌肉提取的肌酸激酶，以三磷酸腺苷和肌酸在最適酶反應條件下生產磷酸肌酸。方法可操作性強，磷酸肌酸產率高，產物分離純化容易，無汙染。
文檔編號C12P9/00GK1478899SQ0212920
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月27日 優先權日2002年8月27日
發明者侯立向 申請人:中國科學院生物物理研究所, 鞍山天物生製藥有限公司