一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法
2023-04-23 18:55:06 1
專利名稱：一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種生產重組高活性錳超氧化 物歧化酶的方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一類廣泛存在於生物體內的金 屬酶，能夠保護需氧細胞免受正常代謝過程中產生的活性氧(reactive oxygen species, R0S)的毒害，其主要催化下列反應202__+2H+ — H202+02, H2O2隨後被過氧化氫酶(CATs)和 過氧化物酶清除。SOD家族有多種同功酶，按分子所含金屬輔基的不同，可將其分為銅鋅超氧化物歧 化酶(Cu，Ζη-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和胞外超氧 化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, EC-S0D)四類，這四類 SOD 都催化同 一種催化反應。由於不同類型的SOD在一級結構上無同源性，它們之間的理化特性及穩定 性差別很大，不同種屬不同組織來源的同種SOD也略有差別。錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn_S0D)是哺乳動物的三 種超氧化物歧化酶之一，位於線粒體內，對維持胞內ROS平衡具有重要的作用。ROS對多種 生理過程的調節具有重要作用，如信號轉導、凋亡、分化和衰老。ROS不僅和多種病理狀態 的病因有關，而且參與腫瘤的形成過程。Mn-SOD可以從動物血提取，但由於存在動物源性的問題，在應用的過程中可能會 存在免疫原性，同時動物源性還可能帶入其它汙染，存在不安全問題。所以，利用基因工程 技術進行人Mn-SOD的生產是一種可行且便捷的方法。基因工程Mn-SOD的生產存在的問題 之一是由於誘導後的過量表達來不及正確摺疊形成不溶性的包涵體，需要進一步的變性、 復性才有可能獲得活性Mn-SOD，另外，即使是可溶性表達，也普遍存在活性不高的問題，這 也是由於其摺疊過程的不正確造成的。因此，本領域需要進一步研究開發獲得高活性Mn-SOD的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法。在本發明的第一方面，提供一種生產錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括(1)重組表達錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達的錳超氧化物歧化酶的細 胞(細胞培養物)；(2)破碎步驟(1)獲得的細胞，離心獲取上清；(3)將步驟(2)獲得的上清進行熱變性，熱變性溫度為75士2°C，熱變性時間為 10 士 5分鐘；熱變性後冷卻，離心(優選離心10 士 2分鐘)獲取上清；(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶。
在一個優選例中，步驟(2)中，採用超聲破碎細胞在另一優選例中，步驟(1)中，採用大腸桿菌重組表達錳超氧化物歧化酶。在另一優選例中，步驟(3)中，熱變性溫度為75士2°C (優選75士 1°C，更優選 750C )，熱變性時間為10士2分鐘(優選10士 1分鐘；更優選10分鐘)。在另一優選例中，所述的熱變性在水浴中進行。在另一優選例中，熱變性後冷卻至0_4°C (優選0°C )。在另一優選例中，步驟(4)中，採用DEAE-FF陰離子交換樹脂進行純化。在另一優選例中，所述的錳超氧化物歧化酶是人錳超氧化物歧化酶。在另一優選例中，步驟(5)中，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子(Mn2+)為 1 (5-100)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。在另一優選例中，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 (10-30)在純化 的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。更優選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 20在純化的錳超氧化物 歧化酶中加入錳離子。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
圖1A、粗酶液的比活與熱變性時間的關係。圖1B、總的酶活與熱變性時間的關係。圖2、可溶性表達的rhMn-SOD的純化。
具體實施例方式為了得到高活性的重組錳超氧化物歧化酶，本發明人經過深入的研究，開發了一 種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法在重組可溶性表達錳超氧化物歧化 酶後，將細胞上清進行熱變性，之後純化經過熱變性的蛋白溶液，純化產物用適當濃度的錳 離子進行激活。所述方法可獲得高活性的錳超氧化物歧化酶。本發明的生產重組活性錳超氧化物歧化酶的方法，即從可溶性表達的無活性或者 低活性的脫輔基超氧化物歧化酶通過體外處理獲得活性錳超氧化物歧化酶的方法，體外處 理的方法為在適當條件下加入適量的輔基-錳離子；適當的條件還包括適量輔基的加入後 轉變為有活性錳超氧化物歧化酶的條件。如本文所用，術語「錳超氧化物歧化酶」、"Mn-S0D'\ "MnSOD「可互換使用。如本文所用，術語「重組人錳超氧化物歧化酶」、「rhMn-SOD」、「重組人Mn-SOD」可
互換使用，都指來源於人的經基因工程手段重組表達獲得的錳超氧化物歧化酶。如本文所用，術語「具有酶活性」指具有天然存在的錳超氧化物歧化酶的生物活 性。天然存在的錳超氧化物歧化酶的生物活性例如指其抑制連苯三酚自氧化的活性。本發明提供一種生產錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括(1)重組表達錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達的錳超氧化物歧化酶的細 胞；
(2)破碎步驟(1)獲得的細胞，離心獲取上清；(3)將步驟⑵獲得的上清進行熱變性，熱變性溫度為75士2°C，熱變性時間為 10 士 5分鐘；熱變性後冷卻，離心獲取上清；(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶。可用於本發明方法的錳超氧化物歧化酶沒有特別限制，可以是來源於任何物種的 錳超氧化物歧化酶。一種優選的錳超氧化物歧化酶是來源於人的錳超氧化物歧化酶。用於本發明的錳超氧化物歧化酶是重組表達的錳超氧化物歧化酶。重組錳超氧化 物歧化酶表示通過重組體DNA方法和其他人工方法製備的重組多肽，它具有與任何天然存 在的錳超氧化物歧化酶相同的或基本上相同的胺基酸序列。眾所周知，根據已公開的錳超氧化物歧化酶序列，本領域技術人員可以通過PCR 擴增等方法製備錳超氧化物歧化酶的編碼序列，然後將其插入表達載體，進而轉化常見的 宿主細胞(如大腸桿菌)，就可以表達重組錳超氧化物歧化酶。在本發明的一個優選例中， 通過IPTG誘導使得大腸桿菌表達可溶性的錳超氧化物歧化酶，然後回收該錳超氧化物歧化酶。本領域技術人員能夠選擇表達載體和宿主細胞。優選的表達載體宜包括在宿主細 胞內表達克隆的基因所必需的調節元件，定位在編碼錳超氧化物歧化酶的核酸附近，以便 影響其表達。優選的細菌寄主細胞是大腸桿菌細胞，一種合適的大腸桿菌的例子是常見的 大腸桿菌BL21(DE3)。對於表達重組錳超氧化物歧化酶的大腸桿菌，通過本領域人員常用的破細胞手段 (如珠磨法破碎、液氮研磨破碎、壓力杯法破碎、超聲破碎等)，可以獲得可溶性的重組錳超 氧化物歧化酶。作為本發明的優選方式，採用超聲破碎細胞可以獲得良好的細胞破碎效果。破碎細胞後獲得的可溶性蛋白中通常同時還包含其它雜蛋白，需要通過適當的方 法來去除雜蛋白而保留可溶性的重組錳超氧化物歧化酶。去除雜蛋白的方法在本領域中是 多種多樣的，本發明人經過反覆研究後，意外地發現採用熱變性方法來去除雜蛋白可以獲 得良好的效果，不僅使得雜蛋白儘可能多地被去除，而且對於重組錳超氧化物歧化酶的損 害最低，從而為後續獲得高活性的重組錳超氧化物歧化酶提供了基礎。本發明人還發現，不 經過熱變性步驟去除雜蛋白而直接進行純化，純化效果不好，且得到的錳超氧化物歧化酶 的活性也不夠理想。熱變性的溫度也是較為關鍵的因素，溫度太高可能會影響到酶活性，而溫度過低 可能不足以分離去除(沉澱)雜蛋白。作為本發明的優選方式，熱變性溫度為75士2°C;更 優選75士 1°C，最優選75°C，在所述溫度下進行熱變性，非但不會明顯降低重組錳超氧化物 歧化酶的酶活性，而且還能夠儘可能多地去除雜蛋白。熱變性的時間是另一較為關鍵的因素，時間過長會對酶活性造成不可逆轉的影 響，而時間過短可能不足以分離去除(沉澱)雜蛋白。作為本發明的優選方式，熱變性時間 為10士2分鐘，更優選10士 1分鐘；最優選10分鐘。熱變性的實施可採用本領域常用的加熱技術，作為本發明的優選方式，所述的熱 變性在水浴中進行，水浴提供了均勻且溫和的條件，從而有利於保留重組錳超氧化物歧化 酶的酶活性。
作為本發明的優選方式，熱變性後立即將重組錳超氧化物歧化酶的酶液冷卻，從 而有利於較多地沉澱掉雜蛋白。優選地，將酶液冷卻至0-4°C (優選0°C)。經歷熱變性後的酶液可進一步進行純化。一種優選的純化方法為陰離子樹脂吸附 法；優選的陰離子樹脂包括DEAE陰離子交換樹脂(如DEAE-FF陰離子交換樹脂)；優選的 純化方法包括連續NaCl梯度洗脫；優選的NaCl洗脫的濃度範圍為0-0. 5M。獲得純化的重組錳超氧化物歧化酶後，需要對該酶進行激活以得到活化的重組錳 超氧化物歧化酶，用於激活的錳離子濃度的高低也可影響到其酶活性的高低。作為本發明 的優選方式， 按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 (5-100)在純化的錳超氧化物 歧化酶中加入錳離子；更優選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為1 (10-30)在 純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子；最優選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離 子為1 20在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1、重組人Mn-SOD的可溶性表達設計以下引物正向5-GACATATGAAGCACAGCCTCCCCGACC-3，(SEQID NO 1)；反向5，-GCAAGCTTGCATAACGATCGTGGTTTAC-3，(SEQID NO :2)。以人胎盤cDNA(購自Invitrogen)為模板，用前述引物進行PCR擴增獲得人 Mn-SOD的編碼序列。前述獲得的序列用Ndel/Hindlll酶切後插入到pET28a表達載體(購自 Invitrogen)的相應位點中，測序鑑定獲得正確插入的重組表達載體。將該重組表達載體常 規方法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得轉化子。挑取轉化平板上的單克隆菌落，接種至30mL LB培養液中(含100 μ g/mLAmp)， 置於37°C搖床過夜培養(10 12h)後，以2%接種量轉入二級瓶中，繼續培養。菌密度 至0D6000. 5 0. 6時，於37°C和12 °C下分別加入終濃度0. 5mmol/L IPTG誘導4小時， IOOOOrpm離心收集菌體，棄上清，菌體超聲破碎，離心後獲得上清表達的重組人Mn_S0D。實施例2、上清中加入不同濃度Mn2+對Mn-SOD激活的作用前述獲得的細胞培養物進行超聲破碎，離心後收集上清，其中含有可溶性的重組 人Mn-SOD以及其它雜蛋白。在獲得的含有可溶性的重組人Mn-SOD (rhMn-SOD)的上清中加入不同濃度的Mn2+， 觀察不同濃度Mn2+對Mn-SOD激活的作用。結果見表1。rhMn-SOD活性的測定方法採用微量連苯三酚法。酶活性定義如下25°C時，Iml反 應液中每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達50%時的酶量為一個活性單位。
rhMn-SOD比活性的測定定義為每mg蛋白所含的酶活力單位數。單位為U/mg。表 1
rhMn-SOD 活 性(U/ml)蛋白含量 (mg/ml)比活提高倍數上清1602.369.61Mn2+濃 度(mM)0.110062.3437.46.3112102.3526.17.61010902.3473.96.8可見，當Mn2+濃度為ImM時，rhMn-SOD活性最高。實施例3、熱變性方法除上清中雜蛋白前述獲得的細胞培養物進行超聲破碎，離心後收集上清，得到粗酶液。超聲破碎菌體後所得的粗酶液分別在60、65、70、75、80°C水浴條件下，熱變性5、 10、15、20min，熱變性後立即浸入水中(水溫0°C )冷卻，離心lOmin，取上清酶液，測定比 活。獲得的比活測定結果見圖1A。可見，75°C IOmin的熱變性效果是最佳的，上清中比活提高2. 5倍，而此時總的酶 活也沒有明顯降低，見圖1B。因此，確定75°C IOmin為rhMn-SOD粗酶液熱變性條件。實施例4、上清中脫輔基rhMn-SOD的純化脫輔基是指分子中不含有輔因子Mn的SOD蛋白，該實施例中脫輔基的rhMn-SOD 通過在培養誘導過程中不加入輔因子Mn而獲得。用2 X 15cm層析柱，DEAE-FF陰離子交換柱事先用20mM Tris-HCl，pH 8. 0的緩衝 液平衡，然後經熱變性處理後的上清液上樣，用相同的緩衝液平衡至基線平穩後，用含0 0. 5M NaCl梯度洗脫，分部收集，測定每管的0D280和酶活，把有酶活的收集液合併，測總酶 活和總蛋白含量。合併酶活高的收集管，即得純化的活性重組rhMn-SOD。可溶性表達的rhMn-SOD的純化結果見圖2。純化後脫輔基重組人Mn-SOD上清中加入不同濃度Mn2+對Mn-SOD激活的作用見表 2。Mn2+處理在室溫和最適pH條件下(如pH8. 0)進行。表2
---------
權利要求
一種生產錳超氧化物歧化酶的方法，其特徵在於，所述方法包括(1)重組表達錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達的錳超氧化物歧化酶的細胞；(2)破碎步驟(1)獲得的細胞，離心獲取上清；(3)將步驟(2)獲得的上清進行熱變性，熱變性溫度為75±2℃，熱變性時間為10±5分鐘；熱變性後冷卻，離心獲取上清；(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，採用超聲破碎細胞。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中，採用大腸桿菌重組表達錳超氧 化物歧化酶。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中，熱變性溫度為75士2°C，熱變性 時間為10士2分鐘。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的熱變性在水浴中進行。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，熱變性後冷卻至0-4°C。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(4)中，採用DEAE-FF陰離子交換樹脂 進行純化。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的錳超氧化物歧化酶是人錳超氧化物 歧化酶。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(5)中，按照摩爾比錳超氧化物歧化 酶錳離子為1 (5-100)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶錳離子為 1 (10-30)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。
全文摘要
本發明涉及一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法。所述方法在重組可溶性表達錳超氧化物歧化酶後，將細胞上清進行熱變性，之後純化經過熱變性的蛋白溶液，純化產物用適當濃度的錳離子進行激活。所述方法可獲得高活性的錳超氧化物歧化酶。
文檔編號C12N9/02GK101955918SQ20091005500
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月17日 優先權日2009年7月17日
發明者吳梧桐, 李素霞, 袁勤生, 陳車生 申請人:華東理工大學