大豆疫黴卵孢子發育相關轉錄因子Myb基因的用途的製作方法
2023-04-23 17:01:36
專利名稱：大豆疫黴卵孢子發育相關轉錄因子Myb基因的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因領域,具體涉及一種大豆疫黴Myb轉錄因子基因。
背景技術：
大豆疫黴是一種極為重要的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病是大豆生產上的毀滅性病害之一。該病原菌可以在大豆的各個生育期侵染大豆，一般發生年份減產10-30%，重病田塊可減產60%，甚至絕產。儘管我國於上世紀80年代後期才在東北地區首次發現大豆疫黴，但目前該病已在我國部分地區擴散並成為東北、安徽和福建等大豆主產區的主要病害，在一些年份，其造成的大豆產量損失高達50%以上。人們廣泛地選育抗病品種防治此病，但由於該病原菌的致病性易變，新的致病小種的產生易導致新選育的抗病品種失去利用價值。因此，大豆疫黴根腐病的防治始終是大 豆生產上的一個重要難題，而控制該病原菌的一個重要前提是了解其生長發育與致病過程的分子機制，尋找阻斷其生長與致病過程的分子靶標。轉錄因子在真核生物的生命活動中起著重要的調控作用，某個或某些基因在特定時期的打開或關閉則決定了所有生物有機體的特徵性狀，在整個基因組水平上了解基因的表達與調控是闡明疫黴菌生長發育與致病性的關鍵，對轉錄因子的研究將有助於明確疫黴菌細胞內基因調控的網絡和相互作用。Myb轉錄因子，是指含有Myb結構域的一類轉錄因子。最早是在鳥成髓細胞白血病病毒(vaian myeloblastosis viurs, AMV)中發現。後來，在擬南芥和玉米中，大量的Myb轉錄因子也被發現，它們能夠廣泛參與植物發育和代謝調節。Myb轉錄因子家族成員以含有Myb結構域為共同特徵，每個Myb結構域通常由51-52個胺基酸組成，含有3個規則間隔的色氨酸殘基，這些胺基酸殘基使Myb結構域摺疊成螺旋-轉角-螺旋(HeIix-Turn-HeIix，HTH)結構。脊椎動物中有三種Myb轉錄因子，分別為c_Myb，A-Myb和B-Myb，都含有3個重複的Myb功能域。植物基因組編碼大量的基因，這些基因廣泛的參與植物的多種生命活動。但是大量的植物地基因是只含有兩個Myb DNA結合域，被稱為R2R3-Myb，也有少量的基因含有3個Myb DNA結合域，被稱為3R_Myb。Myb蛋白雖然在序列上有一定的保守性，在結構上有一定的相似性，但不同的物種、不同的個體，甚至同一個體不同的組織器官之間，Myb蛋白的功能也存在著重大差異。分析大 疫黴中Myb轉錄因子的作用，明確Myb轉錄因子在大 疫黴中的功能，從而為尋找化學分子作用於Myb轉錄因子，抑制其功能，控制大豆疫黴生長或發育的某一環節，造成病害繁殖體的缺失，進而達到控制病害發生與傳播。這些研究工作的開展對控制大豆疫黴根腐病具有重要的理論和實踐價值，為開發以病原真菌生長發育為靶標的新型高效、低毒的殺菌劑具有重要的意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種大豆疫黴與卵孢子發育相關的Myb轉錄因子基因，該基因對於進一步深入了解大豆疫黴與卵孢子發育過程，並通過化學藥劑手段調控大豆疫黴與卵孢子發育，從而為控制大豆疫黴根腐病的發生起到重要作用。為了解決上述技術問題，本發明提供一種大豆疫黴與卵孢子發育相關的Myb轉錄因子基因，為SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本發明還同時提供了編碼上述大豆疫黴與卵孢子發育相關的Myb轉錄因子基因的蛋白質，為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。本發明還同時提供了上述大豆疫黴與卵孢子發育相關的Myb轉錄因子基因的用途，用於殺菌劑的作用靶標。本發明的Myb轉錄因子基因全長1969bp,從cDNA (互補脫氧核糖核酸)中克隆的編碼序列(CDS)序列為1818bp,該基因中存在3個外顯子序列，如圖I所不，翻譯後的蛋白質由605個胺基酸殘基組成。 與其他生物的Myb轉錄因子一樣，PsMybl也含有一個「SHLQKYR(Ser-His-Leu-Gln-Lys-Tyr-Arg,絲氨酸-組氨酸-亮氨酸_穀氨醯胺_賴氨酸_酪氨酸-精氨酸)」保守序列，如圖2下劃線部分所示。將該基因沉默後進行基因功能分析，得到的沉默的突變體中卵孢子的形成受到影響，沉默突變體產生極少量的卵孢子。本發明的有益技術效果是本發明提供了大豆疫黴與卵孢子發育相關的Myb轉錄因子基因，本發明產5##7基因的主要作用是能夠調控其靶基因轉錄，控制大豆疫黴卵孢子的發育，在控制大豆疫黴根腐病中具有很高的應用價值，以該基因為作用靶標，開發的殺菌劑對控制大豆疫黴根腐病的發生與流行具有重要的實踐意義。
圖I是PsMybl基因結構模式。圖2是PsMybl蛋白質胺基酸序列，下劃線部分序列為Myb脫氧核糖核酸結合區域保守序列。圖3是實時定量聚合酶鏈式反應篩選沉默突變體。圖4 IPsMybl沉默突變體的卵孢子產量明顯下降。野生型菌株(WT)、對照菌株(CK)和沉默突變體(M3、M9、M10和M16)在LBA上培養10天，顯微鏡下觀察卵孢子
的產量。圖5是PsMybI沉默突變體的卵孢子產量測量的定量結果。野生型菌株(WT)、對照菌株(CK)和沉默突變體(M3、M9、M10和M16)在LBA上培養10天，顯微鏡下觀察卵孢子的產量。
具體實施例方式供試菌株
供試菌株為大豆疫黴全基因組測序標準菌株P26,購自美國菌種保藏中心(AmericanType Culture Collection)。菌株保存在10% V8固體培養基，保存溫度是10攝氏度。大豆品種Williams對大豆疫黴菌株P26的侵染表現為感病，由南京農業大學國家大豆改良中心提供。
資料庫信息和同源檢索
大豆疫黴資料庫(http://genome, jgi-psf. org/Physo3/Physo3. home, html)
橡樹疫黴資料庫(http://genome, jgi-psf. org/Phyral_l/Phyral_l. home, html)
致病疫黴資料庫(http://www. broad, mit. edu)
疫黴菌功能基因組資料庫(http://www. pfgd. org/)。序列比對分析
將得到的大豆疫黴基因在歐洲生物信息學中心(European BioinformaticsInstitute, EBI)的網站(www. ebi. ac. uk/clustalw)上用 culstal W 軟體進行多重序列比對，無需改動用其默認值即可。核糖核酸(RNA )的提取和反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction, RT-PCR)
核糖核酸的提取使用的是Trizol (Invitrogen ,美國英傑Invitrogen公司)，液氮研磨組織，按100毫克組織加入I毫升Trizol，轉移入離心管，用電動勻漿器充分勻漿I分鐘。加Trizol後，室溫放置5分鐘，使其充分裂解。12000轉/分鐘離心5分鐘，棄沉澱，按I毫升Trizol加入200微升氯仿，振勻，室溫放置15分鐘，4攝氏度下12000轉/分鐘離心15分鐘。吸取上層水相，至另一離心管中。按每毫升Trizol加入O. 5毫升異丙醇並混勻，室溫放置10分鐘。攝氏度下12000轉/分鐘離心10分鐘，棄上清，核糖核酸沉於管底。按每毫升Trizol加入I毫升75%乙醇的比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉澱。4攝氏度下8000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清。室溫晾乾或真空乾燥5到10分鐘。用50微升水,溶解核糖核酸。核糖核酸反轉錄使用ThermoScript反轉錄酶(ThermoScript ,美國英傑Invitrogen公司)體系進行，先把下列組分加到反轉錄聚合酶鏈式反應管中濃度為50微摩爾/毫升的Oligo (dT)20(多聚胸腺嘧啶20)(Invitrogen ，美國英傑Invitrogen公司)，I微升；總核糖核酸，2微克；10毫摩爾/毫升的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合物(Invitrogen ,美國英傑Invitrogen公司),2微升；加焦碳酸二乙酯(DEPC) (solarbio ，上海索萊寶生物科技有限公司)水12微升。65° C保溫5分鐘至於冰上,後依次加入一下組分5倍的單鏈脫氧核糖核酸(cDNA)綜合緩衝液(SynthesisBuffer) (Invitrogen ,美國英傑Invitrogen公司)4微升；濃度為O. I摩爾/升的的二硫蘇糖醇(DTT) (Invitrogen ,美國英傑Invitrogen公司)1微升；濃度為40單位/微升的RNaseOUT (Invitrogen ,美國英傑Invitrogen公司)I μ I ;滅菌水I μ I ;濃度為15單位 / 微升的 ThermoScript RT (ThermoScript ,美國英傑 Invitrogen 公司)I μ I。將混合物輕輕混勻，50攝氏度保溫60分鐘，再85攝氏度保溫5分鐘，所獲得的單鏈脫氧核糖核酸(cDNA)置於零下20攝氏度備用。PsMybl脫氧核糖核酸序列擴增和蛋白質編碼序列分析
PsMybl的脫氧核糖核酸序列從菌株P26基因組中和單鏈脫氧核糖核酸(cDNA)中通過聚合酶鏈式反應擴增得到。引物序列為上遊引物5』 -ATGGCAAATTTGGCCCCCGC-3』，下遊引物5』 - TTACGACTTCAGGAAACAGATC- 3』，程序為94攝氏度2分鐘，然後94攝氏度30秒、52攝氏度30秒和72攝氏度2分鐘，進行30個循環。聚合酶鏈式反應產物克隆到pMD18_T載體上並測序驗證。蛋白質編碼序列由大豆疫黴資料庫(http://genome.jgi-psf.org/Physo3/Physo3. home, html)中獲得；從大豆疫黴基因組DNA和cDNA中克隆出全長序列並測序。經過比對發現，PsMybl基因全長1969bp，從cDNA中克隆的⑶S序列為1818bp，該基因中存在3個外顯子序列，參見圖I，翻譯後的蛋白質由605個胺基酸殘基組成，參見圖2。構建PsMybl反向轉化載體
首先用內切酶5)^1酶切載體pham34，回收純化後與高保真擴增產物相連接。連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用pham34啟動子上遊引物和下遊引物PCR擴增篩選反向插入的克隆。大豆疫黴遺傳轉化
1)配製40%聚乙二醇10mL :稱取6 g聚乙二醇4000放於50毫升燒杯中，於超淨臺中依次加入3. 75毫升0.8摩爾/升甘露醇，3毫升0.5摩爾/升氯化鈣和3毫升水，攪拌溶解； 2)用紗布和200毫升燒杯收集菌絲，並用鑷子將菌絲放入含有O.8摩爾/升甘露醇的培養皿中漂洗將漂洗過後的菌絲移入盛有O. 8摩爾/升甘露醇的離心管中室溫搖洗10分鐘；
3)用滅過菌的50毫升燒杯快速稱取O.I克Lyzing酶和O. 06克纖維素，蓋緊杯口迅速拿回超淨臺。並依次加入10毫升0.8摩爾/升甘露醇，8毫升水，800微升0.5摩爾/升氯化鉀，800微升0.5摩爾/升脂肪酸甲酯磺酸鹽(pH5. 7)和400微升0.5摩爾/升氯化鈣，充分溶解酶液後將其倒入50毫升離心管，並加入已洗好的菌絲，25攝氏度下40轉/分鐘酶解45-60分鐘；
4)用兩層孔徑22-25 微米的濾膜(Miracloth. Calbiochem, La Jolla, CA)和燒杯過濾收集原生質體，收集好以後倒入新的離心管中，1500轉/分鐘，3分鐘後輕輕倒掉上清液；
5)用35毫升W5溶液(154毫摩爾氯化鈉，125毫摩爾氯化鈣，5毫摩爾氯化鉀，毫摩爾葡萄糖，PH 5. 8))洗滌原生質體，1500轉/分鐘，4分鐘後輕輕倒掉上清液；
6)用5毫升W5溶液重懸原生質體至濃度為2X IO6個/毫升，冰置30分鐘後1500轉/分鐘，離心4分鐘，輕輕倒掉上清液；
7)用5毫升W5溶液重懸原生質體，室溫放置10分鐘；
8)取新的離心管放於冰上，在管底加入3-4微升的pTH209質粒；
9)在每個含有質粒的離心管中加入I毫升原生質體，冰置5-10分鐘；
10)每個離心管加I. 74毫升聚乙二醇，分三次加入，每次580微升，輕輕混勻，冰置20分鐘；
11)將離心管中液體倒入準備好的培養皿中，25°C靜置培養過夜；
12)將培養皿中的液體吸進50毫升離心管，每分鐘2000轉離心5分鐘後吸去上清，剩餘2毫升左右液體；
13)將15毫升準備好的培養基倒入離心管，混勻後倒入培養皿中25攝氏度黑暗培養。PsMYBl沉默突變體的表型分析
利用聚乙二醇介導的原生質體穩定轉化的方法將該基因沉默後進行基因功能分析，篩選得到了四個沉默的突變體，分別編號為M3、M9、M10和M16。相比較野生型的受體菌株(WT)和對照菌株(CK)J1Si^W在四個沉默突變體中的表達量分別為M3為5. 6%、M9為20. 9%, MlO 為 O. 3% 和 M16 為 O. 7%，參見圖 3。PsMybl基因沉默突變體中卵孢子的形成受到影響，PsMybl沉默突變體產生極少量的卵孢子，參見圖4。分別切取2X2釐米的瓊脂塊測定卵孢子產量，結果表明沉默突變體的卵孢子產量明顯下降，參見圖5。本領域的技術人員應當明了，儘管為了舉例說明的目的描述了本發明的具體實施方案，但可以對其進行各種修改而不偏離本發明的精神和範圍。因此，本發明的具體實施方 案和實例不應當視為限制本發明的範圍。本發明僅受所附權利要求的限制。本申請中引用的所有文獻均完整地併入本文作為參考。
權利要求
1.大醜疫黴卵孢子發育相關轉錄因子基因的用途，大醜疫黴Myb轉錄因子基因為SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；大豆疫黴Myb轉錄因子基因的蛋白質為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列，其特徵在於大豆疫黴Myb轉錄因子基因的用途作為殺菌劑的作用靶標。
全文摘要
本發明涉及分子生物學、基因工程技術領域，具體為大豆疫黴卵孢子發育相關轉錄因子Myb基因的用途。其具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列。大豆疫黴Myb轉錄因子PsMyb1基因為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；大豆疫黴Myb轉錄因子PsMyb1基因的蛋白質為SEQIDNO.2所示的胺基酸序列，本發明PsMyb1基因的主要作用是能夠調控其靶基因轉錄，控制大豆疫黴卵孢子的發育。本發明提供的基因在控制大豆疫黴根腐病中具有很高的應用價值，以該基因為作用靶標，開發的殺菌劑對控制大豆疫黴根腐病的發生與流行具有重要的實踐意義。
文檔編號C12N15/31GK102776207SQ20121019996
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者杜家亮, 王子迎, 王朝霞 申請人:合肥師範學院