一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法
2023-04-23 17:20:56
專利名稱：一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法
技術領域：
本發明涉及一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法，涉及低溫生物學和地球氣候學等領域。
現有的各種基因庫、低溫保存庫、組織庫都是從近期的經濟利益出發而籌建的，凍存的生物樣品大多用於臨床醫療，農林業生產；都是採用人工製冷，要耗費大量電力，運營費用高。因花費很大，迫使一些基因庫削減或關閉。從實用和成本核算的角度出發，其生物樣品的凍存期都是以月或年計的，甚至以天計。由於具有針對性，其庫容必然不大，且只存有少數幾種專用的生物樣品。由於基因庫採用人工製冷，依賴安全的電力供應，不能斷電，存在著很大不安全性，一次斷電，一次人為疏失，都會使生物樣品全部毀壞。古今中外，每個朝代在當時都有大量書籍存世，其中有很多是國家級的藏書閣或圖書館，但經歷了人世間無數的戰亂，人禍天災，到現在存世的古籍已寥寥無幾了，這是人類的重大損失。我們知道，凍存生物樣品比保存書籍難度高百倍，凍存環境要求苛刻。從歷史的角度看，易存的書籍尚難留傳後世，那難存的生物樣品就更難保存下來，造福於子孫萬代。所以要將地球物種基因和生物樣品長期保存起來，有兩個必要條件1、天然的製冷源，如南極洲、格陵蘭島；2、保存在人跡罕至，沒有戰亂人禍的地區。
本發明的目的是提供一種長期保存地球上所有物種基因和生物樣品的方法，這種方法具有保存期長、庫容大、免費、安全的優點。
本發明的目的是這樣實現的一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法，它的操作流程分「預凍」和「永凍」兩部分；「預凍」有四種方法(1)將生物材料放在含有低溫保護劑的溶液或保存液中，接著放入-25—-80℃的冰箱中冷凍。如生物樣品體積過大，則存於冰庫中，下同。
(2)將生物材料直接放入-25—-80℃的冰箱中冷凍。
(3)將生物材料放在含有低溫保護劑的溶液或保存液中，接著放在-80—-196℃的低溫環境中冷凍，凍結後再轉存於-25—-80℃的冰箱中。
(4)將生物材料冷凍乾燥後密封，再放入-10—-80℃的冰箱中冷凍。
上述生物材料包括地球上所有種類動物的組織、器官、細胞、胚胎、精子、卵子及完整的動物機體，還包括地球上所有種類植物的組織、器官、細胞、根、莖、葉、花、果實、種子及完整的植株；還包括細菌、酵母菌、黴菌、藻類、原生動物和病毒、立克次氏體、噬菌體、放線菌、支原體、衣原體在內的地球上所有種類微生物。
上述低溫保護劑包括甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙二醇(EG)、乙醯胺、蔗糖、羥乙基澱粉(HES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、白蛋白、丙二醇、葡聚糖(右旋糖酐dextrane)，聚乙二醇(PEG)、丙氨酸、醋酸銨、氯仿、可溶性澱粉、明膠、棉子糖、牛血清蛋白、血紅蛋白、膽鹼、二甘醇、二甲基乙醯胺、赤蘚醇、乙醇、甲醯胺、葡萄糖、α-磷酸甘油、單乙酸甘油酯、甘氨酸、肌醇、乳糖、氯化鎂、硫酸鎂、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲基乙醯胺、甲基甲醯胺、甲基尿素、苯酚、尿素、聚乙烯二醇、脯氨酸、1.2-丙二醇、吡啶-N一氧化物、核糖、絲氨酸、溴化鈉、氯化鈉、碘化鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、硫酸鈉、山梨糖醇、三甘醇、三甲胺乙酸、木糖、纈氨酸。
上述保存液的組成分以下三種(1)電解質平衡鹽溶液，包括仿胞內型溶液和仿胞外型溶液，溶液中含有NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、NaHCO3、KH2PO4。
(2)高滲溶液，一般選用葡萄糖、甘露醇、蔗糖作為高滲劑。
(3)營養液，含有如胺基酸、核苷類、葡萄糖一類的營養物質，還可添加抗生素。第二部分永凍將經「預凍」流程所得的生物樣品放進箱子，裝上飛機或輪船，運到南極洲或格陵蘭島的冰蓋上永久凍存起來。最佳放置地點是以南極洲「酷寒極」(82°3′S、65°7′E)為中心的50萬平方公裡範圍內，那裡一年中的最高溫度在-40℃左右，最低溫度在-95℃左右。在這樣低的溫度下，一塊鋼塊掉在地上就會摔得粉碎，一杯熱水潑到空中，落下來就變成了冰雹，是地球上最寒冷、乾燥的地區，是最適合永久凍存地球物種基因及生物樣品的地方。
每種生物樣品都含有該生物的基因，本文之所以將生物樣品和物種基因分列，是因本發明能將鯨、象等大型生物的整個機體長期凍存在基因庫中，這在以前因費用高而很難實現，本發明遠遠超出了單單凍存物種基因的範疇。
以下先描述南極的一些情況。
「酷寒極」是指離南極周圍海岸線最遠的點，就是以82°3′S，65°7′E為中心的一個地區，其高程為4300米，冰蓋的厚度超過4000米。
南極洲總面積約1360萬平方公裡，其95％以上面積被冰雹覆蓋著。南極冰蓋面積約1200萬平方公裡，大致等於美國和墨西哥陸地面積之和，平均厚度2450米，體積達2400萬立方公裡，是地球上最大的冰庫，是地球的「冷凝器」。南極內陸的年平均溫度在-30—-55℃之間，東南極中心地區(即「地球物種基因庫」擬建地區)的年平均溫度為-57.5℃。在該地區的俄羅斯東方站(78°27′S，106°51′E)已記錄到-89.2℃的世界最低溫，東方站的海拔高度是3488米，而「酷寒極」的海拔高度是4300米，根據「海拔每升高100米，年平均氣溫下降1℃以上」的規律，可知「酷寒極」的最低溫在-95℃左右。東方站的年氣溫在-33—-70℃之間變成，以此可推算出「酷寒極」的年氣溫在-40—-80℃之間。南極冰蓋在南極點附近的流動速度為每年10米，在內陸高原地區，由於地形平坦，冰的運動速度更小，東方站每年只移動1米，可知「酷寒極」的冰蓋每年只移動0.5--1米。從南極大陸中心流動而來的冰到達大陸邊緣大約需要數十萬年之久。
南極和格陵蘭冰蓋的冰量佔地球上冰量的絕大部分，佔地球冰的覆蓋面積的97％，冰量大約可達到地球上淡水冰量的99％。
南極如此寒冷的主要原因是，在太陽完全不升起的極夜和太陽終日不落的白夜期間，太陽的平均高度低，單位面積的日照、輻射量小。其二是南極冰蓋上白雪對日照的反射率高達80-84％，來自太陽的能量相當大的一部分被反射掉了，剩下使地面變暖的部分不足20％，其三是南極地區的平均高程為2300米，是海拔最高的大陸。
南極大陸是世界上最乾燥的大陸。在海岸地區，年降雪量也只有600-1500毫米，相當於200-500毫米的雨水；在南極高原地區，年降水量在50毫米以下，跟非洲的撒哈拉大沙漠差不多，很多人稱它為「白色的沙漠」。在「南極點」年平均降水量為3毫米，年平均氣溫為-50℃，最低氣溫為-80℃，由此可知「酷寒極」的年平均降水量在3毫米以下。氣候的乾燥與溼潤是由空氣中水分含量的多少決定的，例如1立方米的空氣，在40℃時，需要51克水才能達到飽和狀態，在0℃時，5克水就能使它達到飽和狀態，到-40℃時，只需0.1克水就能使1立方米的空氣飽和，這樣在-50—-80℃的低溫下，飽和空氣中的水分就更加少。
南極的冰蓋，在冰層10米深處的冰溫很穩定，與當地的年平均氣溫一致，內陸高原的東方站為-60℃。
科學界早已證實，冷凍和復溫不改變核酸化學結構的完整性，能夠保持其遺傳學的完整性，能遺傳並表達性狀，DNA分子是完整的。依照光譜學理論計算的結果表明，嘌呤和嘧啶基之間連接緊密的籠形結構的水分子不會被冷凍陽復溫所改變，實驗證明，冷凍和復溫不能打破脫氧核糖核酸(DNA)的雙螺旋結構。-25℃—-30℃的低溫凍結就能使生物材料達到保存的目的。所以南極內陸地區的低溫對於凍存物種基因並保證其質量是綽綽有餘的。最近，有科學家激活了已冷凍2.5億年的細菌，這有力說明了冷凍能長期保持生物基因的完整性。
本發明具有四種優點1、庫容大單單南極洲就有1000萬平方公裡以上的冰蓋地區適合永久凍存地球物種基因和生物樣品，相對於有限的地球物種，處於南極的「地球物種基因庫」的庫容是無限的，再多的物種基因和生物樣品都存放得下。假設地球有1000萬種生物，每種生物樣品平均佔用3立方米的基因庫空間，地球所有生物的樣品加起來也只佔地30平方公裡(高度1米)，這點面積在南極洲是微不足道的。
2、免費現有的各種基因庫、低溫保存庫、組織庫都採用人工製冷，消耗大量電力，運營費用高，有一些基因庫因此而關閉。本發明採用天然低溫製冷源，即有「地球的冰庫，冷凝器」之稱的南極洲，無需電力，無運營費用。當生物樣品運抵南極基因庫後，就無需再花費任何費用，一千年後是如此，一千萬年後也是如此。
3、保存期長在2000萬年前，南極冰蓋開始形成，並延伸到大陸邊緣，到1000萬年前，南極冰蓋已經與現代冰蓋面積相差無幾了。從形成之後到今天還沒有發生過全局性的大變遷，這說明南極冰蓋是相當穩定的，是長期冰存地球物種基因和生物樣品的最佳地點，保存期長達幾千萬年，甚至幾億年以上。現在我們處於地球氣候較溫暖的間冰期，在間冰期之後是冰期，那時南極的冰蓋還會增厚、擴大，溫度更低。
4、安全本發明採用天然製冷源(如南極)，無斷電或其它人為疏失，而且遠離人世間的戰亂人禍，與現有基因庫、低溫保存庫相比，它的安全係數是極高的。本發明的積極意義1、保護生物多樣性，保護地球生態環境(1)地球生物多樣性的現狀生物多樣性資源是大自然恩賜於人類的最寶貴的財富。依靠地球得天獨厚的生物多樣性資源，人類社會得以產生、存在和發展，直至形成今日這個五彩繽紛的世界。但是，人口的劇烈增長和大規模的經濟活動正使許多物種滅絕，生態系統遭受破壞，逐漸地而且堅定不移地耗蝕著人類賴以生存和發展的基礎—-生物多樣性。目前，生物多樣性損失問題愈演愈烈，成為維持人類社會持續發展面臨的最重大威脅，生物多樣性保護問題亦變得日益普遍化，制度化和國際化，成為最大的全球性環境問題。
由於當代經濟發展所帶來的環境汙染和過度的土地利用，目前生物資源特別是生物多樣性受到比過去任何時期都更為嚴重的威脅，無法再現的基因、物種和生態系統多樣性正在加速滅絕，對人類的生存和發展構成了嚴重的威脅。當一個基因庫因當代人為最大限度地滿足個人利益而被驅向絕滅時，所有的子孫後代都將為之付出代價。
生物多樣性在增強我們行星的生物生產力方面，為在可持續基礎上取得進一步發展提供了基礎。這個基礎的基石是包含在植物和動物種內的基因，而基因通過其多樣性可使所有生物能適應於變化著的環境。
在分子生物學和基因工程方面的最新進展已為轉移基因越過性別屏障開闢了新的機會，因而，基因工程已經增加了我們已繼承的豐富遺傳財產的價值，保護野生動、植物種基因的需要也已因此變得更加迫切。這些物種中的許多可被人們極度地懷念，一個戲劇性的例子是野生水稻的種群，這是僅有的一個能抗草叢短縮病病毒的資源。
(2)生物資源的價值地球上所有的生物，包括動物、植物和微生物，不管它們的使用價值已被發現還是暫時沒有發現，最終都組成了生物資源，這些生物資源支撐著人類的生存和發展，物種多樣性的減少必然會危及人類賴以生存的生物資源。
例如，人類的所有食品來源於生物，而醫藥和工業的很大一部分原料來源於野生生物。在美國，每年從野生生物中獲得的產值達3000億美元，佔工業生產的15％。在發展中國家，農業生產一般佔到國內生產總值的32％。
傳統醫藥大約為全球80％的人提供了起碼的醫藥，僅中藥就使用了5100種動植物。大量的現代藥品中的有效成份來源於植物。在美國，1/4的處方中含有植物的提取物，在所有的20種最暢銷的藥品中都含有從動物、植物和微生物中提取的化合物。3000多種醫用抗生素都來源於微生物。
遺傳多樣性對農業的作用是巨大的，許多優良品種大多是通過遺傳選育培育出來的。在農作物和家畜中發現了許多抗病基因、抗蟲基因和高產基因，通過遺傳育種，獲得了抗病、抗蟲、生活力強、高產的品種，大大提高了農業的產量，在很大程度上使人們擺脫了飢餓。如印度在水稻的野外近緣種中發現了抗褐色跳蟲的基因，從而培育出高產的抗蟲水稻新品種。中國的雜交水稻聞名於世，也是利用了許多水稻的遺傳變異培育而成。
生物多樣性更重要的意義是為人類的未來生存提供了機會。隨著時間的推移，地球的環境在不斷地變化，但在生物中也隱藏著巨大的基因寶庫，使生物產生無限的變異，更好地適應未來環境的變化，一旦失去這樣一個寶庫，後果將不堪設想。多樣化的遺傳基因，物種和生態系統為人類提供了一種能隨著人類需求和環境變化而變化的資源。
遺傳多樣性喪失的後果極其嚴重，1991年巴西的桔子樹的遺傳相似性導致了歷史上最大規模的柑桔大潰爛，而美國1970年由於種植易感病的玉米品種造成病害大爆發損失了數十億美元。
我們大多數醫藥起先都來自於野外，包括我們主要的止痛片、避孕劑和瘧疾藥。在印度，傳統的印醫利用2500種植物。奎寧、洋地黃和嗎啡依然來自植物。世界上許多醫藥大多是從植物、動物或微生物提取有用的物質製成或以天然化學物質作為模式合成。熱帶地區的物種是特別重要的醫藥來源，對植物來說，部分原因是由於它們含有大量有毒的化合物，而許多有活力的醫藥化合物就來自這些毒素。蘿芙木(Rauvol fia pentina)(抗高血壓藥)、墨西哥薯蕷(DioscoreaComposita)(類固醇)、和長春花(Catharanthus roseus)(抗癌藥)就是三種經過長期實踐證明是重要的熱帶藥用植物。世界衛生組織正式確定了20000種藥用植物，其中只有200種作過較詳盡的研究。可見，植物多樣性作為豐富的植物資源，具有很大的開發潛力。許多抗微生物、抗病毒、心臟活性物質、神經生理活質是從有毒的海洋動物中得到的。各種節肢動物的毒液具有醫藥的潛力。迄今，大約從植物中提取並確定了20000個化合物，這是其中一個極小的部分。例如，抗癌的生物鹼長春新鹼、環類丙烷、除蟲菊脂殺蟲劑、荼醌根色素二羥基羥甲戊烯基荼二酮、類單萜香料(玫瑰油)等。
生物資源是極其珍貴的自然資源，也是全人類的共同財富，它們為人類的生存和發展提供了最基本的條件，如日常生活中的食品、燃料、藥物、糧食、禽畜、果蔬和工農業原材料等，均來自生物資源。
環境科學家認為，地球上至少有8萬種植物可供人類食用，可現在利用的只有3000多種。通過對生物基因的開發研究，能培育出許多前所未有的優良新品種，以滿足人類曰益增長的各方面的需要，但我們不能創造基因，所以生物基因資源是無價之寶。
遺憾的是，現在每年大約有4萬種生物從地球上消失，也就是每天有100種生物滅絕，近二十年來，從地球上消失的物種已達到50-100萬種。
假如在南極凍存有地球幾億年來各種古生物的組織樣本，假如在南極凍存有完整的恐龍機體，對於今日的人類來說，就是無價之寶。同理，自工業革命後因人類活動而造成地球生態環境惡化，大量物種滅絕，在今日我們唾手可得的生物基因，對於我們的子孫後代來說就是無價珍寶。我們當今人類有責任將這些物種基因保存起來，留給我們的子孫後代。由於我們處於科技發展的初期(人類科技得到較快發展才是近百年的事)，因技術局限和無知，人類嚴重破壞了地球的生態環境，危害到地球上絕大部分生物。為了人類社會的可持續發展，為了我們子孫萬代的幸福，保存今日地球的物種基因，是我們當代人最緊迫的重大任務。
青黴素等3000多種抗生素都是用自然界中的微生物資源製成，我們食用的小麥、水稻都是大自然所賜的寶貴生物資源，如果古代人類在沒有發現它們的價值之前，就使其滅絕，那麼對現代人類來說就是一種巨大損失。現在我們還處在基因工程技術、生物技術發展的初期，我們對生物、生命奧秘的認知是很初級的，我們不能在發現地球眾多物種的巨大價值之前，就使其在地球上滅絕了，連生物基因及生物樣品都沒有留下來，這對我們的子孫後代來說一種何其巨大的損失，若此，我們將愧對我們的子孫。
本發明能將地球生物基因資源長期保存起來，等到未來生物工程技術大發展時，人類利用這些生物基因可以組合創造出無窮盡的高價值新產品、新生物，就象二十六個英文字母可以組合出無窮個新英語詞彙。
(3)地球物種滅絕的現狀與趨勢生物多樣性給人類帶來無與倫比和不可替代的好處，這種利益正隨著科學技術的發展和人類文明的進步而日益增加。然而，全球生物圈面臨空前巨大的人口壓力和經濟開發的壓力，造成生物多樣性日益減少。在許多地方已發生的物種滅絕情況是觸目驚心的，足以給我們敲響警鐘，保護生物多樣性已是一件全球關注、刻不容緩的大事業。
在1985年國際自然保護同盟和世界野生生物基金會在加那利島拉斯帕爾馬斯會議上，提出受威脅的植物已達6萬種之多，並認為到2050年，地球上會有1/4或1/5的植物將消亡。在今後二三十年中，全球有100萬種物種將受到威脅，植物尤其處於危險之中，其中包括約26.5萬種已知植物。目前已知的18.5萬種熱帶植物中，70％會在今後25年內消失。
在1990年時有人估計，全世界大約10％植物受到滅絕的危險，到2000年，在所有植物中，16-25％行將滅絕。據世界野生生物基金會預測，到2000年已有50萬到200萬物種在地球上消失，佔地球物種總數的15-20％。人類只能利用而不能創造物種和基因，而一個新物種的進化需要2千到10萬代，因而物種損失是一種不可彌補的損失。
在1990-2020年間，由於熱帶森林的砍伐所引起的物種滅絕，可能導致5-15％的世界物種消失，按地球的物種有1000萬來計算，每年可能有15000-50000個物種滅絕。這個分析與應用其它方法作出的物種滅絕速度預測基本一致。這些研究表明，如果目前的滅絕趨勢繼續下去，從2000-2025年，地球每10年大約有5-10％的物種將要消失。
造成物種滅絕的首要原因是人為活動破壞了生物的生境，其次，狂捕濫獵和環境汙染，也是造成一些高經濟價值生物和敏感生物滅絕的重要原因。由於人為原因造成滅絕物種的數量，比物種在自然進化過程中被淘汰的數量，至少要高出2.5萬倍。
以上數據均摘自國際權威機構的報告。
(4)本發明的作用本發明能將地球上所有物種基因及生物樣品保存長達幾千萬至幾億年之久，等於是長期保存了地球物種的遺傳多樣性、物種多樣性，當某物種在地球生態系統中滅絕時，我們的子孫後代就能從本基因庫中取出該物種基因，用克隆技術重新恢復該物種，從而維護了生態系統多樣性。本發明能從遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性三個層次全面維護地球的生物多樣性。因此，本發明對保護地球生態環境具有重要意義。
二、維護人類社會可持續發展所謂可持續發展，就是既要考慮當前發展的需要，又要考慮未來發展的需要，不要以犧牲後代人的利益為代價來滿足當代人的利益。
在具體內容方面，可持續發展涉及可持續經濟，可持續生態和可持續社會三方面的協調統一。其中經濟可持續是基礎，生態可持續是條件，社會可持續是目的。建立「地球物種基因庫」可使億萬年後的地球人類都能享受到我們為他們準備的極其豐富珍貴的地球生物資源，實現自然生態、經濟可持續發展，從而維護人類社會的可持續發展。
隨著地球人口的激增，解決未來人類的吃飯穿衣問題，必須依靠地球生物基因資源，必須依靠生物工程技術，沒有這些何談可持續的人類社會。
生物技術具有高效、低耗、環保等多種優點，在今後相當長的時期內，生物技術將在人類的社會生產中佔主導位置。
可持續發展的一項基本原則是「代際間的公平」即世代平等，要認識到人類賴以生存的自然資源是有限的。本代人不能因為自已的發展與需求而損害人類世世代代滿足需求的條件—自然生物資源，要給世世代代的公平利用自然生物資源的權利。本發明能為地球人類世世代代提供豐富的自然生物資源。從生物技術、基因技術的發展方向看，我們的子孫萬代都可利用本基因庫的生物基因創造出無窮的高價值新產品，只要人類在向本基因庫索取生物基因的同時，也向本庫補充新發現的生物基因，達到持續利用的目的。
本發明還具有其它的環保意義，它不僅保護了地球的生物多樣性，維護了人類社會的可持續發展，而且在幾千萬年的運營過程中不消耗電力，等於消除了在生產電力過程中產生的大量有害物質排放。而且基因庫本身有利於南極的環境保護，能反射掉更多的太陽能量，有利於南極保持低溫(詳見實施例)。
大自然具有自我調節能力，各類生態系統互相協調，形成了地球生態圈，南極和包括格陵蘭島在內的北極是這種生態圈中的重要一環，在南北極永久凍存地球物種基因，將使地球生態圈更加完善，使地球生命更具韌性。
下面結合實施例對本發明作一步說明。
一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法，它的操作流程分「預凍」和「永凍」兩部分。
「預凍」有四種方法1、將生物材料放在含有低溫保護劑的溶液或保存液中，接著放入-25—-80℃的箱中冷凍。
實施例①將自然死亡的金絲猴的整個機體放入1.4mol/L Me2SO的溶液中，然後放在-80℃的冰箱中冷凍。如生物樣品體積過大，則存於冰庫中，下同。
②將金花茶(國家一級保護植物)的整個植株浸在10％的DMSO溶液中(DMSO用液體培養基配製)，然後放在-40℃的冰箱中冷凍。
③收集酵母菌後，將它放入濃度為7％的DMSO(二甲基亞碸)的溶液中，然後放在-40℃的冰箱中冷凍。
2、將生物材料直接放入-25—-80℃的冰箱中冷凍。
實施例①將自然死亡的大熊貓屍體，打上標籤，直接放入-80℃的冰箱中冷凍。
②將株高5米的銀杉(國家一級保護植物)鋸成5段，打上標籤，直接放入-40℃的冰箱中冷凍。
③收集青黴菌後，將它直接放入-40℃的冰箱中冷凍。
3、將生物材料放在含有低溫保護劑的溶液或保存液中，接著放在-80—-196℃的低溫環境中冷凍，凍結後再轉存於-25—-80℃的冰箱中。
實施例A、羊胚的預凍(1)將羊胚用PBS液(含10％胎牛血清)漂洗2次，分別用0.25mol/L、0.50mol/L、0.75mol/L、1.25mol/L、1.5mol/L的DMSO液處理，使其充分平衡，其間停5-10分鐘。
(2)移取3個用DMSO保護劑平衡後的胚加到0.25ml容量的塑料凍存袋中，緩緩滴加1.5mol/L的DMSO液於袋中，使其充分浸泡胚，加熱封口，於室溫放置10分鐘。
(3)將胚袋置程控降溫儀冷凍室內，快速降溫至-7.0℃，保溫10分鐘，誘導冰核形成，然後以-0.6℃/min的速率降溫至-35℃，將胚袋快速投入-196℃液氮中冷凍1小時。
(4)胚袋凍結後，將胚袋從液氮中取出，轉存於-80℃的冰箱中。
B、蘋果莖尖(植物組織)的預凍(1)玻璃化溶液(VS)的製備①VS貯備液甘油(V/V)30％，乙二醇(V/V)15％，DMSO(V/V)15％，標準培養液(含0.15mol/L蔗糖)100ml。
②VS平衡液(60％)VS貯備液(V/V)60ml，標準培養液(含0.4mol/L蔗糖)40ml。
③洗滌液含1.2mol/L蔗糖的標準培養液100ml。
(2)材料的預處理①挑取蘋果芽尖到2ml容積的冷凍管中，加1mlVS平衡液(60％)浸泡芽尖；②將芽尖於25℃平衡5-20分鐘；③移去VS平衡液，加1mlVS貯備液(100％)，芽尖應充分浸泡在VS液中；④將芽尖置冰浴中放置10分鐘；(3)蘋果芽尖冰浴後，直接投入-196℃液氮中進行玻璃化凍存1小時；(4)當蘋果芽尖凍結後，再轉存於-80℃的冰箱中。
4、將生物材料冷凍乾燥後密封，再放入-10—-80℃的冰箱中冷凍。
實施例放線菌預凍(1)菌懸液製備①菌齡的選擇菌齡的長短影響凍幹的效果。一般而言，產孢子菌種以凍幹保存孢子為宜，不產孢子菌種則以對數生長後期的菌體最佳。適時收集菌體可提高凍幹後的存活率。
②集菌按常規收集菌體(或孢子)，用無菌生理鹽水或磷酸緩衝液(0.1mol/L，pH7.2)洗滌，除去殘餘的培養基成分及代謝產物，3500r/min離心，棄上清液，收集菌體備用。
③懸浮菌體將收集的菌體或孢子用20％(W/V)的無菌脫脂牛奶或其他保護劑懸浮，要充分吸打菌體，製成均勻的菌體或單孢子懸浮液，濃度為108～109/ml。
(2)分裝安瓿用無菌操作分裝菌液到安瓿中，每支0.2ml，分裝採用巴氏吸管或微量進樣器。操作儘可能快，減少菌液在室溫的存放時間。
(3)降溫將樣品安瓿置於4℃30分鐘，-30℃30分鐘，-70℃2小時。
(4)凍幹將樣品安瓿放入凍幹機進行凍幹，凍室溫度-50℃，真空度為0.02Mbr，時間為9小時。
(5)密封菌種安瓿凍幹後，進行真空封口，封口前後的安瓿用真空檢測計檢測真空度，確保安瓿內處於真空狀態。
(6)密封后，將菌種安瓿存於-10℃的冰箱中。
上述低溫保護劑包括甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙二醇、乙醯胺、蔗糖、羥乙基澱粉(HES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、白蛋白、丙二醇、葡聚糖(右旋糖酐dextrane)、聚乙二醇(PEG)、丙氨酸、醋酸銨、氯仿、可溶性澱粉、明膠、棉子糖、牛血清蛋白、血紅蛋白、膽鹼、二甘醇、二甲基乙醯胺、赤蘚醇、乙醇、甲醯胺、葡萄糖、α-磷酸甘油、單乙酸甘油酯、甘氨酸、肌醇、乳糖、氯化鎂、硫酸鎂、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲基乙醯胺、甲基甲醯胺、甲基尿素、苯酚、尿素、聚乙烯二醇、脯氨酸、1.2-丙二醇、吡啶-N-氧化物、核糖、絲氨酸、溴化鈉、氯化鈉、碘化鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、硫酸鈉、山梨糖醇、三甘醇、三甲胺乙酸、木糖、纈氨酸。
可溶性澱粉的再結晶溫度為-5℃，明膠為-11℃、羥乙基澱粉(HES)-21℃，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-22℃，白蛋白-10℃，牛血清蛋白(BSA)-5.3℃，血紅蛋白-3.5℃；以上是一些水溶液的再結晶溫度，T只與溶質的性質有關，而與溶液的濃度無關，至少在30％＜W＜50％的濃度範圍內是如此。使用這些低溫保護劑可解決生物樣品在溫度上升時的再結晶問題。在南極內陸中心地區的年最高氣溫在-30℃左右，還遠未及水溶液的再結晶溫度，達到防止因再結晶而損傷生物細胞膜的目的。
上述保存液的組成分以下三種(1)電解質平衡鹽溶液，包括仿胞內型溶液和仿胞外型溶液，溶液中含有NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、NaHCO3、KH2PO4。
(2)高滲溶液，一般選用葡萄糖、甘露醇、蔗糖作為高滲劑。
(3)營養液，含有如胺基酸、核苷類、葡萄糖一類的營養物質，還可添加抗生素。
上述生物材料包括地球上所有種類動物的組織、器官、細胞、胚胎、精子、卵子及完整的動物機體，還包括地球上所有種類植物的組織、器官、細胞、根、莖、葉、花、果實、種子及完整的植株；還包括細菌、酵母菌、黴菌、藻類、原生動物和病毒、立克次氏體、噬菌體、放線菌、支原體、衣原體在內的地球上所有種類微生物。
關於每種生物的樣品數量，用最小生存種群的計算方法，得出最小值為500份。由於本基因庫庫容大，生物樣品數量不設上限，一般在1000-20000份之間。如果某瀕危物種已不足500隻，則將儘可能多的樣品存於庫中，一般需超過50份。根據研究，如果種群中雜合子喪失40-50％，即達到一個物種能生存的極限。
本發明中第一、二種「預凍」方法為常用方法，且從長期凍存(一千年以上)的角度看，四種方法在保存物種基因方面的效果差不多，用第三、四種「預凍」方法製成的生物樣品在一百年內，其凍存質量要高於前兩種方法。
發揮南極基因庫庫容大、免費的優勢，可將在現有基因庫無法實施凍存的大體積生物材料，如鯨、象等大型動物的整個機體，大型植物的整個植株，都可以在「南極基因庫」實施長期凍存。同時植物種子、動物精液、卵子、胚胎也佔較大比重。
關於植物種子的短期(50-200年)凍存，既可在南極洲與格陵蘭島凍存，也可在北極圈與南極圈內的其它地區凍存，也可在如喜馬拉雅山和阿爾卑斯等高山冰川中凍存。「種質資源短期庫」內相對溼度＜60％，種子含水量5％±1％，並封入不透氣的容器內。
本發明的第二部分永凍將經「預凍」流程所得的生物樣品放進1-2立方米的方形箱子，箱子表面有銀色反光塗層，箱門在箱子頂部，便於存取生物樣品，稱為「永凍箱」。再將「永凍箱」放進一個方形的「保溫隔熱箱」內，並在裝有生物樣品的永凍箱內灑滿乾冰(固體CO2、-79℃)。將「保溫隔熱箱」裝上飛機，運至南極洲的「酷寒極」附近(82°3′S、65°7′E)，到達後將「永凍箱」從「保溫隔熱箱」中取出，並將眾多方形的「永凍箱」縱橫整齊地排列在「酷寒極」附近的冰蓋上。這種縱橫排列的結構非常穩定，箱子之間用液態水粘合，即將水倒入箱子間的縫隙中，在南極-40—-90℃的低溫下，水立刻凝結成冰，成為最理想的粘合劑。
永凍箱外的銀色塗層，用於反射太陽光，使永凍箱保持低溫，而眾多永凍箱組成的巨大銀色反光鏡面，能將更多的太陽光反射回太空，起到保護南極洲低溫環境的作用。我們知道銀色的反射率高於白色的南極冰蓋，所以設在南極洲的「地球物種基因庫」對南極洲的環境有利。
將所有凍存物種的詳細資料編輯成書(紙質)，同時將資料輸錄到光碟(CD)上，作為備份，書和CD的內容包括①入庫凍存的每一物種的詳細科研資料；②每個永凍箱內裝有哪幾種生物(永凍箱都有編號)。將書和CD放在其中幾個永凍箱內，以便我們的子孫後代查閱參考。
「地球物種基因庫」就是由上述眾多排列整齊的永凍箱組成。
在運輸「永凍箱」過程中，如果採用有冷凍裝置的飛機或輪船，則不用「保溫隔熱箱」。
現在，世界上有多個國家在對南極的考察中廣泛使用飛機，因覆蓋於南極洲之上的冰蓋，其冰面非常平坦，是天然的機場，如凱西機場、阿蒙森·斯科特機場、伯德機場和俄羅斯的東方機場。
基因庫以每年1米左右的速度隨冰蓋移動，一萬年後也只移動了10公裡，這在1300萬平方公裡的南極是微不足道的。對於我們的子孫後代來說，基因庫中的每種生物基因都是價值連城的珍寶，他們必然會將基因庫移回原處。
關於「地球物種基因庫」的籌建，建議由聯合國或其它國際權威機構、知名人士組織統籌，世界各國政府共同參與，成立「地球物種基因庫籌委會」，將本國或本地區的所有物種的基因樣品採集、冷凍後，分批運到南極內陸地區永久凍存起來。
也可由一國或幾國共同將本國的所有物種的基因樣品採集、冷凍後，運到南極凍存起來。《南極條約》支持這種造福全人類的、和平的科研行為，南極條約協商國當然具有這種科研行為的優先權，世界上其它非南極條約協商國也可申請並成為協商國，將寶貴的地球生物資源永久保存起來，造福於子孫萬代。
「地球物種基因庫」所冷存的生物資源是為一千—幾億年後的地球人類準備的，關於生物遺傳資源的歸屬問題，可參考《聯合國生物多樣性公約》，也可由各國政府商議後決定為一千年後的地球人類所共有。
建議邀請下列國際機構參與「地球物種基因庫」的組織籌建聯合國環境規劃署(UNEP)、國際自然與自然資源保護同盟(IUCN)，世界野生生物基金會(WWF)、自然保護國際(CI)、綠色和平組織、世界資源研究所(WRI)、聯合國糧農組織(FAO)、聯合國教科文組織(Unesco)、世界銀行、亞洲開發銀行。
權利要求
1.一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法，其特徵在於它的操作流程分「預凍」和「永凍」兩部分；「預凍」有四種方法(1)將生物材料放在含有低溫保護劑的溶液或保存液中，接著放入-25--80℃的冰箱中冷凍，如生物樣品體積過大，則存於冰庫中，下同；(2)將生物材料直接放入-25--80℃的冰箱中冷凍；(3)將生物材料放在含有低溫保護劑的溶液或保存液中，接著放在-80--196℃的低溫環境中冷凍，凍結後再轉存於-25--80℃的冰箱中；(4)將生物材料冷凍乾燥後密封，再放入-l0--80℃的冰箱中冷凍；上述生物材料包括地球上所有種類動物的組織、器官、細胞、胚胎、精子、卵子及完整的動物機體，還包括地球上所有種類植物的組織、器官、細胞、根、莖、葉、花、果實、種子及完整的植株，還包括細菌、酵母菌、黴菌、藻類、原生動物和病毒、立克次氏體、噬菌體、放線菌、支原體、衣原體在內的地球上所有種類微生物；上述低溫保護劑包括甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙二醇、乙醯胺、蔗糖、羥乙基澱粉(HES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、白蛋白、丙二醇、葡聚糖(右旋糖酐dextrane)、聚乙二醇(PEG)、丙氨酸、醋酸銨、氯仿、可溶性澱粉、明膠、棉子糖、牛血清蛋白、血紅蛋白、膽鹼、二甘醇、二甲基乙醯胺、赤蘚醇、乙醇、甲醯胺、葡萄糖、肌醇、α-磷酸甘油、單七酸甘油酯、甘氨酸、乳糖、氯化鎂、硫酸鎂、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲基乙醯胺、甲基甲醯胺、甲基尿素、苯酚、尿素、聚乙烯二醇、脯氨酸、1、2-丙二醇、吡啶-N-氧化物、核糖、絲氨酸、溴化鈉、氯化鈉、碘化鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、硫酸鈉、山梨糖醇、三甘醇、三甲胺乙酸、木糖、纈氨酸；上述保存液的組成分以下三種(1)電解質平衡鹽溶液，包括仿胞內型溶液和仿胞外型溶液，溶液中含有NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、NaHCO3、KH2PO4；(2)高滲溶液，選用葡萄糖、甘露醇、蔗糖作為高滲劑；(3)營養液，含有胺基酸、核苷類、葡萄糖一類的營養物質，還可添加抗生素；「永凍」部分的流程為將經「預凍」流程所得的生物樣品放進箱子，裝上飛機或輪船，運到南極洲或格陵蘭島的冰蓋上永久凍存起來。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於生物樣品的最佳放置地點是以南極洲「酷寒極」(82°3′S、65°7′E)為中心的50萬平方公裡範圍內。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於存放生物樣品的箱子的表面有銀色反光塗層。
全文摘要
本發明涉及一種長期保存地球所有物種基因和生物樣品的方法。在年平均溫度－55℃以下的南極洲內陸中心地區建立「地球物種基因庫」,將地球上所有物種基因和生物樣品都凍存在那裡。當某物種因人類活動而滅絕時,我們的子孫後代就能從庫中取出該物種基因,用「克隆」技術重新恢復該物種,保護地球生物多樣性,保護地球生態平衡,該方法具有「庫容大、保存期長、免費、安全」的優點。
文檔編號A01N1/00GK1305705SQ0110510
公開日2001年8月1日 申請日期2001年1月8日 優先權日2001年1月8日
發明者盧杲 申請人:盧杲