一種鑑定小麥低分子量谷蛋白亞基等位變異的質譜方法

2023-04-24 01:33:26 2

專利名稱：：一種鑑定小麥低分子量谷蛋白亞基等位變異的質譜方法
技術領域：
：本發明涉及生命科學蛋白質組
技術領域：
，特別是涉及一種鑑定小麥低分子量谷蛋白亞基等位變異的質譜方法以及基於此方法對麥谷蛋白亞基的進一步表徵。技術背景小麥(7V^'cwmae幼'vwwL.)是一種主要的糧食和飼料作物，應性強，分布廣，用途多，是世界上栽培面積最大、產量最高、地理分布最廣的重要農作物之一，在中國，小麥的地位僅次於水稻，小麥是世界上最早栽培的植物之一。小麥是人類重要的植物蛋白質來源，被廣泛應用於食品加工與家畜飼養上，適於製作麵包、麵條、饅頭、餅乾、糕點等多種食品，也是釀酒、飼料、醫藥、調味品等工業的主要原料。種子蛋白的組成和含量決定著小麥的營養品質和加工品質。Osbome等根據小麥蛋白質的溶解特性將籽粒蛋白分為4種類型，清蛋白(albumins)、球蛋白(globulins)、醇溶蛋白(Gliadins)和谷蛋白(Glutenins)。通常所說的小麥貯藏蛋白是指醇溶蛋白和麥谷蛋白，其中麥谷蛋白約佔貯藏蛋白的40%左右。還原條件下根據SDS-PAGE上的遷移率，麥谷蛋白明顯的分為兩種類型四個區域，即高分子量麥谷蛋白亞基和低分子量麥谷蛋白亞基，A、B、C和D四個區其中B、C和D三區為低分子量麥谷蛋白亞基區；B區是低分子量麥谷蛋白亞基的集中區，C區的蛋白與y-和a-醇溶蛋白重疊在一起，D區是遷移率介於a和b區之間的酸性蛋白，與co-醇溶蛋白位置相近。當然，這三個區域尤其是C區和D區還分別含有y、a和ro醇溶蛋白。在普通小麥中，低分子量谷蛋白亞基約佔麵筋含量的40%，其中有高達60%~70%的低分子量谷蛋白亞基與高分子量谷蛋白亞基一起構成小麥麵筋的基本骨架對品質具有重要作用，麵粉的延展性與LMW-GS總的數量相關，LMW-GS位點的等位變異與小麥的品質差異具有高度相關性。Luo等(2001)的研究發現，Glu-3位點的等位變異對小麥品質相關的技術參數具有顯著的影響，如麵粉蛋白含量、SDS沉澱值、子粒硬度等。Brett等用免疫技術驗證了LMW-GS對麵包加工品質的重要貢獻。也有硏究表明，LMW-GS位點對麵團黏彈性的作用以加性效應為主，同時存在位點間互作效應，LMW-GS位點的互作效應也影響小麥加工品質。有研究表明，G/m-S3位點的亞基比G/m"3和G/w-D3位點的亞基更能增加麵團的強度(PognaNE,RedaelliR，VaccinoP，BiancardiAM，PeruffoADB,CurioniA,MetakovskyEV，PagliaricciS.Produc-tionandgeneticcharacterizationofnear-isogeniclinesinthebread-wheatcultivarAlpe.TTzeorWca/"wdJ/jWedC7e"e^y,1995,90:650-658.)，LMW-GS間具有較高的同源性，但各亞基間的品質效應是有差異的。LMW-GS和麵團的抗延伸阻力和延展性相關，有些LMW-GS等位基因對品質的影響比HMW-GS還大。但是，在麵包小麥中，LMW-GS特殊的等位基因類型和品質參數間關係的報告經常出現相互矛盾的現象，可能是基因互作和環境影響造成的(BenedettelliS,MargiottaB,PorcedduE,CiaffiM,LaflandraD.EffectsofthelackofproteinscontrolledbygenesattheGli-Dl/Glu-D3locionthebreadmakingqualityofwheat.Jowrwia/o/Cerea/Sc/e"ce,1992,16:69-79.Nieto-TaladrizMT，PerretantMR,BouguennecA.EffectofgliadinsandHMWandLMWsubunitsofgluteninondoughpropertiesintheF6recombinantinbredlinesfromabreadwheatcross.7Tzeor"/ca/朋dJ一WG匿"cs,1994,88:81-88.)。小麥LMW-GS基因存在大量的等位變異，LMW-GS在數目及電泳遷移率上存在廣泛變異。Gupta和Shepherd用SDS-PAGE方法，分析了32個國家222個普通小麥品種，共發現40個不同的LMW-GS，根據亞基出現的互斥性規律，將這40個亞基分成20種、3組不同的電泳圖譜組合。Gupta和Shepherd用SDS-PAGE方法，共鑑定6個G/w-J3位點編碼(G/wJ3a,G/w-yOZ,G/w-^3c，G/w-^3AG/w畫J3e，G/w-^3/)，9個G/w-53位點編碼(G/w-S3a,G/w-536，G/w-53c,G/w-53山G/w畫S3。G/w-53/,G/w-53g，G/w-B3/z,G/w-5丄')，5個G/w-Z)3位點編碼(G/M-D3a,G/w-D36，G/w-D3c，G/w-D3d，(/w-Z)3e)。由此可見，低分子量谷蛋白亞基表現出豐富的遺傳變異。Branland等用SDS-PAGE鑑定了200份法國六倍體小麥，共鑑定5個G/M-^3位點編碼亞基(s，Z，Ae，/")，11個G/w-53位點編碼的亞基(a，Z，Z'，c，c'，Af，g，力，i，力，4個G/w-Z)3位點編碼的亞基U，6，c，d)(GuptaRB,ShepherdKW.Two-stepone-dimensionalSDS-PAGEanalysisofLMWsubunitsofglutenin.I.Variationandgeneticcontrolofthesubunitsinhexaploidwheats.7Tzeore"'ca/Ge"e"cs,1990a，80:65-74.GuptaRB,ShephardKW:Two-stepone-dimensionalSDS誦PAGEanalysisofLMWsubunitsofglutelin.II.Geneticcontrolofthesubunitsinspeciesrelatedtowheat.77eorWc<3/朋";//zWGewe"oy，1990b,80:183-187.BranlardG,DardevetM,AmiourN,IgrejasG.AllelicdiversityofHMWandLMWgluteninsubunitsandomegagliadinsinFrenchbreadwheat(7WWc應ae勸'v扁L.)Ge""/c/erown^朋dOop￡vo/z^/ow，2003,50:669—679.)。研究發現，小麥LMW-GS存在大量的等位變異，比HMW-GS更為豐富。六倍體麵包小麥中LMW-GS編碼基因的拷貝數在10-15到35-40個之間不等。豐富的LMW-GSG/M-3位點等位變異亞基類型將為普通小麥育種和改良小麥品質提供較多的優質候選亞基。由於LMW-GS的等位亞基類型存在廣泛的複雜變異和組合，還由於LMW-GS在SDS-PAGE圖譜上和醇溶蛋白互相重疊，導致目前只有小部分麵包小麥分析了其LMW-GS組成(JacksonEA,MorelMH，Sontag-StrohmT,BranlardG,MetakovskyEV,RedaelliR.ProposalforcombiningtheclassificationsystemsofallelesofGli-1andGlu-3lociinbreadwheat(7W"c謂ae幼'v謂L.).Jowr"a/o/<fe5ree&"g,1996,50:321-336.Fl&teN,E.S.2000.Allelicvariationatthestorageproteinloci(GYw-l,G7w-3,andinNorwegianwheats(7>"/cwmaesWvwmL.).Jowma/o/Ge"Wc&^^^g,54:283-291.)。因此，很有必要發展新型的分離鑑定方法來加快低分子量谷蛋白亞基的研究。SDS-PAGE是分析LMW-GS組分的常規方法，但由於LMW-GS拷貝數較多，G/M-3的等位變異亞基較為複雜，且分子量較小，在SDS-PAGE圖譜中經常與醇溶蛋白重疊在一起難於分辨等原因，使得LMW-GS的相關研究遠低於HMW-GS。
發明內容本發明的目的是提供一種鑑定低分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)等位變異的方法。本發明所提供的鑑定HMW-GS等位變異的方法，是用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對HMW-GS進行鑑定，根據蛋白特徵峰，確定低分子量谷蛋白亞基的等位變異。上述方法中，所述HMW-GS的提取方法包括以下步驟1)用體積百分含量為30-70%乙醇溶液除去小麥中的醇溶蛋白，取沉澱；2)在上述步驟l)獲得的沉澱中加入異丙醇溶液，60-70°C溫浴40-60min，取沉澱；3)在上述步驟2)獲得的沉澱中加入溶液A，30-50°C溫、浴50-60min;6所述溶液A由異丙醇、DTT、Tris-HCl和水組成；所述溶液A中，異丙醇的體積百分含量為50%，DTT的體積百分含量為1%，Tris-HCl的pH為8.0，Tris-HCl終濃度為80mM;4)在上述步驟3)的溶液中加入溶液B，50-60°C溫浴30-40min，取上清；所述溶液B由異丙醇、4-VP(4-乙烯基吡啶)、Tris-HCl和水組成；所述溶液B中，異丙醇的體積百分含量為50%,4-VP的體積百分含量為1.4%，Tris-HCl的pH為8.0，Tris-HCl的終濃度為80mM;5)在上述步驟4)獲得的上清中加入丙酮溶液，取沉澱，得到小麥低分子量谷蛋白亞基。上述方法中，所述步驟l)中，所述乙醇溶液為體積百分含量為70%的乙醇水溶液；上述的步驟2)中，所述異丙醇溶液為體積百分含量為55%的異丙醇水溶液；上述的步驟5)中，所述丙酮溶液為體積百分含量為80%的丙酮水溶液；上述的步驟2)中，所述溫浴的最佳條件為65。C溫浴50min;上述步驟3)中，所述溫浴的最佳條件為40。C溫浴55min;所述步驟4)中，所述溫浴的條件為55°C溫浴35min。上述方法還包括將所述低分子量谷蛋白亞基在上樣前進行預處理的步驟；所述預處理是將低分子量谷蛋白亞基溶於溶液C中；所述溶液C由乙腈、TFA和水組成；所述溶液C中，乙腈的體積百分含量為50%,TFA的體積百分含量為0.05%。上述方法中，所述低分子量谷蛋白亞基的上樣包括以下步驟將芥子酸溶液滴加到靶板的樣品孔內，待芥子酸溶液乾燥後，在樣品孔內再滴加預處理過的低分子量谷蛋白亞基溶液，待低分子量谷蛋白亞基溶液乾燥後，再在樣品孔內滴加芥子酸溶液。上述方法中，所述芥子酸溶液是將芥子酸溶解於所述溶液C中得到的，所述芥子酸溶液中，芥子酸的濃度為10mg/ml。具體應用時，所述基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀的參數設置如下(1)加速電壓25kV;(2)導絲電壓0.15%;(3)電網電壓94%;7(4)延遲時間950ns;(5)雷射功率1900-2400(step100);(6)分子量範圍10-50kDa;(7)Lowmassgate:10kDa;(8)DigitizerBinsize:4nsec;(9)輸入帶寬250MHz;(10)50lasershots/Massspectra,自動積累隨機模式。上述方法中，所述低分子量谷蛋白亞基等位變異的位點為低分子量谷蛋白亞基的G/m-J位點。目前，生物質譜主要用於解決兩個問題精確測定生物大分子，如蛋白質、核苷酸、糖類等的分子量，並提供其分子結構信息；對存在於生命複雜體系中的微量或痕量小分子生物活性物質進行定性或定量分析。對蛋白質類生物大分子分子量的測定有著十分重要的意義，如對均一蛋白質一級結構的測定，既要測定蛋白質的分子量，又要測定亞基和寡聚體的分子量，以及水解、酶解片段的分子量。常規的分子量測定主要有滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠層析及聚丙烯醯胺凝膠電泳等。這些方法存在樣品消耗量大，精確度低、易受蛋白質的形狀影響等缺點。本發明利用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)方法，可以快速測定小麥低分子量谷蛋白亞基的精確分子量，同時還可以鑑定小麥LMW-GS的Glu-3位點等位變異亞基的組成，本發明方法具有以下優點(1)所需樣品量少，具有高靈敏度和高質量檢測範圍，每次檢測所需樣品量約為l微升，濃度在pmol(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上，使準確地分析分子量高達幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能；(2)解析度高，可以準確獲得蛋白組分的準確分子量，甚至相差幾十個道爾頓也能很容易把兩個蛋白峰分開，這就不會造成蛋白組分之間的誤讀；可以檢測低豐度蛋白。(3)測定速度快，適宜高通量的分析，每個樣品的分析時間大約為5分鐘，適合大規模的品種快速鑑定，極大地方便了品種鑑定與遺傳育種等研究；(4)質量範圍寬，MALDI-TOF-MS有的質譜可測定生物大分子的分子量高達600KDa;(5)易於操作，自動化程度高；(6)結果保存分析容易。直接以圖片方式存貯，只需做簡單處理即可用於分析比較。對於小麥低分子量麥谷蛋白亞基而言，不同等位基因編碼的蛋白在SDS-PAGE電泳圖譜中具有1520條帶之多，LMW-GS的許多亞基具有相似的遷移率且各條帶之間相距很短，因此在SDS-PAGE圖譜中相互重合，而且SDS-PAGE鑑定的分子量不夠準確，對Glu-3位點亞基組成的分析相當困難。本發明的鑑定LMW-GS亞基等位變異的方法，可以快速提取、分離、鑑定大量樣品中的LMW-GS等位變異亞基，且操作簡單，解析度較高，為今後進一步研究LMW-GS的胺基酸序列、各亞基的功能、LMW-GS的遺傳及其與品質關係的研究、基因定位及對小麥加工品質的貢獻提供可靠的分析鑑定手段，因此具有廣闊的應用前景。本發明的鑑定低分子量谷蛋白亞基等位變異的方法，可以對LMW-GS進行精確的分子量測定以及利用建立的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)蛋白特徵峰的標準圖譜鑑定LMW-GS的等位變異。通過這一方法可以快速、準確的測定出小麥LMW-GS的分子量和不同小麥品種LMW-GS等位變異亞基的組成，為進一步研究LMW-GS的遺傳與生化特性以及LMW-GS對小麥加工品質的貢獻提供了強有力的技術手段，進而為小麥種子蛋白質組的深入研究奠定了基礎。本發明方法克服了傳統技術的不足，建立了LMW-GS的MALDI-TOF-MS鑑定方法，同時利用各種近等基因系、缺體四體等小麥遺傳材料，構建了17個G/"J3、G/w-53和G/w-Z^各位點等位變異亞基的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰的標準圖譜，對LMW-GS的G/w-A3、G/w-B3和G/w-D3的各個位點組成進行了鑑定，從而使MALDI-TOF-MS分析LMW-GS特別是G/w-3各個位點組成成為可能。真正實現了高通量、快速、準確鑑定小麥LMW-GS，為小麥的品質鑑定、遺傳育種等研究提供了強有力的技術支持。MALDI-TOF-MS是研究小麥蛋白質組的核心技術之一，具有分析速度快、靈敏度高、使用樣品少和高通量等優點。這一方法的建立，將為小麥的品種鑑定和遺傳育種提供強有力的技術支持。圖1為儀器參數優化前和優化後，普通六倍體小麥D1-13(98Y033)LMW-GS的MALDI-TOF-MS對比圖譜圖2為小麥LMW-GSG/w-^J/fl的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖3為小麥LMW-GSG/w-」3/6的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖4為小麥LMW-GSG/m"3/c的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖5為小麥LMW-GSG/M-W/d的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖6為小麥LMW-GSG/w-^3/e的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖7為小麥LMW-GSG/wJ3《的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖8為小麥LMW-GSG/w-W/a的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖9為小麥LMW-GS的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖10為小麥LMW-GS的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖11為小麥LMW-GS的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖12為小麥LMW-GSG/w-53《的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖13為小麥LMW-GSG/w-W/g的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖14為小麥LMW-GSG/w-5Mz的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖15為小麥LMW-GSG7w-D3/a的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖16為小麥LMW-GS的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖17為小麥LMW-GSG/w-Z)3/c的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖18為小麥LMW-GSG7w-Z^/d的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜圖19為小麥LMW-GSG/m-D^/"的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。下述實施例中，圖1-圖19中所有橫坐標表示質荷比(m/z)，所有縱坐標表示強度(％)。實施例1、LMW-GS的MALDI-TOF-MS鑑定方法與技術體系優化一、植物材料普通小麥(TW"cwmfle幼.vwmL.，AABBDD，2n=6x=42)Dl-13(98Y033)(來自澳大利亞阿德萊德籽粒品質研究實驗室，下面的實施例以該小麥為例，鑑定LMW-GS的等位變異，也可以用現有的其他小麥品種)。二、LMW-GS的提取及其上樣方法1)將15mg普通小麥(7W"cw附aeWTOmL.，AABBDD，2n=6x=42)Dl-13(98Y033)麵粉放入lml離心管中，加入lml體積百分含量為70。/。的乙醇，室溫渦旋30分鐘，然後10000rpm離心5min，除去上清;2)在上述步驟(1)獲得的沉澱中加入lml體積百分含量為55%的異丙醇溶液，混勻，65。C溫浴50min，然後10000rpm/min離心5min，除去上清；此步驟重複3次；3)在上述步驟(2)獲得的沉澱中加入150pl溶液A(溶液A中含有異丙醇、DTT、pH8.0的Tris-HCl和水；其中，異丙醇的體積百分含量為50%，DTT的體積百分含量為1%，Tris-HCl的終濃度為80mM)，混勻，40。C溫浴55min;4)在上述步驟(3)的溶液中加入150^1溶液B(溶液B中含有異丙醇、4-VP(4-乙烯基吡啶)、pH8.0的Tris-HCl和水;其中，異丙醇的體積百分含量為50%，4-VP的體積百分含量為1.4%，Tris-HCl的終濃度為80mM)，混勻，55。C溫浴35min，然後10000rpm/min離心10min，除去沉澱；5)取60pl上述步驟(4)獲得的上清液，在其中加入240pl-20。C預冷的體積百分含量為80%的丙酮溶液，-20。C沉澱1-2小時或者過夜，再10000rpm/min離心10min，棄上清，得到小麥低分子量谷蛋白亞基，將獲得的小麥低分子量谷蛋白亞基於室溫條件下乾燥備用。在上述獲得的小麥低分子量谷蛋白亞基中加入60^1溶液C(溶液C中含有乙腈、TFA和水，其中，乙腈的體積百分含量為50%，TFA的體積百分含量為0.05%)，室溫下溶液60分鐘，或者-20。C過夜，充分渦旋溶解後即可用於質譜分析。三、上樣方法先將0.7^10mg/ml的芥子酸(SA)滴加到靶板的樣品孔內，待SA乾燥後，在樣品孔內再滴加0.7^1上述步驟二製備的樣品，待樣品乾燥後，再在樣品孔內滴加0.7(il10mg/ml的SA。即三明治方式上樣0.7^1SA+0.7)xl樣品+0.7^1SA。待樣品乾燥後放入質譜儀中進行分析。四、質譜儀的參數設置(1)加速電壓25kV;(2)導絲電壓0.15%;(3)電網電壓94%;(4)延遲時間950ns;(5)雷射功率1900-2400(st印100);(6)分子量範圍10-50kDa;(7)Lowmassgate:10kDa;(8)DigitizerBinsize:4nsec;(9)輸入帶寬250MHz;(10)50lasershots/Massspectra,自動積累隨機模式。五、利用DataExplorerTM軟體進行圖像分析處理，根據處理結果，可獲得不同品種小麥LMW-GS組成圖譜和各亞基的精確分子量。普通六倍體小麥Dl-13(98Y033)LMW-GS的Glu-3位點等位基因編碼的蛋白特徵峰的分子量如表l所示。普通六倍體小麥Dl-13(98Y033)LMW-GS的MALDI-TOF-MS對比圖譜如圖1所示。其中，A為儀器參數優化前的結果，B為儀器參數優化後的結果。表l、G/"-3位點等位基因編碼蛋白特徵峰的分子量編碼位點等位基因MALDI-TOF-MS特徵峰36886Da十37674Da+41852Da36285Dac37674Da+41852Da43568Da35406Da/37443DaG/認40258Da+40402Da40150Da+40309Da39791Da+42949Da39599Da+42848Da25780Da+40150Da+40309Da25780Da+37221Da+40150Da+40309Da39854Da+42871Da(33501+33606+33762)Da+38605Da+40972Da(33501+33606+33762)Da++38756Da40972Da(33229+33316+33476)Da(33554+33618+33777)Da37026Da從圖l中可以看出，儀器參數優化前和優化後，普通六倍體小麥D1-13(98Y033)LMW-GS的MALDI-TOF-MS檢測分辨度的變化，優化後的蛋白質圖譜12分辨度明顯提高。實施例2、LMW-GS的G/w-3位點等位變異的MALDI-TOF-MS鑑定一、植物材料(具體見表l-5)(1)小麥LMW-GS近等基因系材料I，共19份(表2);(2)小麥LMW-GS標準品種II，共22份(表3);(3)小麥LMW-GS近等基因系材料III，共76份(表4);(4)小麥LMW-GS近等基因系材料IV，共96份(表5);(5)小麥LMW-GS的六倍體缺體四體材料V，共28份(表6)。二、LMW-GS的提取、上樣方法及質譜儀的參數設置基本同實施例1。其不同點在於提取的步驟2)中的溫浴條件為60。C溫浴60min;步驟3)中的溫浴條件為50。C溫浴50min;步驟4)中的溫浴條件為60°C溫浴30min。三、LMW-GS的G/m-3位點等位變異亞基的MALDI-TOF-MS鑑定不同的品種之間低分子量谷蛋白亞基組分有較複雜的變異，LMW-GS的MALDI-TOF-MS圖譜上，每個亞基可大約鑑定出十幾個甚至幾十個蛋白峰，一般每個亞基有15個蛋白特徵峰。其中，低分子量谷蛋白亞基G/w-A位點的特徵峰較為簡單也易於分辨，G/w-53位點稍複雜，G/w-Z^位點最複雜，這和SDS-PAGE的鑑定趨勢是一致的。表2-6中的小麥材料I、III、IV、V的LMW-GS組成是相互驗證、互相補充的，是一套較完整的近等基因系材料，是建立小麥LMW-GS的MALDI-TOF-MS的蛋白特徵峰的標準圖譜的建立的基礎和保障。建立G/wJ3、G/w-53和G/m-D3位點各亞基的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰的標準圖譜，要進行橫向和縱向的多重比較，還要進行正面比較和反面驗證，不但要注意各亞基的特徵峰，還要注意某些亞基的共有特徵峰，而且某些蛋白峰的存在和缺失有時也是判斷其是哪種亞基的特徵現象。以LMW-GS亞基G/w-A56位點為例，具體闡述建立MALDI-TOF-MS標準特徵峰圖譜的過程。首先分析表2的品種，以Arill6-l(6，6，c)為例，結合Excel數據和圖譜對蛋白峰進行綜合分析。先縱向比較Arill6-l(6，6，c)和Aroona(c，6，c)，那麼Arill6-1(6，6，c)特有的蛋白峰都可能是G/w-」3/6的特徵峰，二者共有的特徵峰有可能是Glu-A3b的共同蛋白特徵峰，也有可能是Glu-B3b或Glu-D3c的蛋白特徵峰，然後再和表2的其他材料對比縱向逐步篩選。這個Arill6-l(6，6，c)特有的蛋白峰在其他的不含G/MJ3/6的小麥材料中不出現或者和某些其他亞基共同的13特徵峰，這要經過多重比較驗證方可初步判斷，同時還要注意二者共有的蛋白峰也有可能是二者的共有特徵峰，然後再和其他材料逐一比較做出判斷。我們用同樣的方法篩選表4的G/""3/6亞基。如果二者篩選出的結果一致，就可初步得出G^J3/6的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰的，然後以此蛋白特徵峰的圖譜為G/mJ3/6亞基的標準圖譜去鑑定表2、表4和表5中含G/wJ3/6亞基的品種，以驗證這個圖譜的正確性。其他亞基依次類推。LMW-GS的蛋白特徵峰的標準圖譜和小麥低分子量谷蛋白的六倍體缺失體圖譜比對驗證，每個小麥低分子量谷蛋白的六倍體缺失體材料只含有一個位點的低分子量谷蛋白亞基，Glu-3位點的LMW-GS的蛋白特徵峰圖譜只存在於各自對應的缺失體材料中。本發明中初步推斷出6個G/twO位點(a，6，c，d，e，_y0、7個G/w-53(a,6，c，A/，g，/2)和4個G/"-ZW(,6，c，c/，/)等18個低分子量谷蛋白亞基的特徵峰圖譜。小麥低分子量谷蛋白亞基組成非常複雜，有些亞基的MALDI-TOF-MS特徵峰圖譜很難判斷，如G7w"_/a和G/w-J3/c，G/w-D3/a和G/w-D3/6，下面以表5的小麥品種為例介紹這些亞基的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰。1、G/m」3位點的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰的鑑定G7"^J位點的低分子量谷蛋白亞基特徵峰較為簡單，每個亞基一般由1~3個特徵峰組成。鑑定出的G/w-」3位點的6個亞基分別為G/M-^3/a、G/w-^M),G/w-刀/c、G/w-^3A/、G/w-J3/e和G/w-JJ《。其中，G/w-J3/6、G/w-^3/<i、G/w-」3/e和G/m-^3《亞基的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰易於識別，只含有一個特徵峰，分子量分別約為36285Da、43568Da、35409Da和37443Da。G/w"3/c的特徵峰有兩個，其分子量為37672Da和41854Da。其中，G/wJ3/"除含有和G/w-」3/c—樣的兩個特徵峰(37672Da和41854Da)夕卜，根據推斷結果，G/wJ3/"還應該含有第三個特徵峰(36886Da)，此結果還需更多的小麥材料驗證。因此，當三個蛋白峰(368886Da、37672Da和41854Da)同時在LMW-GS的MALDI-TOF-MS圖譜中出現時，則認為該G/w-J3位點的亞基是G/wJ3/a，若只有兩個蛋白峰出現(37672Da和41854Da)，而無蛋白峰36886Da出現時，G/w-yO位點的亞基是G/w-」3/c。小麥LMW-GS六個G/w-^位點(fl，6，c，Ae，/)的特徵峰圖譜如圖2-7所示。2、G/m-W位點的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰的鑑定G/"-53位點的低分子量谷蛋白亞基特徵峰圖譜稍複雜，每個亞基一般由2~4個蛋白特徵峰組成。鑑定出的Wt/-萬3位點的7個亞基分別為G/m-S3/"G/w-5V6、G/"-B3/c、G/"-53A/、G/"-j53《、G/"-53/g和G/w-53/Zz。其中，G/"-S3/fl亞基的獨有的蛋白特徵峰(40258Da、40402Da)較明顯，很容易識別。其他的G/w-53位點的亞基蛋白特徵峰的信息較複雜，必須相互結合考慮才能準確識別。其中G/w-W/6、G7w-M《和G/w-S3/g有其共同的特徵峰(40137Da和40279Da)。其中G/m』3《和G/"-W/g還有另外一個共同的蛋白峰(25786Da),二者的區別只是G7w-^/g比G/w-SJ《多一個特徵峰(37221Da)。因此，我們先識別G7w-55/g(25786Da、37221Da、40137Da和40279Da)，同時存在這4個特徵峰，再識別G/w-53《(25786Da、40137Da和40279Da)，僅存在這3個蛋白特徵峰而無蛋白峰37221Da，最後識別(40137Da和40279Da)，只有2個存在特徵峰而無峰25786Da和37221Da。因此，識別此三個亞基時，要相互結合充分考慮。G/w-53/c、G/w-S3/d和G7w^3/7亞基類型則無特徵峰(40137Da和40279Da)存在，這與G/w-53/6、(/"』3//和G/"-53/g相反，這是識別其亞基類型的依據之一。其中，G/w-S3/c有一個蛋白特徵峰(42949Da)，較容易識別。G/w-B3/d和G/m-5J/;z相似，其蛋白特徵峰組合分別為(39599Da、42851Da)和(39854Da、42871Da)，二者共同的特徵峰為42871Da，二者之間的差異特徵峰(G/w-53/麼39599Da)和(G/w-^J/Zz、39854Da)之間只相差200Da左右。小麥LMW-GS七個G/w-53位點(a,6，c，A,g,/z)的特徵峰圖譜如圖8-14所示。3、G/w-Z)S位點的MALDI-TOF-MS蛋白特徵峰的鑑定G/"-Z)3位點的低分子量谷蛋白亞基特徵峰圖譜最複雜，每個亞基由35個特徵峰組成。共鑑定出5個G/w-D3位點亞基G/"-Z)3/fl、G/w-A5/6、G/m-Z)J/c、G/w-A5A/和G/w-D3《。其中，G/w-ZW/c依據其特徵峰(33229Da、33316Da和33476Da)可以很容易識別出來。G/m-ZX5/a、G/w-D3/6和G/w-Z)3A/都有特徵峰(33501Da、33606Da和33762Da)，另外，G/w-D3/d、G/w-DJ/a和G7w-D3/6還有一個特徵峰40986Da，而G/w-Z)3/d則沒有這個特徵峰，這也是G/m-Z)3/。和G/w-D3/6區別於G/m-D^4/的重要依據。G/w-D3/a和G/w-Z)3/6的區別在於它們各自的特異峰(G/w-Z)3/fl、38605Da)和(G/w-A/6、38756)，G/w-A/fl和G/w-A/6很相似容易混淆，我們只是初步建立了它們的特徵峰圖譜，還需要更多的材料驗證。""-/)3//容易識別，所有低分子量谷蛋白亞基的MALDI-TOF-MS圖譜都有峰(33229Da、33316Da和33476Da)或者(33501Da+33606Da+33762Da)，唯獨G/w-D3《沒有這兩組蛋白峰，而且C/m-D3//還有一個自身的特異峰(37026Da)。小麥LMW-GS五個C7/w-A5位點(a，6，c，1A/)的特徵峰圖譜如圖15-19所示。低分子量谷蛋白亞基G/W-A位點的亞基特徵峰分子量的浮動範圍一般不超過士100Da。因此，每次進行LMW-GS的MALDI-TOF-MS鑑定時，都要進行分子量的校正，以減少分子量的浮動。表2、tableseeoriginaldocumentpage16表1中，^^表示品種Aril作為供體與品種Aroona雜交，經過5次連續回交得到的重組近交系。_表3、小麥LMW-GS標準品種II_品種_^__^_Westonia國際玉米小麥改良中心Festin法國Halberd國際玉米小麥改良中心Insignia法國Tasman國際玉米小麥改良中心Orca法國Trident國際玉米小麥改良中心Petrel法國Marquis國際玉米小麥改良中心Thesec法國stiletto國際玉米小麥改良中心Brimstone法國Carnamah國際玉米小麥改良中心Nanbu-komugi日本ChineseSpring法國Wilgoyne國際玉米小麥改良中心Magdalena法國Millewa國際玉米小麥改良中心Gabo法國Chopin法國Cappelle-Desprez法國Apollo法國表4、小麥LMW-GS近等基因系材料III小麥品種小麥品種WAWHT2586WAWHT2884cWAWHT2589WAWHT2896cccWAWHT2590力WAWHT2661caWAWHT2639Z>OfWAWHT2772cOfWAWHT2777aWAWHT2721ccWAWHT2830WAWHT2793ccWAWHT2831WAWHT2847cgWAWHT2488WAWHT2848cWAWHT2631WAWHT2838cWAWHT2758/>&WAWHT2794ccWAWHT2846Z)WAWHT2799ccWAWHT2901WAWHT2898cgcWAWHT2920&&&WAWHT2595cgaWAWHT2927Z>WAWHT2883■c;WAWHT2585WAWHT2726cWAWHT2640WAWHT2727c&WAWHT26466gWAWHT27766WAWHT28216WAWHT2782c6WAWHT2822WAWHT2836cWAWHT2826gWAWHT2784ccWAWHT2833WAWHT2882c/;cWAWHT2843/WAWHT2886cWAWHT2897化？WAWHT2925ccWAWHT2607/WAWHT2732WAWHT2887//WAWHT2786WAWHT2928WAWHT2751WAWHT2892//cWAWHT2752WAWHT2750caWAWHT2929WAWHT2895cWAWHT2934WAWHT2734cWAWHT2770WAWHT2737c&&WAWHT2773WAWHT2739cWAWHT2902AcWAWHT2740cZWAWHT2851gWAWHT2811cWAWHT2924WAWHT2893cWAWHT2730aWAWHT2926cWAWHT2767/WAWHT2933cWAWHT2769OfWAWHT2192c66WAWHT2736/6表5、小麥LMW-GS近等基因系材料IV小麥品種小麥品種DA6+8*,B3fc/cAril21-2,B3accAril26-1,B3fc/cDA3*,D3aca.DA叫ll,D3acOfTrident/cZ>Aril28-4,B3hc/zcAril34-1,D3aca.DA5+10,A3ecAril36-2,D3b6DA7+8,B3h1866Aril2-4，2*6Aril35-1，D3f辦/Aril19-2,A3eAril29-4,B3ic/cAril15-4,A3aChinese.SpringaAril15-4，A3aaAril27-6,B3gccAril27-6,B3gcAril20-1,A3f/Gabo辦Aril23-4，B3cccDA5+10，B3hDA2*,A3eAril18-5,A3dAril18-5,A3dH45/lDA7+8,B3acacAroomAril33-1,D3dDA7*,A3dAril23-4,B3cccAril14-3,Aril18-9,A3dcDA2*,A3dAril19-2,A3eTA,A3d，B3i/cCalidad/Aril29-4,B3ic/cGaboBiggar/Aril24-3,B3dAroonacDA2*,B3mc附cAril13-3,JabiruFrameDAB3d,D3acH45cCalidadcAril34-1,D3aAril18-9,A3dYitpic//Aril5-2,7*Aril30-1，D3aGaboAril30-1,D3aaDA7+8,A3acDA5+10,B3ccccBiggar/z>Aril28-4,B3hDA2*,B3dc/cAril4-3,3*Aril3-2,叫llccDA2.2+12，A3dDA2*,B3m附cAril20-1，A3f/cAril12-3，3+12c6Aril21-2,B3aaformulaseeoriginaldocumentpage20D9167/98-一D10302/98-一Dll585/96--Gl173/98-—G2174/98--o'G3292/98--G42術98-G5534/96--cG6288/96.1--G7288/96.2-一G8288/96.3-一G9289/98.1--/G10289/96.2--/權利要求1、一種鑑定低分子量谷蛋白亞基等位變異的質譜方法，是用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜對低分子量谷蛋白亞基進行鑑定，根據其蛋白特徵峰，確定低分子量谷蛋白亞基的等位變異。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述低分子量谷蛋白亞基的製備方法包括以下步驟(1)用體積百分含量為30-70%乙醇溶液除去小麥中的醇溶蛋白，取沉澱；(2)在上述步驟(1)獲得的沉澱中加入異丙醇溶液，60-70。C溫浴40-60min，取沉澱；(3)在上述步驟(2)獲得的沉澱中加入溶液A，30-50°C溫浴50-60min;所述溶液A由異丙醇、DTT、Tris-HCl和水組成；所述溶液A中，異丙醇的體積百分含量為50%，DTT的體積百分含量為1%，Tris-HCl的pH為8.0，Tris-HCl終濃度為80mM;(4)在上述步驟(3)的溶液中加入溶液B，50-60°C溫浴30-40min，取上清；所述溶液B由異丙醇、4-乙烯基吡啶、Tris-HCl和水組成；所述溶液B中，異丙醇的體積百分含量為50%，4-VP的體積百分含量為1.4%，Tris-HCl的pH為8.0，Tris-HCl的終濃度為80mM;(5)在上述步驟(4)獲得的上清中加入丙酮溶液，取沉澱，得到小麥低分子量谷蛋白亞基。3、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟(1)中，所述乙醇溶液為體積百分含量為70%的乙醇水溶液。4、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)中，所述異丙醇溶液為體積百分含量為55%的異丙醇水溶液。5、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟(5)中，所述丙酮溶液為體積百分含量為80%的丙酮水溶液。6、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)中，溫浴的條件為65。C溫浴50min;所述步驟(3)中，溫浴的條件為40。C溫浴55min;所述步驟(4)中，溫浴的條件為55。C溫浴35min。7、根據權利要求2-6中任一所述的方法，其特徵在於所述低分子量谷蛋白亞基上樣前還進行預處理；所述預處理是將低分子量谷蛋白亞基溶於溶液C中；所述溶液C由乙腈、TFA和水組成；所述溶液C中，乙腈的體積百分含量為50%，TFA的體積百分含量為0.05%。8、根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述低分子量谷蛋白亞基的上樣包括以下步驟將芥子酸溶液滴加到靶板的樣品孔內，待芥子酸溶液乾燥後，在樣品孔內再滴加預處理過的低分子量谷蛋白亞基溶液，待低分子量谷蛋白亞基溶液乾燥後，再在樣品孔內滴加芥子酸溶液；所述芥子酸溶液是將芥子酸溶解於溶液C中得到的；所述溶液C由乙腈、TFA和水組成；所述溶液C中，乙腈的體積百分含量為50%，TFA的體積百分含量為0.05%;所述芥子酸溶液中，芥子酸的濃度為10mg/ml。9、根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀的參數設置如下(1)加速電壓25kV;(2)導絲電壓0.15%;(3)電網電壓94%;(4)延遲時間950ns;(5)雷射功率1900-2400(step100);(6)分子量範圍10-50kDa;(7)Lowmassgate:10kDa;(8)DigitizerBinsize:4nsec;(9)輸入帶寬250MHz;(10)50lasershots/Massspectra,自動積累隨機模式。10、根據權利要求1-9中任一所述的方法，其特徵在於所述低分子量谷蛋白亞基等位變異的位點為低分子量谷蛋白亞基的G/"-3位點。全文摘要本發明公開了一種鑑定低分子量谷蛋白亞基等位變異的方法。該方法是用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜對低分子量谷蛋白亞基進行鑑定，根據蛋白特徵峰，確定低分子量谷蛋白亞基的等位變異。利用本發明的方法可以對LMW-GS進行精確的分子量測定以及利用建立的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)蛋白特徵峰的標準圖譜鑑定LMW-GS的等位變異。通過這一方法可以快速、準確的測定出小麥LMW-GS的分子量和不同小麥品種LMW-GS等位變異亞基的組成，為進一步研究LMW-GS的遺傳與生化特性以及LMW-GS對小麥加工品質的貢獻提供了強有力的技術手段，進而為小麥種子蛋白質組的深入研究奠定了基礎。文檔編號G01N1/28GK101566599SQ20091008525公開日2009年10月28日申請日期2009年5月27日優先權日2009年5月27日發明者晏月明,王愛麗,高利豔申請人:首都師範大學