油菜素內酯在提高青蒿素含量中的應用的製作方法

2023-04-24 01:40:01 1

油菜素內酯在提高青蒿素含量中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了油菜素內酯在提高青蒿素含量中的應用。本發明所提供的應用，為Al)、A2)或A3)的物質在提高黃花蒿中青蒿素含量中的應用；所述A1)的物質為油菜素內酯；所述A2)的物質為油菜素內酯類似物；所述A3)的物質為以所述油菜素內酯或其類似物為活性成分的物質。實驗證明，對黃花蒿施用油菜素內酯可以提高黃花蒿中青蒿素的含量。該方法不需要基因工程方法所要求的較高的前期投入，可以有效降低青蒿素的生產成本並提高黃花蒿中青蒿素的產量。
【專利說明】油菜素內酯在提高青蒿素含量中的應用

【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及生物【技術領域】中油菜素內酯在提高青蒿素含量中的應用。

【背景技術】
[0002] 黃花蒿（Artemisia annua L.)是一種傳統的藥用植物。黃花蒿又名香蒿、苦蒿、 蒿枝。20世紀70年代，我國科學家首次從黃花蒿中分離到具有抗瘧活性的無色針狀晶體 化合物，命名為青蒿素（artemisinin)，並最終確定其結構為一種具有內部過氧橋的倍半廠 內酯。後來的研究表明，由於分子內部"過氧橋"的存在，青蒿素及其衍生物對腦型瘧疾、抗 氯喹惡性瘧疾具有很好的療效，被世界衛生組織認為是最有潛力的抗瘧藥物。在2002年 非洲"瘧疾日"上，世界衛生組織官員指出：基於青蒿素的綜合治療（Artemisinin-Based Combination Therapies, ACTs)能夠降低痕疾發生的頻率以及降低痕原蟲抗性的產生和蔓 延，是目前最有效和最值得推廣的治療方法，為了控制瘧疾的蔓延，今後要推行"基於青蒿 素的綜合治療"。越來越多的國家將ACTs作為瘧疾治療的首選策略，增加了青蒿素的市場 需求量。此外，有研究表明，青蒿素對白血病、乳腺癌等一系列癌細胞具有很好的抑制作用。
[0003] 目前世界上青蒿素類藥物的生產主要是從黃花蒿中直接提取，而黃花蒿中青蒿素 的含量一般較低（約佔乾重的〇. 01 % -〇. 8 % )，且提取環節多、費時費力，使青蒿素的生產 成本高、產量低，難以滿足市場需求，所以如何提高黃花蒿中青蒿素的含量成為提高青蒿素 產量的關鍵。


【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的一個技術問題是如何提高黃花蒿（Artemisia annua L.)中青 蒿素的含量。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供了 Al)、A2)或A3)的物質在提高黃花蒿中青蒿 素含量中的應用；
[0006] 所述Al)的物質為油菜素內酯；
[0007] 所述A2)的物質為油菜素內酯類似物；
[0008] 所述A3)的物質為以所述油菜素內酯或其類似物為活性成分的物質。
[0009] 上述應用中，所述提高黃花蒿中青蒿素含量可為提高黃花蒿葉中青蒿素含量。
[0010] 上述應用中，所述提高黃花蒿中青蒿素含量，包括對所述黃花蒿施用所述油菜素 內酯的溶液、所述油菜素內酯類似物的溶液或所述以所述油菜素內酯或其類似物為活性成 分的物質的溶液的步驟。
[0011] 上述應用中，所述油菜素內酯的溶液中油菜素內酯的濃度為5 i! M-200 i! M，所述 5 ii M-200 ii M 具體可為 10 ii M-100 ii M ;所述 10 ii M-100 ii M 具體可為 80 ii M。
[0012] 上述應用中，施用所述油菜素內酯的溶液的時間是在採收前4-10天，如4天或10 天。施用所述油菜素內酯的溶液的方法為每天施用1次，直至採收。
[0013] 上述應用中，施用所述油菜素內酯的溶液的方式為葉面噴施、土壤澆灌和培養基 中添加這三種中的任一種、任兩種或三種。
[0014]本發明所要解決的另一個技術問題是如何獲得青蒿素含量高的黃花蒿 (Artemisia annua L.)葉。
[0015] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種生產黃花蒿葉的方法。
[0016] 本發明所提供的生產黃花蒿葉的方法，包括在採收黃花蒿葉前，對所述黃花蒿施 用所述油菜素內酯的溶液、所述油菜素內酯類似物的溶液或所述以所述油菜素內酯或其類 似物為活性成分的物質的溶液。
[0017] 上述生產黃花蒿葉的方法中，所述油菜素內酯的溶液中油菜素內酯的濃度為 5 ii M-200 ii M，所述 5 ii M-200 ii M 具體可為 10 ii M-100 ii M ;所述 10 ii M-100 ii M 具體可為 80 u M0
[0018] 上述生產黃花蒿葉的方法中，施用所述油菜素內酯的溶液的時間是在採收前4-10 天，如4天或10天。施用所述油菜素內酯的溶液的方法為每天施用1次，直至採收。
[0019] 上述生產黃花蒿葉的方法中，施用所述油菜素內酯的溶液的方式為葉面噴施、土 壤澆灌和培養基中添加這三種中的任一種、任兩種或三種。
[0020] 上述生產黃花蒿葉的方法中，所述油菜素內酯的溶液中油菜素內酯的濃度為 5 ii M-200 ii M，所述 5 ii M-200 ii M 具體可為 10 ii M-100 ii M ;所述 10 ii M-100 ii M 具體可為 80 u M0
[0021] 本發明所要解決的再一個技術問題是如何降低製備青蒿素的成本。
[0022] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種製備青蒿素的方法。
[0023] 本發明所提供的製備青蒿素的方法，包括從上述生產黃花蒿葉的方法中生產的黃 花蒿葉中提取青蒿素。
[0024] 上述製備青蒿素的方法中，提取青蒿素的方法可採用現有的從黃花蒿葉中提取青 蒿素的方法。
[0025] 上述製備青蒿素的方法還包括純化青蒿素的步驟；所述純化青蒿素可按照現有的 方法進行。
[0026] 本申請的油菜素內酯處理黃花蒿後可以明顯增加黃花蒿中青蒿素的含量：黃 花蒿葉經2 % (體積百分比）乙醇水溶液處理（CK)後，黃花蒿葉中青蒿素的含量為 1.29±0. 10mg/g乾燥葉，黃花蒿葉經5yM的油菜素內酯處理後，黃花蒿葉中青蒿素的含量 為2.43±0.381^/^乾燥葉，黃花蒿葉經1〇1 1|1的油菜素內酯處理後，黃花蒿葉中青蒿素的 平均為2. 45±0. 48mg/g乾燥葉，黃花蒿葉經80 y M的油菜素內酯處理後，黃花蒿葉中青蒿 素的含量為3. 26±0.28mg/g乾燥葉，黃花蒿葉經100 UM的油菜素內酯處理後，黃花蒿葉中 青蒿素的含量為2. 88±0.07mg/g乾燥葉，黃花蒿葉經200 UM的油菜素內酯處理後，黃花蒿 葉中青蒿素的含量為2. ll±0.90mg/g乾燥葉。其中，經SOyM的油菜素內酯處理後黃花蒿 中青蒿素的含量最高，為噴施2% (體積百分比）乙醇水溶液（CK)的黃花蒿中青蒿素含量 的2. 53倍。
[0027] 本申請的實驗證明，油菜素內酯在提高黃花蒿中青蒿素的含量作用顯著，因此在 田間生產過程中可以施用油菜素內酯來提高黃花蒿中青蒿素的含量。該方法工藝簡單，可 以有效降低青蒿素的生產成本並提高黃花蒿中青蒿素的含量，對青蒿素大規模生產具有重 要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為不同濃度油菜素內酯處理黃花蒿葉片後黃花蒿葉片中青蒿素含量的變化。 其中，DW表示葉片乾重，CK表示2% (體積百分比）乙醇水溶液。
[0029] 圖2為青蒿素標準品和樣品的HPLC圖。其中a為青蒿素標準品的HPLC圖，b為 樣品的HPLC圖。
[0030] 圖3為80 UM油菜素內酯處理黃花蒿葉片後第4天葉片中青蒿素的含量。其中， DW表示葉片乾重，未處理表示未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片，處理表示經80 M油菜 素內酯處理的黃花蒿葉片。

【具體實施方式】
[0031] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。
[0032] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0033] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0034] 下述實施例中的油菜素內酯為Inalco公司產品。
[0035] 下述實施例中的各濃度的油菜素內酯溶液均是將油菜素內酯先用無水乙醇溶解， 再用蒸餾水配製成所需要濃度的溶液。各濃度的油菜素內酯溶液中，乙醇的濃度均為2%。
[0036] 下述實施例中的黃花蒿（Artemisia annua L.)均為黃花蒿株系001 (High efficiency of genetic transformation and regeneration of Artemisia annua L. via Agrobacterium tumefaciens-mediated procedure，Jun-Ii Han, Hong Wang, He-chun Ye, Yan Liu，Zhen-qiu Li, Yi Zhang, Yan-sheng Zhang, Fang Yan，Gu〇-feng Li, Plant Science，168 (2005) 73 - 80.)公眾可從中國科學院大學（即 申請人:）獲得，該生物材料只為 重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0037] 實施例1、不同濃度油菜素內酯對黃花蒿中青蒿素合成的影響
[0038] 實驗重複三次，每次重複實驗的方法如下：
[0039] 1、用油菜素內酯處理黃花蒿植株
[0040] 將黃花蒿（Artemisia annua L.)種子依次按照下述步驟進行消毒：①用70% (體 積百分比）乙醇水溶液清洗2min ;②5% (質量百分比）次氯酸鈉水溶液消毒10-15min ;③ 無菌水衝洗，得到無菌黃花蒿種子。將無菌黃花蒿種子播種在MS培養基中，於溫度為25°C、 光照強度為30001x、光照周期為16h白天/8h黑夜的條件下進行培養，兩周後得到黃花蒿幼 苗。將黃花蒿幼苗轉到含有草木灰和蛭石（草木灰和蛭石的體積比為1:1)的基質中，於溫 度為25°C、光照強度為30001x、光照周期為16h白天/8h黑夜的條件下培養5周，得到生長 狀態均一的黃花蒿植株，該黃花蒿植株未出現花蕾。
[0041] 用濃度分別為51^、1〇111、8〇1^、10〇1^、20〇1^的油菜素內酯溶液和2%(體積 百分比）乙醇水溶液（作為對照，CK)分別對黃花蒿植株葉面進行噴施，每天噴施一次，每 次噴施後於溫度為25°C、光照強度為30001x、光照周期為16h白天/8h黑夜的條件下培養， 共培養10天，分別得到5 ii M黃花蒿植株、10 ii M黃花蒿植株、80 ii M黃花蒿植株、100 ii M黃 花蒿植株、200 U M黃花蒿植株、CK黃花蒿植株。每種溶液為一個處理，每個處理噴施六株黃 花蒿植株。
[0042] 2、青蒿素含量的檢測
[0043] 分別將5 ii M黃花蒿植株、10 ii M黃花蒿植株、80 ii M黃花蒿植株、100 ii M黃花蒿植 株、200 M黃花蒿植株、CK黃花蒿植株的葉片於45°C烘箱中烘乾至恆重，分別得到5 M幹 燥葉片、10 y M乾燥葉片、80 i! M乾燥葉片、100 i! M乾燥葉片、200 i! M乾燥葉片、CK乾燥葉片。 將5 ii M乾燥葉片、10 ii M乾燥葉片、80 ii M乾燥葉片、100 ii M乾燥葉片、200 ii M乾燥葉片、CK 乾燥葉片分別研成粉末，分別得到六種乾燥葉片的粉末。分別稱取上述六種乾燥葉片的粉 末各1001^，各加入40 1^石油醚（沸點30-60°〇並於室溫下浸提過夜，分別得到5^粗 提液、10 U M粗提液、80 ii M粗提液、100 ii M粗提液、200 ii M粗提液、CK粗提液。將上述六種 粗提液於室溫下超聲處理2-4min，並於旋轉蒸發儀中蒸乾石油醚，分別得到5 y M提取物、 10 UM提取物、80 ii M提取物、IOOii M提取物、200 ii M提取物、CK提取物。分別用IOmL甲醇 溶解上述六種提取物，並於12000rpm離心5min，棄沉澱，分別得到5 ii M精提液、10 ii M精提 液、80 ii M精提液、100 ii M精提液、200 ii M精提液、CK精提液。
[0044] 分別向上述六種精提液中各加入4mL 0? 2% (質量百分比）的NaOH，分別混勻後 並分別於50°C下水浴30min，並將其分別冷卻至室溫後，分別加入5mL 0. 05M醋酸水溶液， 將其分別混勻後，經〇. 45 ii m的NC膜過濾，分別得到5 ii M待測液、10 ii M待測液、80 ii M待 測液、100 U M待測液、200 ii M待測液、CK待測液。將上述六種待測液分別上柱進行HPLC分 析。
[0045] HPLC(Agilent 1260 Infinity 液相色譜儀）檢測條件為：3. 9X 150mm C18 反相柱， 流動相為溶液A (溶液A由0. OlM pH 7. 0磷酸鈉緩衝液與甲醇按照50 :50的體積比混合而 成），流速為lmL/min，UV檢測波長為260nm,上柱體積為20 ii L。
[0046] HPLC分析中，使用Agilent Masshunter對色譜峰進行積分，以青蒿素（純度為 98%，購自sigma公司，貨號為361953)為標準品，根據標準品的保留時間定性和採用標準 曲線法（外標法）進行定量分析上述六種待測液的青蒿素含量。上述六種待測液的青蒿素 含量見圖1。標準品和樣品的HPLC分別如圖2中a和b所示，標準品青蒿素在該色譜條件 下的保留時間為4分鐘；樣品在該色譜條件下含有保留時間為4分鐘的青蒿素的層析峰。
[0047] 結果顯示，黃花蒿植株葉經5 UM的油菜素內酯溶液處理後，黃花蒿葉片中青蒿素 的含量為2. 43±0. 38mg/g乾燥葉，黃花蒿植株葉經10 y M的油菜素內酯溶液處理後，黃花 蒿葉片中青蒿素的含量為2. 45±0.48mg/g乾燥葉，黃花蒿植株葉經80 UM的油菜素內酯處 理後，黃花蒿葉片中青蒿素的含量為3. 26±0. 28mg/g乾燥葉，黃花蒿植株葉經100 y M的 油菜素內酯處理後，黃花蒿葉片中青蒿素的含量為2.88±0.07mg/g乾燥葉，黃花蒿植株葉 經200 UM的油菜素內酯處理後，黃花蒿葉片中青蒿素的含量為2. ll±0.90mg/g乾燥葉，黃 花蒿植株葉經2% (體積百分比）乙醇水溶液（CK)處理後，黃花蒿葉片中青蒿素的含量為 1.29±0. 10mg/g乾燥葉。結果表明，與噴施2% (體積百分比）乙醇水溶液（CK)的黃花蒿 相比，黃花蒿植株經不同濃度的油菜素內酯處理後黃花蒿中青蒿素的含量均增加，其中，經 80 UM的油菜素內酯處理後黃花蒿中青蒿素的含量最高，為噴施2% (體積百分比）乙醇水 溶液（CK)的黃花蒿中青蒿素含量的2. 53倍。油菜素內酯處理黃花蒿可以明顯增加黃花蒿 中青蒿素的含量，其中80 ii M的油菜素內酯溶液中油菜素內酯的濃度為80 ii M時為處理黃 花蒿的最佳濃度。
[0048] 實施例2、油菜素內酯處理時間對黃花蒿中青蒿素合成的影響
[0049] 實驗重複三次，每次重複實驗的方法如下：
[0050] 用濃度為80 ii M的油菜素內酯（Inalco公司產品）溶液對實施例1中步驟1中 的黃花蒿植株的葉面進行噴施，每天噴施一次，每次噴施後於溫度為25°C、光照強度為 30001x、光照周期為16h白天/8h黑夜的條件下培養，以噴施2% (體積百分比）乙醇水溶 液（CK)的黃花蒿植株作為未經油菜素內酯處理的對照。培養期間，在第4天採集經過80 y M 油菜素內酯處理和未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片，分別得到經過油菜素內酯處理的黃 花蒿葉片和未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片。
[0051] 按照實施例1中步驟2的方法，將5 ii M黃花蒿植株、IOii M黃花蒿植株、80 ii M黃 花蒿植株、100 y M黃花蒿植株、200 i! M黃花蒿植株、CK黃花蒿植株的葉片替換為上述經過 油菜素內酯處理的黃花蒿葉片和未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片，其餘步驟不變，測定 經過80 UM油菜素內酯處理4天的黃花蒿葉片和未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片中青蒿 素的含量，結果見圖3。
[0052] 結果表明，經80 UM油菜素內酯處理後第4天的黃花蒿葉片中青蒿素的含 量為3.82±0.32mg/g乾燥葉，未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片中青蒿素的含量為 1.68±0.30mg/g乾燥葉，與未經油菜素內酯處理的黃花蒿葉片中青蒿素的含量相比，經 80 U M油菜素內酯處理後第4天的黃花蒿葉片中青蒿素的含量提高了 1. 27倍。
【權利要求】
1. Al)、A2)或A3)的物質在提高黃花蒿中青蒿素含量中的應用； 所述Al)的物質為油菜素內酯； 所述A2)的物質為油菜素內酯類似物； 所述A3)的物質為以所述油菜素內酯或其類似物為活性成分的物質。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵於：所述提高黃花蒿中青蒿素含量，包括對所述 黃花蒿施用所述油菜素內酯的溶液、所述油菜素內酯類似物的溶液或所述以所述油菜素內 酯或其類似物為活性成分的物質的溶液的步驟。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於：所述油菜素內酯的溶液中油菜素內酯的 濃度為 5 ii M-200 ii M。
4. 根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於：所述油菜素內酯的溶液中油菜素內 酯的濃度為IOu M-IOOii M。
5. 根據權利要求2或3或4所述的應用，其特徵在於：所述油菜素內酯的溶液中油菜 素內酯的濃度為80 iiM。
6. 根據權利要求2-5中任一所述的應用，其特徵在於：施用所述油菜素內酯的溶液的 時間是在採收前4-10天。
7. 根據權利要求2-6中任一所述的應用，其特徵在於：施用所述油菜素內酯的溶液的 方式為葉面噴施、土壤澆灌和培養基中添加這三種中的任一種、任兩種或三種。
8. 生產黃花蒿葉的方法，包括在採收黃花蒿葉前，對所述黃花蒿施用油菜素內酯的溶 液、所述油菜素內酯類似物的溶液或以所述油菜素內酯或其類似物為活性成分的物質的溶 液。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於：所述油菜素內酯的溶液中油菜素內酯的 濃度為 5 ii M-200 ii M。
10. 製備青蒿素的方法，包括從按照權利要求8或9所述方法生產的黃花蒿葉中提取青 蒿素。
【文檔編號】C07D493/20GK104206382SQ201410397527
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】王紅, 池劍亭, 申亞琳 申請人:中國科學院大學