檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒和方法

2023-04-23 20:55:41 2

專利名稱：檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒和方法
技術領域：
本發明屬於牲畜傳染病病原檢驗檢疫領域，具體涉及一種胞內勞森菌的檢測試劑盒和檢測方法
背景技術：
豬增生性腸病(PorcineProliferative Enteropathy，PPE)，又稱豬增生性腸炎(PorcineProliferative Enteritis)、豬迴腸炎(Porcine Ileitis)、豬增生性腸道病 (Porcine BowlDisease) MMliU'^W'M (Porcine Intestinal Adenomatosis)
出血性腸炎(Porcine Proliferate Haemorrhage Enteritis，PHE)等[卜4]，但目前普遍稱之為豬增生性腸病。該病病原是一種專性胞內寄生細菌，稱之為胞內勞森菌(Lawsona Intracellularis, Li)，也有學者稱為胞內羅索尼菌te]，Gebhart等認為其屬於解硫弧菌屬 (DeSulfovibrionaceae)[4]。胞內勞森菌主要寄生在病豬腸黏膜細胞內，多呈彎曲形、豆點形、s形或直的桿菌， 能被 LevaditiSilver 或 Warthin-Marry 鍍銀染色法著色，用 Modified Ziehl-Neelsen 染色法細菌被染成紅色。在感染動物中，胞內勞森菌主要存在於腸細胞的原生質內，也可見於糞便中[7』8]。該病是豬的一種接觸性腸道傳染病，是由於大量胞內勞森菌定居於未成熟的腸上皮細胞中，導致細胞大量增生[11]。Guedes等研究顯示，急性感染母豬血清抗體可持續12周，亞臨床感染育肥豬血清抗體可持續2 3周[13]。1931年美國首次報導該病，至今已呈全球性流行[4』12]。世界許多國家和地區，如澳大利亞、墨西哥、加拿大、義大利、丹麥、比利時、巴西、阿根廷、韓國、我國臺灣省等均有發病報導[1』4_6]。雖然豬增生性腸病死亡率不高，但因嚴重影響病豬生長，延長上市時間，是一種具有重要經濟意義的世界性疾病。我國也已證明有該病存在M。由於該細菌在培養基培養未獲成功，也不適應雞胚生長[5]，細胞培養分離鑑定繁瑣耗時。相繼建立的IFA、IPMA、PCR和螢光雜交組化試驗等[14,]診斷方法均存在一些弊端，特異性和靈敏度等均不能滿足檢測的需要，費時易汙染。如IFA與IPMA特異性相似，這二種方法不易區別細菌抗原類型，多適用於確定病性。PCR雖特異性高，但敏感性差異很大， PCR不能檢出隱性感染豬或病原攜帶豬糞便中的細菌，存在假陽性較多等特點，且PCR用於大規模檢測時，後續的電泳很麻煩，不利於高通量快速檢測。另外，因為本病在西方國家中廣泛流行，在進口生豬及豬製品的檢疫中需要提供有效的檢測手段，避免引進該病或該病新的病原，維護國家利益。因而在目前在進出口檢驗檢疫領域中需要有一種快速可靠的，高靈敏度，高特異性的檢測胞內勞森菌的方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種快速可靠檢測胞內勞森菌的技術。本發明為了解決上述技術問題所技術方案是提供一種檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒。該試劑盒是一種PCR試劑盒，包括從提取的樣品DNA中PCR(聚合酶鏈式反應)擴增待測樣品DNA片段的引物對上遊引物(SEQID No. 1) :5，GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3，；下遊引物(SEQID No. 2) :5，TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3，。進一步的，上述檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒中還包括螢光定量PCR引物探針，該螢光定量PCR引物探針的核苷酸序列為5』 -TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3，(SEQ ID No. 3)，並在其 5，端用 6-FAM(6_Carboxyfluorescein，5-羧基螢光素)標記，3，端用 6-TAMRA (6-羧基四甲基羅丹明，6-Carboxytetramethylrhodamine)標記。 可以使用該試劑盒對待測對象的DNA樣本進行螢光定量PCR檢驗，確定其是否含有胞內勞
^^圉ο其中，上述的檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒中還均含有陽性標準品。該陽性標準品即為擴增待測樣品DNA片段的引物對所能擴增出的胞內勞森菌DNA片段 (SEQ IDNo. 4)GAGCACGATTACAAATTGCTTCATTAGCATTCATATTTGTACTTGTCCCTGCACCTCCTTGAATACAAT CCACAACAAATTGATCAAGGAGTTCTCCATTTATGATTTCATTACATGCAGCAGAGATAGCA。本發明還提供了一種檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的方法。該方法包括以下步驟a、獲取樣品總DNA;b、將已計算出拷貝數的含目的基因的質粒作為標準品進行梯度稀釋，採用上、下遊引物和螢光定量PCR引物探針在螢光定量PCR儀上進行螢光實時PCR擴增，有擴增曲線的最低稀釋梯度的拷貝數為本方法為所能檢出的最低模板拷貝數；並以模板拷貝數的對數為X軸，Ct值為Y軸作回歸曲線，利用各梯度濃度下的Ct值做出相應的標準曲線y = ax+b，其中a為斜率，b為截距；χ為Ct值，y為質粒模板的拷貝數；C、使用上、下遊引物、螢光定量PCR引物探針和樣品總DNA在螢光定量PCR儀中進行螢光實時PCR擴增，檢測是否有目標片段的對應Ct值並通過標準曲線和計算得到樣品總 DNA中的目標片段的拷貝數。其中，上述方法中所述的上遊引物的序列為5，GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3，，所述下遊引物的序列為5 』 TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3』。其中，上述方法中所述的使用螢光定量PCR引物探針序列為 5，-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3，，並在 5，端用 FAM 標記，3，端用 TAMRA 標記。樣品總DNA中的目標片段的拷貝數計算公式即為y = aX+b，其中a為標準曲線斜率，b為標準曲線截距；χ為測得的Ct值，y為質粒模板的拷貝數；其中a和b每次會根據每次檢測的具體試驗條件改變而有變動。一般來說標準曲線的相關係數R2應大於0. 95，而且步驟b和步驟c反應條件和體系應一致。本發明方法可以在一般的市售螢光定量PCR儀上進行。其中，上述方法中所述的步驟b和c的螢光實時PCR擴增反應的條件為50°Caiiin ； 950C IOmin ；95°C 15s，60°C 60s,40 個循環。其中，上述方法中所述的步驟b和c的螢光實時PCR擴增反應的反應體系為
42XTaqMan PCRMaster Mix 12. 5ul，上下遊引物各0. 6 μ mol/L，螢光定量PCR引物探針 0. 4μ mol/L，樣品總DNA Iul，補滅菌水至總體積25ul，採用ABI公司的7500螢光定量PCR 儀進行。本發明經過充分的試驗篩選和優化，獨創引物探針、反應條件和陽性對照的最佳配合條件，建立了螢光定量PCR檢查豬增生性腸病的方法並提供了相應的試劑盒。實現了對DNA模板的定量，靈敏度高、特異性和可靠性更強，克服可能的假陽性，能實現快速檢測、 自動化程度高、無汙染性、具實時性和準確性等特點，能在豬增生性腸病隱性感染、發病豬早期快速確診和實時監測等方面發揮重要的作用。而基於一般PCR的檢測方法因技術本身的缺陷，容易導致實驗室汙染，從而導致假陽性，靈敏度也遠遠低於本方法且PCR用於大規模檢測時，後續的電泳很麻煩，不利於高通量快速檢測。因而在檢驗檢疫及獸醫臨床中需要有一種快速可靠的，高靈敏度，高特異性的檢測方法。本方法最終滿足這一現實要求，能夠對臨床樣品進行快速確認。同時因為本病在西方國家中廣泛流行，本研究提供的檢測方法將為檢驗檢疫機構在進口種豬檢疫中提供有效的檢測手段，避免引進該病或該病新的病原，維護國家利益。


圖1目標片段的PCR產物電泳結果。L 分子量對照；1、2 =PPE DNA ；3、4 無模板對照，NTC, no template control。圖2含目標片段的質粒標準品的動力學曲線，從左到右依次分別為梯度稀釋的樣品，濃度分別為4. 2X IO9 4. 2X10°拷貝/ul ；質粒標準品；NTC為無模板對照，縱坐標為信號增加值(Delta Rn)。圖3根據標準品的Ct值繪製的標準品曲線。R2 = 0. 998507，Intercept (截距)= 44. 658695，slop (斜率)e = -3. 337，182，圖中的橫坐標log co為DNA拷貝數的對數(log DNAconcentration)；縱坐標為Ct值(cycle threshold，每個反應管內的螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)。圖4特異性擴增曲線，橫坐標為循環數，縱坐標為信號值。圖5組內重複試驗擴增曲線，橫坐標為循環數，縱坐標為信號值。圖中1 :4.2X109 拷貝質粒；2 :4. 2X IO5拷貝質粒；3 :4. 2X IO2拷貝質粒。圖6臨床樣本的擴增曲線圖，橫坐標為循環數，縱坐標為信號值。從左至右的7條曲線代表樣本1 7。圖7巢式PCR產物電泳結果；其中1 7泳道為臨床樣品的DNA。圖8臨床樣品重複性測定擴增曲線圖，橫坐標為循環數，縱坐標為信號值。1 臨床樣品1，2 臨床樣品2，NTC 無模板對照。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
對本發明進行具體說明。主要儀器和試劑2 X TaqMan PCR Master Mix (ABI公司)；動物組織及血液的DNA提取試劑盒 (QIAGEN公司，千根公司)；7500螢光定量PCR儀(ABI，applied biosystems，美國應用生物系統公司)；水平電泳及凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司，美國伯樂公司)；培養箱；低溫冰箱；恆溫循環水浴槽；高速冷凍離心機；常溫離心機；常規PCR擴增儀(美國PE公司)； 核酸蛋白分析儀等。實施例一螢光定量PCR引物與探針的設計與合成1、螢光定量PCR引物與探針的設計與合成根據GenBank公布的豬增生性腸病基因序列，選擇序列保守區用I^rimer Express3. O設計一對特異性引物及一條Taqman探針(Taqman-probe)。擴增的目的基因片段長131bp。並在其探針5，端用螢光報告基團6-FAM(6-Carb0Xyflu0rescein，
5-羧基螢光素)標記，3』端用螢光報告基團6-TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明，
6-Carboxytetramethylrhodamine)標記，可以使用本領域常規的方法和設備進行標記。本實施例中引物和探針均由上海基康生物技術有限公司合成及標記(序列見表1)。表1引物和TaqMan探針
引物和探針im長度/bp μ Ge比
primer or probesequenceLength°C%
F 5' GAGCACGATTAC AAATTGCTTCA3'2358 39~
R 5 'TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3'2459 42
Taqman-probe 5 'FAM-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC2970 48
AATCCACA-TAMRA 3'2、螢光定量PCR引物合理性的驗證用設計的螢光定量PCR引物進行普通PCR反應，電泳檢測反應產物，對引物的可靠性進行驗證。該反應體系為F(10umol/L) lul，R(10umol/L) Iul, dNTP Mixture (2. 5mmol/ Leach) 2ul，MgCl2 (25mM) 1. 5ul，10XPCR Buffer 2. 5ul, Taq DNA polymerase (5U/ ul)0. 625U，模板 DNA lul，添加 RNaseFree H2O 至總體積 25ul ；擴增程序為:95V 4min ；然後 94°C 20s, 58°C 30s, 70°C 20s，共 30cycles ；最後 70°C Imin ；將 PCR 產物於 2%瓊脂糖凝膠進行電泳。螢光定量PCR引物合理性的驗證結果使用本發明的引物從豬勞森氏胞內菌的 DNA中擴增出一條約130bp的特異性條帶(圖1)與預期大小一致。測序結果(如下所示) 與豬勞森氏胞內菌(在NCBI上的登錄號分別為:EU621798. 1,AM180252. 1,EU127293. 1)相對應的基因序列同源性為99%以上。擴增的目標序列(131bp)GAGCACGATTACAAATTGCTTCATTAGCATTCATATTTGTACTTGTCCCTGCACCTCCTTGAATACAAT CCACAACAAATTGATCAAGGAGTTCTCCATTTATGATTTCATTACATGCAGCAGAGATAGCA。實施例二標準樣品的製備和鑑定使用本發明的引物從豬勞森氏胞內菌的DNA中擴增出一條約130bp的特異性條帶，按膠回收試劑盒使用說明回收目的片斷後克隆到PMD-T Simple載體，再轉化DH5 α大腸埃希菌，挑取在含氨苄青黴素的選擇培養基上長出的白色菌落，37 V培養，抽提質粒，進行PCR快速鑑定，陽性重組質粒純化後，送上海基康生物工程有限公司測序，序列正確的陽性質粒即為豬增生性腸病(PPE)陽性標準品。用核酸蛋白檢測儀檢測其在^Onm處光密度值，然後根據阿伏伽德羅常數6. 02\1(^轉換成拷貝數/^1^，-201保存備用。實施例三螢光定量PCR反應條件的優化採用TaqMan PCR Master Mix(ABI)試劑推薦的25ul體系，以相同濃度陽性質粒為模板，選用不同濃度的引物和探針，採用矩陣法對引物和探針的最佳濃度進行優化，獲得反應的最低Ct值和最高螢光強度增加值(△ to)，提高反應擴增效率與敏感度，並對循環參數進行優化。優化後的螢光定量PCR的反應條件用矩陣法篩選出最佳引物和探針終濃度分別是0. 6 μ mol/L和0. 4 μ mol/L,最佳退火延伸溫度為60°C。綜上最佳反應體系為2 X TaqMan PCRMaster Mix 12. 5ul，上下遊引物各 0. 6ymol/L，探針 0. 4ymol/L，模板 Iul，補滅菌水至總體積25ul ；最佳循環條件為50°C 2min (激活UNG酶)；95°C IOmin (滅活UNG酶，激活 Taq 聚合酶)；95°C 15s，60°C 60s，40 個循環。實施例四螢光定量PCR的靈敏度及標準曲線的生成將已計算出拷貝數的含目的基因的質粒做10倍梯度稀釋，稀釋至用螢光定量PCR 儀不能檢出，以此計算出螢光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數，並做出相應的標準曲線。經測定ODa5tlIim和計算，提取質粒濃度大約是4. 2 X 101°拷貝/ul。將標準品10倍梯度稀釋，取IuL用優化好的Taqman-PCR反應條件進行螢光PCR擴增。如圖2所示，從左向右模板依次為4. 2 X IO9拷貝/ul至4. 2 X 10°拷貝/ul共10個梯度，4. 2 X IO1拷貝 /ul仍有螢光曲線。表明在螢光定量PCR儀上所能檢出的最低拷貝數為4. 2X101拷貝/ μ L0 10個倍次梯度稀釋的標準品Ct值分別為:12. 71，15. 69，19. 18，22. 82，26. 10，28. 40， 32. 68，36. 24,39. 22。以起始模板數的對數為X軸，Ct值為Y軸作回歸曲線，建立相應的標準曲線(圖3)；其中斜率:-3. 337182，截距44. 658695，相關係數R2 = 0.998507，方程為 y = -3. 337182X+44. 658695。(y 循環閾值Ct值，χ 質粒模板的拷貝數)。實施例五螢光定量PCR的特異性檢驗和重複性檢驗1、螢光定量PCR的特異性檢驗用建立的Taqman-PCR方法分別對豬藍耳病毒，豬口蹄疫病毒，豬瘟病毒，豬偽狂犬病毒，豬圓環病毒及PPE陽性組織病料的核酸進行檢測，同時設立用滅菌水代替核酸的1 個陰性對照(NTC)。當陰性對照為陰性時整個試驗有效，可進一步判定結果。螢光定量PCR對核酸的檢測結果如圖4，非靶模板及陰性對照均無擴增曲線，1個 PPE陽性樣品的DNA出現特異性的擴增曲線，表明本方法具有良好的檢測特異性。2、螢光定量PCR的重複性檢驗2. 1組內重複性在同一時間，同一反應條件下將3個不同稀釋度的質粒標準品各進行4次重複檢測，比較用Taqman-PCR檢測各濃度標準品的擴增結果，和同一濃度Ct值的變異情況，測定組內變異係數。檢測結果見表2和圖5。表2組內重複試驗結果
權利要求
1.檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒，其特徵在於包括從提取的樣品 DNA中擴增待測樣品DNA片段的引物對上遊引物5』 GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3，；下遊引物5』 TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3，。
2.根據權利要求1所述的檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒，其特徵在於還包括螢光定量PCR引物探針，該螢光定量PCR引物探針的核苷酸序列為 5』 -TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3』，
3.根據權利要求2所述的檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒，其特徵在於所述螢光定量PCR引物探針5』端用6-羧基螢光素標記，3』端用6-羧基四甲基羅丹明標記。
4.根據權利要求2所述的檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的試劑盒，其特徵在於還含有陽性標準品
5.檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的方法其特徵在於該方法包括以下步驟a、獲取樣品總DNA；b、將已計算出拷貝數的含目的基因的質粒作為標準品進行梯度稀釋，採用上、下遊引物和螢光定量PCR引物探針在螢光定量PCR儀上進行螢光實時PCR擴增，有擴增曲線的最低稀釋梯度的拷貝數為本方法為所能檢出的最低模板拷貝數；並以模板拷貝數的對數為X 軸，Ct值為Y軸作回歸曲線，利用各梯度濃度下的Ct值做出相應的標準曲線y = ax+b，其中a為斜率，b為截距；χ為Ct值，y為質粒模板的拷貝數；c、使用上、下遊引物、螢光定量PCR引物探針和樣品總DNA在螢光定量PCR儀中進行螢光實時PCR擴增，檢測是否有目標片段的對應Ct值並通過標準曲線和反應循環數計算得到樣品總DNA中的目標片段的拷貝數；所述上遊引物的序列為5 』 GAGCACGATTACAAATTGCTTCA3 』，所述下遊引物的序列為 5』 TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA3』 ；所述螢光定量PCR引物探針的序列為5，-TCCCTGCACCTCCTTGAATAC AATCCACA-3，，並在其5』端用6-羧基螢光素標記，3』端用6-羧基四甲基羅丹明標記。
6.根據權利要求5所述的檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的方法其特徵在於所述步驟b和c的螢光實時PCR擴增反應的條件為50°Canin ；95°C IOmin ；95°C 15s，60°C60s， 40個循環。
7.根據權利要求6所述的檢測豬增生性腸病病原菌胞內勞森菌的方法其特徵在於所述步驟b和c的螢光實時PCR擴增反應的反應體系為2XTaqMan PCR Master Mix 12. 5ul, 上下遊引物各0. 6μ mol/L，螢光定量PCR引物探針0. 4 μ mol/L，樣品總DNA Iul，補滅菌水至總體積25ul。
全文摘要
本發明屬於牲畜傳染病病原檢驗檢疫領域，具體涉及一種勞森胞內菌的檢測試劑盒和檢測方法。本發明為了解決上述技術問題所採用的技術方案是提供一種檢測豬增生性腸病病原勞森胞內菌的試劑盒，包括從提取的樣品DNA中擴增待測樣品DNA片段的引物對。本發明經過充分的試驗篩選和優化，獨創引物探針、反應條件、陽性對照及最佳配合條件，從而建立了一種快速可靠螢光定量PCR檢測豬增生性腸病的方法。實現了對DNA模板的定量，靈敏度高、特異性和可靠性更強、克服可能的假陽性、自動化程度高、無汙染性、具實時性和準確性等特點，能在豬增生性腸病健康帶毒感染、發病豬早期快速確診和實時監測等方面發揮重要的作用。
文檔編號C12Q1/68GK102453762SQ201010617600
公開日2012年5月16日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者嚴玉寶, 餘華, 楊苗, 田綠波, 胡娟, 郭楊, 陳世界 申請人:中華人民共和國四川出入境檢驗檢疫局