利用離體植株組織生產紫杉醇的方法
2023-05-20 09:06:06
專利名稱：利用離體植株組織生產紫杉醇的方法
技術領域：
本發明屬於生產藥物的生物方法，具體涉及利用紅豆杉科植株枝葉生產紫杉醇的方法。
背景技術：
目前，紫杉醇由於其獨特的抑瘤機理和顯著的抗癌活性，雄踞抗癌藥物市場份額的首位，佔世界尚主要抗癌藥物市場份額的22％。2000年，BMS公司報導，年紫杉醇針劑(TaxolTM)銷售額為159.2億美元，平均每天銷售額大於430萬美元。天然紫杉醇主要來源於紅豆杉屬(Taxus)植株，為常綠喬木或灌木，全世界約有11種，我國是紅豆杉原生地之一，有其中的4種和1個變種，即西藏紅豆杉(T.wallichiana)、東北紅豆杉(T.cuspidata)、雲南紅豆杉(T.yunnanensis)、中國紅豆杉(T.chinensis)和南方紅豆杉(T.chinensis var mairei)。天然紫杉醇的含量很低，大約只有紅豆杉樹皮乾重的0.01％，每治療一個癌症患者需要3-6棵60-100年生的紅豆杉主幹樹皮，而且由於紅豆杉植株生長緩慢，定量砍伐已經造成了紅豆杉資源的極度缺乏，見劉本葉，葉和春利用生物技術生產紫杉醇的研究進展.生物學通報，1999，345～8。化學全合成生產紫杉醇雖然已經完成，但需要的步驟複雜，耗費巨大，不具備大規範商業化生產的價值，見Nicolaou K.C.，Yang Z.，Liu J.J.，Ueno H.，Nantermet P.G.，GuyK.K.，Guy R.K.，Claiborne C.F.，Renaud J.，Couladouros E.A.Paulvannan K.，Sorensen E.J.Total synthesis of taxol.Nature，1994，367630～634。生物方法生產紫杉醇被認為是解決紫杉醇來源問題最具前景的途徑，目前許多公司採用半合成的辦法來生產紫杉醇，即從紅豆杉枝葉中提取紫杉醇的前體物，然後通過化學修飾，合成紫杉醇及其類似物，見周忠強，梅興國，常俊麗，陳菁，柯鐵，紫杉醇化學半合成進展，廣州化學，2000，26(3)52～60。採摘回來的紅豆杉枝葉一般通過殺青處理，然後粉碎，烘乾，進一步採用化學藥劑浸提，獲得浸膏，然後通過分離純化，得到紫杉醇和各種紫杉烷的純品，見閻家麟，範金城，王九一，紫杉醇提取純化工藝，中國醫藥工業雜誌，1996，27(12)531～534。以上生產工藝中，植物材料沒有經過合理的採後加工處理，不僅枝葉中的紫杉醇含量低，而且在上述生產過程中，紫杉醇及其前體物降解嚴重，帶來目標化合物得率低和產量不穩定等問題。
發明內容
本發明提供一種利用離體植株組織生產紫杉醇的方法，建立了合理的採摘工藝和採後加工技術，解決目前紅豆杉枝葉採摘後直接提取的缺點，目的是提高採摘紅豆杉枝葉中紫杉醇含量。
本發明的一種利用離體植株組織生產紫杉醇的方法，依序包括下述步驟(1)選擇春秋季節，採摘當年生紅豆杉新鮮枝葉；(2)預處理清洗去除新鮮枝葉中雜質，晾乾，裁剪其長度至20-40cm；(3)將裁剪後的紅豆杉枝葉扦插於無菌固體改良MS培養基上、或者將剪碎後的紅豆杉枝葉培養於無菌液體改良MS培養基中，外加營養，保持外植體活性，培養基中添加藥劑抑制雜菌汙染，培養環境條件黑暗、蔭涼、乾淨；(4)上述步驟(3)培養過程的同時誘導處理分別採用真菌誘導子，稀土元素或化學誘導劑對外植體誘導，扦插培養3-6天，剪碎培養1-3天；(5)上述步驟(3)培養過程的同時在培養基中添加紫杉醇生物合成的前體物質；(6)對經過前述培養、誘導、前體添加的紅豆杉枝葉採用常規方法低溫粉碎、有機溶劑浸提，得到紫杉醇浸提物。
上述的生產紫杉醇的方法，其特徵是所述步驟(3)中，培養條件為黑暗，溫度15-30℃，紫外滅菌保持環境乾淨，培養基中添加50mg/L重鉻酸鉀或50mg/L卡那黴素以防止防止雜菌汙染。
上述生產紫杉醇的方法，所述步驟(4)中，真菌誘導子為紅豆杉樹皮中分離得到內生的黑麴黴、青黴菌、鏈黴菌、酵母或赤黴菌的細胞壁多糖提取物，濃度為50mg/L；稀土元素包括硝酸鑭、硫酸鈰銨、硝酸亞鈰，濃度為2mg/L；化學誘導劑包括茉莉酸甲酯、濃度為100μmol/L，茉莉酸、濃度為100μmol/L，水楊酸、濃度為80mg/L，矮壯素、濃度為10mg/L，乙烯利、濃度為1-5mg/L。
上述生產紫杉醇的方法，在所述步驟(5)中，添加的前體物質分別為苯丙氨酸、濃度為2mmol/L，苯甲酸鈉、濃度為0.5mmol/L，醋酸鈉、濃度為2mmol/L，甘氨酸、濃度為0.1mmol/L。
本發明方法的反應原理是有選擇的採摘生理活性高的紅豆杉枝葉，利用植物體內固有的紫杉醇合成酶系，選擇合的誘導和反應條件，添加誘導子促進紅豆杉枝葉中固有的酶系活性，將其中高含量的前體物質轉化為附加值高的紫杉醇，紫杉醇含量提高了67％左右，並添加前體物質，使紅豆杉枝葉中的紫杉醇代謝前體物質朝合成紫杉醇的方向轉化，提高枝葉中紫杉醇的得率。
本發明的優點在於1.利用紅豆杉植株的可再生的當年生枝葉，代替傳統紫杉醇提取工藝中採用的紅豆杉主幹樹皮，不僅不會對紅豆杉資源造成破壞，而且可以進行有效的開發利用。
2.對採集的紅豆杉枝葉進行有效的誘導和調控，使枝葉中的次生代謝前體物質轉化為紫杉醇，代替傳統工業中採用的直接提取前體，然後進行體外半合成的方法，有效的利用了枝葉中豐富的酶系，催化前體物質合成具有藥用價值的紫杉醇，工藝更簡單。
3.傳統工藝中，紅豆杉枝葉在存放過程中常會發生紫杉醇和前體物質降解，導致提取得率低下和不穩定；本發明中，採用合適的採後條件，包括溫度、光照、營養、外加前體物質和誘導等，充分保持紅豆杉枝葉的生理活性，並促使枝葉中的前體物質向紫杉醇合成的方向轉化。
4.傳統工業中，紅豆杉枝葉中紫杉醇含量低，代謝前體成分複雜，含量各異，因此提取和純化需要大量的步驟和費用；本發明中，通過體外培養，將紅豆杉枝葉中大量的前體物質轉化為紫杉醇，提高了外植體中有用成分的含量，使提取成分單一，效率更高。
5.整個反應，無需外加酶系，生產成本低。
6.產品易於回收，生產工藝簡單，無汙染物排放。
具體實施例方式
實施例1春季採集紅豆杉當年生枝葉，裁剪至20cm左右，無菌條件下取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MJ)誘導紫杉醇及其前體物質的產生。培養環境紫外滅菌，25±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高67％。
實施例2秋天採集紅豆杉當年生枝葉，裁剪至40cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於200mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L真菌誘導子黑麴黴細胞壁多糖誘導紫杉醇及其前體物質的產生。25±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高60％。
實施例3春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1卡那黴素，抑制汙染，2mg/L硝酸亞鈰誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第3天取樣分析，紫杉醇含量提高37％。
實施例4春季採樣，無菌條件下分別剪碎約5g針葉+5g樹皮組織(2×4mm左右大小)，接種於100mL液體改良MS培養基中，同上添加50mg.L-1重鉻酸鉀和100uM茉莉酸甲酯。25±1℃，120r/mL暗培養，於接種後第1d取樣分析，紫杉醇含量提高40％。
實施例5秋季採樣，流水衝洗乾淨，無菌條件下分別剪碎約5g針葉+5g樹皮組織(2×4mm左右大小)，接種於100mL液體改良MS培養基中，同上添加50mg.L-1卡那黴素和50mg/L真菌誘導子黑麴黴多糖。25±1℃，120r/mL暗培養，於接種後第3d取樣分析，紫杉醇含量提高41％。
實施例6秋季採樣，無菌條件下分別剪碎約5g針葉+5g樹皮組織(2×4mm左右大小)，接種於100mL液體改良MS培養基中，同上添加50mg.L-1重鉻酸鉀和2mg/L硝酸亞鈰。培養環境紫外滅菌，30±1℃，120r/mL暗培養，於接種後第1d取樣分析，紫杉醇含量提高43％。
實施例7春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制黴汙染，100uM茉莉酸誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第3天取樣分析，紫杉醇含量提高43％。
實施例8春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，80mg/L水楊酸誘導紫杉醇及其前體物質的產生。15℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高30％。
實施例9春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，10mg/L矮壯素誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高38％。
實施例10春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L青黴菌細胞壁多糖提取物誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高18％。
實施例11春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L鏈黴菌細胞壁多糖提取物誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高27％。
實施例12
春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L根黴細胞壁多糖提取物誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高27％。
實施例13春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L酵母細胞壁多糖提取物誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高41％。
實施例14春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L赤黴菌細胞壁多糖提取物誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高43％實施例15春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，2mg/L硝酸鑭誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高14％。
實施例16春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，2mg/L硫酸鈰銨誘導紫杉醇及其前體物質的產生。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高17％。
實施例17春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，2mg/L硝酸亞鈰誘導紫杉醇及其前體物質的產生，同時添加2mmol/L苯丙氨酸。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高48％。
實施例18春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，100μmol/L茉莉酸甲酯和5mg/L乙烯利誘導紫杉醇及其前體物質的產生，同時添加0.5mmol/L苯甲酸鈉前體物質。30±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高61％。
實施例19春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L黑麴黴細胞壁多糖提取物誘導紫杉醇及其前體物質的產生，同時添加2mmol/L醋酸鈉前體物質。25±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高57％。
實施例20春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，無菌條件下分別剪取25g枝葉扦插於100mL固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，80mg/L水楊酸誘導和1mg/L乙烯利紫杉醇及其前體物質的產生，同時添加0.1mmol/L甘氨酸。25±1℃暗培養，於接種後第6天取樣分析，紫杉醇含量提高48％。
實施例21春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，剪取5000g枝葉扦插於固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1重鉻酸鉀，抑制汙染，50mg/L黑麴黴細胞壁多糖誘導紫杉醇及其前體物質的產生，同時添加0.1mmol/L甘氨酸。25℃暗培養，於接種後第6天，提取紅豆杉枝葉，獲得紫杉醇及其前體物質地浸膏，經分析，紫杉醇含量提高48％。
實施例22春季採樣，枝葉裁剪至30cm左右，剪取5000g枝葉扦插於固體改良MS培養基中，添加50mg.L-1卡那黴素，抑制汙染，100μmol/L茉莉酸甲酯和5mg/L乙烯利誘導紫杉醇及其前體物質的產生，同時添加2mmol/L苯丙氨酸。25℃暗培養，於接種後第6天，製備紫杉醇及其前體浸膏，經分析，紫杉醇含量提高56％。
權利要求
1.利用離體植株組織生產紫杉醇的方法，依序包括下述步驟(1)選擇春秋季節，採摘當年生紅豆杉新鮮枝葉；(2)預處理清洗去除新鮮枝葉中雜質，晾乾，裁剪其長度至20-40cm；(3)將裁剪後的紅豆杉枝葉扦插於無菌固體改良MS培養基上、或者將剪碎後的紅豆杉枝葉培養於無菌液體改良MS培養基中，外加營養，保持外植體活性，培養基中添加藥劑抑制雜菌汙染，培養環境條件黑暗、蔭涼、乾淨；(4)上述步驟(3)培養過程的同時誘導處理分別採用真菌誘導子，稀土元素或化學誘導劑對外植體誘導，扦插培養3-6天，剪碎培養1-3天；(5)上述步驟(3)培養過程的同時在培養基中添加紫杉醇生物合成的前體物質；(6)對經過前述培養、誘導、前體添加的紅豆杉枝葉採用常規方法低溫粉碎、有機溶劑浸提，得到紫杉醇浸提物。
2.如權利要求1所述生產紫杉醇的方法，其特徵是所述步驟(3)中，培養條件為黑暗，溫度15-30℃，紫外滅菌保持環境乾淨，培養基中添加50mg/L重鉻酸鉀或50mg/L卡那黴素以防止防止雜菌汙染。
3.如權利要求1或2所述生產紫杉醇的方法，其特徵是所述步驟(4)中，真菌誘導子為紅豆杉樹皮中分離得到內生的黑麴黴、青黴菌、鏈黴菌、酵母或赤黴菌的細胞壁多糖提取物，濃度為50mg/L；稀土元素包括硝酸鑭、硫酸鈰銨、硝酸亞鈰，濃度為2mg/L；化學誘導劑包括茉莉酸甲酯、濃度為100μmol/L，茉莉酸、濃度為100μmol/L，水楊酸、濃度為80mg/L，矮壯素、濃度為10mg/L，乙烯利、濃度為1-5mg/L。
4.如權利要求1或2所述生產紫杉醇的方法，其特徵是在所述步驟(5)中，添加的前體物質分別為苯丙氨酸、濃度為2mmol/L，苯甲酸鈉、濃度為0.5mmol/L，醋酸鈉、濃度為2mmol/L，甘氨酸、濃度為0.1mmol/L。
5.如權利要求3所述生產紫杉醇的方法，其特徵是在所述步驟(5)中，添加的前體物質分別為苯丙氨酸、濃度為2mmol/L，苯甲酸鈉、濃度為0.5mmol/L，醋酸鈉、濃度為2mmol/L，甘氨酸、濃度為0.1mmol/L。
全文摘要
利用離體植株組織生產紫杉醇的方法，屬於生產藥物的生物方法，具體涉及利用紅豆杉科植株枝葉生產紫杉醇的方法，解決目前紅豆杉枝葉採摘後直接提取的缺點，目的是提高採摘紅豆杉枝葉中紫杉醇含量。本發明依序包括下述步驟(1)選擇季節採摘當年生紅豆杉新鮮枝葉；(2)清洗、晾乾併合理裁剪；(3)在黑暗、蔭涼和外加營養條件下通過扦插或枝葉剪碎後組織培養；(4)培養的同時對外植體誘導處理；(5)培養過程的同時在培養基中添加紫杉醇生物合成的前體物質；(6)採用常規方法低溫粉碎、有機溶劑浸提，得到紫杉醇浸提物。本發明大大提高紫杉醇的產量，降低前體物的含量，產品易於回收，無汙染物排放。
文檔編號A01H4/00GK1628506SQ20041006096
公開日2005年6月22日 申請日期2004年10月15日 優先權日2004年10月15日
發明者餘龍江, 劉智, 趙春芳, 付春華, 楊英, 楊秦, 李麗琴 申請人:華中科技大學