一種芒果加工副產物多糖脫蛋白及脫色方法與流程
2023-05-19 17:13:26 3
本發明屬於園藝作物產品深加工技術領域，特別涉及一種芒果加工副產物多糖脫蛋白和脫色方法。
背景技術：
芒果，又名蜜望、檬果，是一種熱帶漆樹科常綠喬木，在我國熱帶亞熱帶地區廣泛種植，因其果肉細膩、營養豐富、風味獨特而深受大眾喜愛，具有益胃、解渴、潤膚、止嘔的功效。每年在芒果生產加工過程中約產生數百萬噸皮渣，常被當作垃圾堆積處理，嚴重汙染環境。
多糖是芒果皮渣中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、免疫調節、降血糖、降血脂等功效。近年來，芒果皮渣中多糖的提取已受到許多研究者的廣泛關注。李金花等（2012）採用水提醇沉法從芒果葉中提取粗多糖，測得其含量為1.51%；王維民等（2005）以紅芒果皮渣為原料，在料液比1:5g/ml，溫度90℃，時間2h的條件下提取多糖，提取率可達3.538%。目前，本實驗室已從芒果皮渣中分離出粗多糖，但製得的多糖蛋白質含量較高，顏色較深（呈褐色），這不但影響多糖作為食品添加劑或功能性食品基料的外觀，而且對後續多糖的純化產生很大影響，所以脫去與活性多糖相結合的蛋白質分子和色素成分迫在眉睫。為了在芒果粗多糖的處理過程中獲得更多具有高活性的多糖，研究一種能在高效脫除蛋白質和色素時保留較高多糖有效成分的脫蛋白和脫色方法是十分必要的。
多糖的脫蛋白方法常用的有sevage法、三氯乙酸（tca）法、tca-正丁醇法、酶法、鹽酸法、樹脂法等，往往因多糖來源不同而有差異；脫色方法主要有活性炭法、殼聚糖法、h2o2法、聚醯胺法、大孔吸附樹脂法等，活性炭由於具有較高的吸附能力，脫色成本低且不易影響待脫色物質的生物活性而在工業化生產中得到了廣泛應用。但在此之前，幾乎沒有關於芒果多糖的脫蛋白和脫色工藝優化研究。
技術實現要素：
本發明的在於提供一種芒果加工副產物多糖的脫蛋白和脫色方法，本發明是通過將芒果皮渣經預處理後製得芒果皮渣勻漿，採用超聲波輔助纖維素酶法提取粗多糖，並進行粗多糖的脫蛋白及脫色，獲得芒果多糖半純品，本發明方法簡單、快速，具有較高的脫蛋白率、脫色率和多糖保留率。
本發明採用如下技術方案：一種芒果加工副產物多糖的脫蛋白和脫色方法，包括以下步驟：
（1）芒果加工副產物的預處理：選取無損傷、無病害的芒果，取皮渣，清洗，切片，沸水浴滅活2min，按1:4~1:5g/ml料液比將芒果皮渣與蒸餾水混合，於搗碎機中勻漿，得芒果皮渣勻漿，4℃冷藏備用；
（2）芒果粗多糖的提取：取步驟（1）製得的芒果皮渣勻漿，以蒸餾水為提取劑，採用超聲波輔助纖維素酶法提取多糖；取提取液分離出上清液，真空減壓濃縮至10ml，加入濃縮液3~5倍體積分數95%乙醇，4℃沉析過夜，以轉速4000~5000r/min離心5~10min，所得沉澱依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2~4次，得到透明膠狀多糖；
（3）芒果粗多糖的脫蛋白：將步驟（2）所得的透明膠狀多糖復溶於蒸餾水中，配置成5mg/ml的多糖溶液，加入tca-正丁醇混合溶液，於恆溫搖床中振蕩反應脫蛋白，靜置分層後取下層溶液，為脫蛋白後的芒果粗多糖溶液，測定其中蛋白質含量和多糖含量；
（4）芒果粗多糖的脫色：取20ml脫蛋白後的芒果粗多糖溶液，加入粉末活性炭於恆溫搖床中振蕩吸附脫色，6000~8000r/min離心10~20min，取上清液過膜，得脫色後的多糖溶液，測定多糖含量，並在多糖溶液最大吸收波長下測定吸光度，計算脫色率；將脫色後的多糖溶液轉移至透析袋中，流動蒸餾水透析72h，真空冷凍乾燥即得芒果粗多糖。
進一步的，所述步驟（2）中，芒果粗多糖的提取條件為：取芒果皮渣勻漿，以1:2~1:5g/ml料液比加入蒸餾水，復水30min，調節ph為3.0~6.0，加入0.5%~1.5%（以芒果皮渣質量計）纖維素酶，於超聲波清洗儀中以120w~300w的功率於40~60℃提取40~80min，升溫至90℃滅酶30min，所得提取液經6000r/min離心10min，收集上清液，殘渣重複提取1~2次。
進一步的，所述步驟（3）中，芒果粗多糖的脫蛋白條件為：tca-正丁醇混合溶液與多糖溶液體積比為2:1~1:2、tca-正丁醇混合溶液中tca與正丁醇體積比為1:5~1:20、靜置時間1~3h、振蕩時間1~3h。
優選的，所述步驟（3）中，芒果粗多糖的脫蛋白條件為：tca-正丁醇混合溶液與多糖溶液體積比為2:1、tca-正丁醇混合溶液中tca與正丁醇體積比為1:20、靜置時間2h、振蕩時間2h，振蕩速度160r/min。
進一步的，所述步驟（4）中，粉末活性炭的脫色條件為：調節多糖溶液ph為3.0~5.0，添加0.5~2.0%（m/v，以多糖溶液體積計）活性炭，40~60℃振蕩脫色40~80min；過膜方法為：0.22µm微孔水系濾膜，真空泵抽濾。
優選的，所述步驟（4）中，粉末活性炭的脫色條件為：調節多糖溶液ph為3.0，添加1.5%（m/v，以多糖溶液體積計）活性炭，50℃振蕩脫色75min；過膜方法為：0.22µm微孔水系濾膜，真空泵抽濾。
所述步驟（3）芒果粗多糖的脫蛋白以蛋白質脫除率和多糖保留率為評價指標，試驗數據採用綜合加權評分法，評分標準為：設定蛋白質脫除率和多糖保留率的權重係數為0.5，將各項中的指標分別除以該列中的最大值再乘以100即為該項的得分，綜合評分z=0.5x+0.5y，其中x為蛋白質脫除率，y為多糖保留率。所述步驟（4）芒果粗多糖的脫色的評價指標為脫色率和多糖保留率，試驗數據採用綜合加權評分法，評分標準參照芒果粗多糖脫蛋白實驗中的方法。
本發明技術方案中，對芒果粗多糖脫蛋白方法、脫色方法、脫蛋白條件和脫色條件進行了篩選或優化，獲得最優的技術方案為：採用tca-正丁醇法對芒果多糖進行脫蛋白，脫蛋白最佳工藝條件為：tca-正丁醇與多糖溶液體積比2:1，三氯乙酸與正丁醇體積比1:20，靜置時間2h，振蕩時間2h；採用活性炭法脫色，活性炭脫色最佳條件為：脫色溫度50℃，脫色時間75min，活性炭添加量1.5%，ph為3.0；具體說明如下。
1、芒果粗多糖脫蛋白方法的篩選：配置5mg/ml的芒果粗多糖溶液，取30ml分別按以下方法進行脫蛋白試驗。
（1）tca法：向多糖溶液中加入等體積20%tca，160r/min振蕩2h，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（2）tca-正丁醇法：向多糖溶液中加入60mltca-正丁醇溶液（tca濃度20%，tca:正丁醇=1:10），160r/min振蕩2h，靜置分層後取下層溶液，測定其中蛋白質含量和多糖含量。
（3）sevage法：向多糖溶液中加入1/4體積的sevage試劑（氯仿:正丁醇=1:4），180r/min振蕩60min，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（4）tca-sevage聯用法：取多糖溶液，採用上述tca法（tca濃度為10%）處理後，再採用sevage法脫蛋白，分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（5）木瓜蛋白酶法：取多糖溶液，調節ph為6.5，加入5%木瓜蛋白酶（酶濃度1mg/ml），65℃水解5h，沸水浴中滅酶5min，冷卻至室溫，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（6）木瓜蛋白酶-sevage聯用法：取多糖溶液，依次用木瓜蛋白酶法和sevage法脫蛋白，分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（7）木瓜蛋白酶-tca聯用法：取多糖溶液，依次用木瓜蛋白酶法和tca法脫蛋白，分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（8）木瓜蛋白酶+tca-正丁醇聯用法：取多糖溶液，依次用木瓜蛋白酶法和tca-正丁醇法脫蛋白，分別測定蛋白質含量和多糖含量。
（9）hcl法：向多糖溶液中加入等體積1mol/lhcl，160r/min振蕩2h，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。
結果表明，tca-正丁醇法和木瓜蛋白酶與tca-正丁醇聯用法對粗多糖中的蛋白質脫除效果較好，脫除率均高於80%，但後者的多糖保留率較低，這可能是由於多次操作造成部分多糖損失。tca法、tca-sevage法、hcl法、木瓜蛋白酶-tca聯用法對粗多糖的蛋白質脫除率均高於50%，但多糖損失較嚴重，這可能是由於tca法、hcl法在脫除蛋白的同時，過酸的環境造成多糖的降解；sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-sevage聯用法的脫蛋白效果較差，脫除率僅為10%。因此，本發明技術方案中選擇tca-正丁醇法對芒果多糖進行脫蛋白（圖1）。
2、tca-正丁醇法脫蛋白條件優化：選取tca-正丁醇與樣液（多糖溶液）體積比（a）、tca與正丁醇體積比（b）、靜置時間（c/h）、振蕩時間（d/h）4個因素，按l9(34)正交表設計實驗，以確定最佳脫蛋白條件，因素水平見表1
。
結果表明，影響tca-正丁醇法脫蛋白效果的因素大小順序為：a>b>d>c，即tca-正丁醇與樣液的體積比對脫蛋白效果影響最大，其次為tca與正丁醇的體積比，再次是振蕩時間，靜置時間對脫蛋白效果影響最小。tca-正丁醇法脫蛋白的最佳工藝條件為a1b3c2d2，即tca-正丁醇與樣液體積比2:1，三氯乙酸與正丁醇體積比1:20，靜置時間2h，振蕩時間2h。對正交試驗結果進行方差分析，結果如表3。由於靜置時間引起的偏差平方和最小，故選靜置時間列為誤差所在列，由表3可知，因素a、b、d對蛋白質脫除率影響顯著，c影響不顯著。對最佳工藝進行驗證試驗，得出蛋白質脫除率為90.08%，多糖保留率為94.40%，表明試驗所得工藝條件為最優工藝條件。
3、活性炭法不同脫色條件對脫蛋白後多糖溶液脫色效果的影響
（1）單因素實驗設計：單因素設定因素為活性炭用量、脫色溫度、脫色時間、樣液ph值，分別考察4個因素對脫蛋白後多糖溶液脫色效果的影響。固定多糖溶液ph為3.0，脫色溫度50℃、振蕩時間1h，活性炭用量0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%；固定多糖溶液ph為3.0，活性炭用量1.0%，振蕩時間1h，脫色溫度30、40、50、60、70℃；固定多糖溶液ph為3.0，活性炭用量1.0%，脫色溫度50℃、脫色時間20、40、60、80、100、120min；固定活性炭用量1.0%，脫色溫度50℃、脫色時間80min，多糖溶液ph為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0。
結果表明，隨著活性炭用量的增加，脫色率逐漸增大，而多糖保留率卻逐漸降低，綜合考慮，活性炭用量在0.5%～1.5%為宜（圖2）。脫色溫度在40～70℃的範圍內，脫色率較大，50℃時達到最大；多糖保留率在40℃時達到最大，此後繼續升高溫度，多糖保留率緩慢降低。故選取50℃進行脫色效果較好（圖3）。隨著時間的延長，脫色率呈先增加後減小趨勢，60min時達到最大值；多糖保留率隨著脫色時間的延長緩慢降低，在60～100min的範圍內降低趨勢較平緩，綜合考慮選擇最佳脫色時間為60min（圖4）。隨著ph的增加，脫色率逐漸增加，當ph大於3.0後，脫色率反而開始下降；多糖保留率隨著ph的增加先減小後增加，當ph達到5.0後，增加十分緩慢。綜合考慮選擇樣液ph為4.0（圖5）。
（2）正交優化實驗設計：根據單因素試驗結果，選取脫色溫度（a/℃）、脫色時間（b/min）、活性炭添加量（c/%）、ph值（d）4個因素按l9(34)正交表設計試驗，因素水平見表4：
。
結果表明，影響活性炭脫色效果的因素大小順序為：a>c>b>d，即脫色溫度對脫色效果影響最大，其次為活性炭添加量，再次是脫色時間，ph值對脫色效果影響最小。活性炭法脫色的最佳條件為a1b3c3d1，即脫色溫度50℃，脫色時間75min，活性炭添加量1.5%，ph為3.0。按優化的工藝條件進行驗證試驗，得脫色率為70.98%，多糖保留率為92.77%，表明試驗確定的工藝條件為最佳工藝條件。
4、不同脫色方法對芒果多糖脫色率的影響。
方法一：h2o2法：取20ml脫蛋白後的多糖溶液，用2mol/lnaoh調ph至8.0～9.0，滴加30%h2o2至淺黃色（多糖液/h2o2=4:1，v/v），於40℃恆溫搖床中振蕩脫色2h，離心取上清液分別測定脫色率和多糖保留率。
方法二：大孔吸附樹脂脫色法：取20ml脫蛋白的多糖溶液，加入4gs-8樹脂，於30℃恆溫搖床中以160r/min振蕩吸附12h，過濾後取上清液分別測定脫色率和多糖保留率。
方法三：活性炭脫色法：按上述優化的最佳作用條件行脫色試驗，分別測定脫色率和多糖保留率。
結果表明，活性炭法對芒果多糖的脫色效果較好，脫除率達到67.3%，分別高出h2o2法和大孔吸附樹脂法45.4%和53.1%，且多糖保留率也較高，故本發明選擇活性炭法對多糖液進行脫色（圖6）。
本發明涉及的樣品（包括芒果粗多糖溶液、脫蛋白/脫色後的多糖溶液）各項含量的測定方法說明如下：
（1）樣品蛋白質含量的測定採用考馬斯亮藍g-250比色法，將樣品稀釋5~10x，取1ml加入5ml考馬斯亮藍g-250，靜置2~10min，在595nm波長下測定od值，利用公式y=0.0007x+0.0057，（r2=0.9996）計算蛋白質含量；
（2）樣品粗多糖含量的測定採用苯酚-硫酸法，將樣品稀釋10~25x，取1ml加蒸餾水稀釋至2ml，後加入1ml6%苯酚，5ml濃硫酸，振蕩均勻後靜置30min在490nm波長下測定od值，利用公式y=0.0110x-0.0002（r2=0.9994）計算多糖含量；
（3）樣品色素含量的測定方法為：將經粉末活性炭脫色後的多糖樣品離心、過膜後，於310nm波長下測定吸光度，進而計算脫色率，脫色率的計算公式如下：
脫色率=（脫色前吸光度-脫色後吸光度）/脫色前吸光度×100%
本發明相對於現有技術具有如下有益效果：
（1）利用芒果加工副產物皮渣為原料提取粗多糖，一方面有利於提高芒果深加工產業的附加值，減輕環境汙染；另一方面，本發明直接利用廢棄物鮮樣提取多糖，與傳統的乾燥粉碎樣前處理方式相比，簡化了提取工藝，降低了企業的生產成本；
（2）本發明設計採用超聲波輔助纖維素酶法提取芒果加工副產物多糖，纖維素酶能酶解細胞壁中的纖維素，超聲波的空化效應和振動作用，能促進細胞壁的破裂，有利於多糖的溶出，同時超聲波還有助於纖維素酶與細胞壁中纖維素充分接觸，是一種新的、有效的芒果多糖提取方法；
（3）本發明優化後的tca-正丁醇法對芒果皮渣中的芒果粗多糖具有良好的脫蛋白效果，在蛋白質脫除率高達90.08%，此時多糖保留率為94.4%；
（4）本發明採用活性炭對脫蛋白後的多糖溶液進行脫色，簡單、快速，可獲得較高的脫色率（70.98%）和多糖保留率（92.77%）；
（5）本方法為後續芒果多糖的分離純化及結構鑑定提供了理論參考，製得的芒果多糖半純品可用於食品和化妝品的配製。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1不同方法對蛋白質脫除率和多糖損失率的影響。
圖2活性炭用量對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。
圖3脫色溫度對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。
圖4脫色時間對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。
圖5樣液ph對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。
圖6不同方法對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。
實施例1採用以下步驟實現本發明：
（1）芒果加工副產物的預處理：選取無損傷、無病害的芒果，取皮渣，清洗，切片，沸水浴滅活2min，以1:5g/ml料液比將芒果皮渣與蒸餾水混合，於搗碎機中勻漿，得芒果皮渣勻漿，4℃冷藏備用；
（2）芒果粗多糖的提取：取經步驟（1）處理的芒果皮渣勻漿30g，加入90ml蒸餾水，復水30min、調節ph為5.0、加入芒果皮渣質量1.0%的纖維素酶、於超聲波清洗儀中以240w的功率，於50℃提取60min，升溫至90℃滅酶30min；所得提取液經6000r/min離心10min，收集上清液，殘渣重複提取1次；提取液分離出上清液，真空減壓濃縮至10ml，加入濃縮液4倍體積95%乙醇，4℃沉析過夜，5000r/min離心10min，所得的沉澱依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，得到透明膠狀多糖；
（3）芒果粗多糖的脫蛋白：將透明膠狀多糖復溶於蒸餾水中，配置成5mg/ml的多糖溶液，取30ml，加入60mltca-正丁醇混合溶液（tca與正丁醇體積比為1:10），於28℃恆溫搖床中160r/min振蕩反應2h，將多糖溶液轉移至分液漏鬥中靜置1h，分層後取下層溶液測定其中蛋白質和多糖含量；測得蛋白質脫除率83.45%，多糖保留率92.56%；
（4）芒果粗多糖的脫色：取20ml上述脫蛋白後的芒果粗多糖溶液，調節ph為3.0，加入1.0%（m/v，以多糖溶液體積計）的粉末活性炭，於50℃、160r/min振蕩吸附脫色100min，8000r/min離心20min，取上清液過0.22µm濾膜去除活性炭，測定多糖含量，並在310nm波長下測定上清液的吸光度，計算脫色率；測得脫色率為60.38%，多糖保留率為88.11%。
實施例2採用以下步驟實現本發明：
（1）芒果加工副產物的預處理：選取無損傷、無病害的芒果，取皮渣，清洗，切片，沸水浴滅活2min，以1:4g/ml料液比將芒果皮渣與蒸餾水混合，於搗碎機中勻漿，得芒果皮渣勻漿，4℃冷藏備用；
（2）芒果粗多糖的提取：取經步驟（1）處理的芒果皮渣勻漿30g，加入120ml蒸餾水，復水30min、調節ph為5.0、加入芒果皮渣質量0.8%的纖維素酶、於超聲波清洗儀中以300w的功率於50℃提取80min，升溫至90℃滅酶30min。所得提取液經5000r/min離心10min，收集上清液，殘渣重複提取1次；提取液分離出上清液，真空減壓濃縮至10ml，加入濃縮液5倍體積95%乙醇，4℃沉析過夜，4000r/min離心10min，所得的沉澱依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，得到透明膠狀多糖；
（3）芒果粗多糖的脫蛋白：將透明膠狀多糖復溶於蒸餾水中，配置成5mg/ml的多糖溶液，取30ml，加入30mltca-正丁醇混合溶液（tca與正丁醇體積比為1:10），於28℃恆溫搖床中160r/min振蕩反應2h，將多糖溶液轉移至分液漏鬥中靜置3h，分層後取下層溶液測定其中蛋白質和多糖含量；測得蛋白質脫除率73.56%，多糖保留率80.79%；
（4）芒果粗多糖的脫色：取20ml上述脫蛋白後的芒果粗多糖溶液，調節ph為5.0，加入1.0%（m/v，以多糖溶液體積計）的粉末活性炭，於50℃、160r/min振蕩吸附脫色60min，8000r/min離心10min，取上清液過0.22µm濾膜去除活性炭，測定多糖含量，並在310nm波長下測定上清液的吸光度，計算脫色率；測得脫色率為61.48%，多糖保留率為89.72%。