一種嵌合載體及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-20 11:47:46
一種嵌合載體及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種嵌合載體，是通過將能夠與GTP-Kras特異性結合的Raf蛋白N端的RAS結合結構域替換Vif蛋白的N端所得。本研究通過設計並構建RBD-Vif-C載體，然後通過細胞水平的體外實驗和裸鼠腫瘤模型的體內實驗證明RBD-Vif-C載體具有良好的腫瘤細胞殺傷效果，提出了一種特異性針對突變型KRAS的新型抗腫瘤技術。Vif-C載體在降解KRAS蛋白中的成功應用，使其有望成為一種新型的基因敲除手段。作用雖類似於siRNA，但卻優越於siRNA的功能。Vif-C載體可以特異性地降解靶標蛋白，尤其是一些處於某種特殊修飾或特殊狀態下的蛋白。
【專利說明】一種嵌合載體及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白抗癌藥物，更具體地，涉及一種嵌合載體及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]一直以來，控制細胞生長分化中的表達或功能的細胞基因組中如果發生改變都被認為是誘發腫瘤的主要原因。腫瘤的分子生物學研究旨在確定那些在各種腫瘤類型的基因改變，並闡明這些基因在腫瘤發生中的作用。其中，最常見的人類腫瘤突變的基因家族之一就是RAS基因。
[0003]正常生理情況下，在細胞受到外界刺激後激活EGFR等信號通路時，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化後短暫活化，活化後的KRAS可以激活該信號通路中的下遊信號蛋白，而後KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效應是受控的。然而，突變型KRAS蛋白導致蛋白功能異常，在無EGFR活化信號刺激下仍處於激活狀態，其功能狀態不可控，導致腫瘤的持續增殖等。RAS基因就像體內的一個「開關」，它在腫瘤細胞生長以及血管生成等過程的信號傳導通路中起著重要調控作用。正常的KRAS基因可抑制腫瘤細胞生長，而一旦發生突變，它就會持續刺激細胞生長，打亂生長規律，從而導致腫瘤的發生。因為KRAS基因突變一般發生在腫瘤惡變的早期，並且原發灶和轉移灶的KRAS基因高度保持一致；一般認為，KRAS基因狀態不會因治療而發生變化。因此，檢測KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解各種癌症的發展預後和放化療療效的重要指標，具有極其重要的臨床意義。
[0004]在我國，胰腺癌一直以來都是我國人口死亡的十大惡性腫瘤之一，5年生存率不到5%，是預後最差的惡性腫瘤之一。近年來，在廣東地區，大腸癌已經成為第二大癌症殺手，有明顯增加的趨勢，其發病率和死亡率也明顯逐年上升。腫瘤細胞RAS基因突變率大約為25%，而胰腺癌，結腸癌和非小肺泡肺癌中分別達到90%，45%和35%。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一提供一種嵌合載體是通過將能夠與GTP-Kras特異性結合的沿/蛋白N端的RAS結合結構域替換Vif蛋白的N端所得。
[0006]本發明另外給出一種嵌合載體的製備方法，包括以下步驟:
S1.Raf的蛋白結構上有一個特異性結合GTP-KRAS的RAS結合結構域RBD，將這個RBD結構域替換Vif蛋白N端的1-79位胺基酸序列，從而構建了一個新的嵌合蛋白RBD-Vif-C ；
S2.將嵌合載體克隆到表達載體pcDNA3.1上，通過轉染進行瞬時表達，
S3.從公司合成跨膜肽片段PTD，然後將其連接到pet-32a的大腸桿菌表達載體上
S4.以RBD-Vif-C為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物RBD-Vif-C連接到pet_32a的表達載體上，並且PTD位於RBD-Vif-C的N端，形成融合表達載體PTD-RBD-Vif-C
S5.將PTD-RBD-Vif-C的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，
S6.對轉化的大腸桿菌進行培養，S7.經鎳柱純化，得到單一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，
其中，S6中，所述培養是將轉化的大腸桿菌單菌落接種至含氨苄青黴素LB液體培養基中培養過夜；再按1:50體積比接種到37 °C預熱的含氨苄青黴素LB液體培養基中培養至0D600達0.6 ;表達PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,經誘導後收集菌體，
S7中，所述純化的方法是將總菌體用PBS Buffer洗滌，重懸，超聲處理後，高速離心獲得裂解上清液，經鎳柱親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
[0007]本發明提供一種上述的嵌合載體在製備抗腫瘤藥物中的應用。
[0008]所述的腫瘤為胰腺癌腫瘤、大腸癌腫瘤或肺癌腫瘤。
[0009]本發明另外提出一種上述的嵌合載體在製備降解突變KRAS的藥物中的應用。
[0010]Vif蛋白是HIV-1自身的一個重要蛋白，可以結合靶標蛋白，把它們連結到一個E3連接酶(Iigase)複合物(Vif-SCF_CUL5 complex)上,然後這個複合物將使祀標蛋白泛素化，從而導致其在proteasome (蛋白酶體)中的降解。本發明重點關注KRAS突變引發的相關癌症，試圖將能夠與GTP-Kras特異性結合的Raf蛋白N端的結合結構域RBD替換Vif的N端,通過體內體外等多種試驗探索此嵌合型蛋白降解突變型KRAS的效率和作用機理。這一技術發明對進一步研發抗腫瘤的蛋白類藥物具有十分重要的意義。因此，我們提出的這種新的構建嵌合蛋白的方法，將極有可能成為一種新的抗腫瘤的新技術，具有極為重要的學術價值和實用價值。
[0011]( I)為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在於提供一種新型的嵌合載體的構建的方法及其在生命科學研究及腫瘤的臨床治療中的應用。
[0012](2)本發明提供了一種全新的KRAS基因相關的腫瘤殺傷技術。
[0013](3 )本發明提出了一種降解KRAS蛋白表達的新技術。
[0014](4)本發明提出了一種全新的在蛋白水平上可以特異性降解特殊狀態或者特殊修飾的蛋白的新技術。
[0015](5)本發明提出了一種新的降解多種蛋白的新手段——將某種蛋白的結合為點插入到Vif基因的N端，從而通過Vif C端的泛素化通路實現特異性蛋白的降解過程。
[0016](6)本發明提供了一種新的技術在治療胰腺癌腫瘤中的應用。
[0017](7)本發明提供了一種新的技術在治療大腸癌(結直腸癌)腫瘤中的應用。
[0018](8)本發明提供了一種新的技術在治療肺癌腫瘤中的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1:嵌合載體RBD-Vif-C的構建模型。
[0020]圖2:嵌合載體RBD-Vif-C可以降解KRAS蛋白，並抑制其下遊磷酸化信號通路。
[0021]圖3:PTD-RBD-Vif-C蛋白在體外具有良好的腫瘤細胞殺傷作用。
[0022]圖4:PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠體內具有良好的抗腫瘤效果。
[0023]圖5:PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠體內的急毒實驗。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發明採用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規市購的試劑、設備和常規使用的方法。
[0025]實施例1嵌合載體RBD-Vif-C的構建模型
眾所周知，胰腺癌、肺癌、結腸癌等多種腫瘤的發生與KRAS基因的突變有莫大的關聯。KRAS的單個點突變就足以導致腫瘤的發生，其中KRAS的第12位胺基酸的突變佔了 KRAS單點突變的98%，而在這第12位胺基酸的突變種類中又分別抑G12V和G12D突變最為顯著，分別佔了 30%和51%。我們利用Vif誘導靶蛋白的降解機制實現對突變型KRAS蛋白的特異性降解，從而研發新型的抗腫瘤的藥物。
[0026]根據查閱文獻了解到，RAF-1蛋白的N-端存在一個特異性結合突變型KRAS的結合結構域RBD(KRAS binding domain)，它在體內體外都可以特異地結合突變型KRAS蛋白，其對GTP-Kras與⑶P-Kras結合的親和力的差別達1000倍。於是，我們將RBD替換Vif蛋白的N端，然後連接到pcDNA3.1的載體上形成了 RBD-Vif-C嵌合載體。
[0027]具體方法如下:
(1)Raf的蛋白結構上有一個特異性結合GTP-KRAS的RAS結合結構域RBD，將這個RBD結構域替換Vif蛋白N端的1-79位胺基酸序列，從而構建了一個新的嵌合蛋白RBD-Vif-C
(2)將這三個嵌合載體分別克隆到表達載體pcDNA3.1上，通過轉染進行瞬時表達
(3)從公司合成跨膜肽片段PTD，然後將其連接到pet-32a的大腸桿菌表達載體上 (4)以RBD-Vif-C為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物RBD-Vif-C連接到pet_32a的表達載體上，並且PTD位於RBD-Vif-C的N端，形成融合表達載體PTD-RBD-Vif-C
(5)將PTD-RBD-Vif-C的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中
(6)對轉化的大腸桿菌進行培養
(7)經鎳柱純化，得到單一的PTD-RBD-Vif-C蛋白
其中，步驟(1)中，所述的載體構建包括以下步驟:根據HIV-1的Vif蛋白和KRAS蛋白分別合成2對引物，然後以HIV-1病毒的PNL4-3質粒序列為模板，利用上述引物進行PCR擴增；然後利用不同的酶切位點將PCR擴增產物克隆到pcDNA3.1上，其中RBD的片段插入位置在Vif片段的N端。
[0028]步驟(6)中，所述培養是將轉化的大腸桿菌單菌落接種至含氨苄青黴素LB液體培養基中培養過夜；再按1:50體積比接種到37 °C預熱的含氨苄青黴素LB液體培養基中培養至0D600達0.6 ;表達PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,經誘導後收集菌體。
[0029]步驟(7)中，所述純化的方法是將總菌體用PBS Buffer洗滌，重懸，超聲處理後，高速離心獲得裂解上清液，經鎳柱親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
[0030]實施例2嵌合載體RBD-Vif-C可以降解KRAS蛋白，並抑制其下遊磷酸化信號通路
將突變型的KRAS基因KRAS-G12D和KRAS-G12V分別與RFP基因融合表達並克隆到pcDNA3.1的載體上，這樣可以通過觀察RFP的表達來反映KRAS的表達情況；同時用western blot來進一步驗證KRAS的表達情況。
[0031 ] (I)在6孔板的293t細胞中，共轉染KRAS-G12D-RFP和RBD-Vif-C載體或KRAS-G12V-RFP和RBD-Vif-C載體，質粒的量均為I ug，轉染48h後觀察RFP的表達；同時收細胞裂解做Western Blot檢測KRAS的表達該實驗說明了，RBD-Vif-C可以降解突變型的KRAS蛋白。
[0032](2)在6孔板的293t細胞中轉染KRAS-G12D和RBD-Vif-C質粒，48h後收細胞裂解做Western Blot檢測ERK及磷酸化的ERK的表達情況
該實驗說明了，RBD-Vif-C可以通過降解KRAS蛋白來抑制其下遊的磷酸化的信號通路。
[0033]實施例3 PTD-RBD-Vif-C蛋白在體外具有良好的腫瘤細胞殺傷作用
考慮到胰腺癌、肺癌和大腸癌細胞質粒系統轉染效率低等因素，以及後續的蛋白成藥性因素，於是，我們選擇用大腸桿菌來表達相應的RBD-Vif-C蛋白，同時選擇GFP-Vif-C作為陰性對照蛋白，試圖直接通過蛋白的作用方式來驗證RBD-Vif-C對KRAS基因的表達抑制。
[0034]我們首先參考相關文獻的方法，合成了一個可以高效跨膜的短肽PTD，序列如圖所示。然後，我們將跨膜肽和RBD-Vif-C —起克隆到pET-32a原核表達載體上，通過原核系統表達RBD-Vif-C蛋白。我們採用鎳柱純化帶His-tag的PTD-RBD-Vif-C蛋白，通過多番優化後得到純度相對較高的蛋白。然後，我們又進一步通過TritonX-114的方法去除蛋白中的內毒素。因為蛋白本身具有跨膜肽，所以我們可以直接將純化好的蛋白加入到細胞培養上清中，這為我們後續的實驗提供了較大的便利。
[0035](I)將多種細胞鋪板到24孔板中，待細胞貼壁後，分別加入4ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白或PTD -GFP-Vif-C蛋白，處理48h後，顯微鏡下觀察並記錄各種細胞的生長狀態。
[0036]該實驗說明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制多種KRAS相關的腫瘤細胞的增殖。
[0037](2)在 24 孔板的 Panc-1 和 A549 細胞中，分別加入 O ug/well, 2 ug/well ,4 ug/well ,8 ug/well 的 PTD-RBD-Vif-C 蛋白，處理 48h 後，收集細胞,標記 Annexin-V FITC 的流式抗體,檢測兩種細胞的凋亡情況。
[0038]該實驗說明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以誘導KRAS相關的腫瘤細胞發生凋亡，並具有一定的濃度梯度依賴性。
[0039](3)在 6 孔板的 Panc-1 和 A549 細胞中，分別加入 2 ug/well 的 PTD-GFP-Vif-C蛋白和2 ug/well的PTD-RBD-Vif-C蛋白，處理12h後，收集細胞裂解做WB檢測兩種細胞內源性的KRAS的表達情況；
該實驗說明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白可以抑制內源性的KRAS基因表達。
[0040]實施例4 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠體內具有良好的抗腫瘤效果
在中山大學動物實驗中心訂購4-6周大小的雄性Balb/c裸鼠6隻。隨機的將他們分成2組，每組3隻。然後分別將I X 106的Panc-1和A549細胞接種到小鼠皮下成瘤，2周後觀察小鼠皮下成瘤的現象並開始每周注射2-3次PTD-RBD-Vif-C蛋白和PTD-GFP-Vif-C蛋白，4周後處死小鼠取腫瘤組織觀察並記錄稱重。
[0041]該實驗說明了，PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠體內具有良好的抗腫瘤效果，尤其是在胰腺癌和肺癌的腫瘤細胞中。
[0042]實施例5 PTD-RBD-Vif-C蛋白在小鼠體內的急毒實驗
(I)在中山大學動物實驗中心訂購4-6周大小的雄性Balb/c小鼠18隻。隨機的將他們分成3組，每組6隻；(2)以尾靜脈注射的方式將PTD-RBD-Vif-C蛋白注入小鼠體內，注射量分別為Omg/kg (PBS)，10mg/kg, 20mg/kg,每組 6 只小鼠；
(3)兩周後，取小鼠血樣檢測肝功能和腎功能，實驗結果顯示正常；
(4)處死後，取小鼠心肝脾肺腎各個組織樣本，HE染色，觀測是否有器官發生病變。
[0043] 該實驗說明了，20mg/kg劑量的蛋白對小鼠是無毒安全的，該蛋白具有較好的成藥性。
【權利要求】
1.一種嵌合載體，其特徵在於，是通過將能夠與GTP-Kras特異性結合的/fe/蛋白N端的RAS結合結構域替換Vif蛋白的N端所得。
2.一種嵌合載體的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: S1.Raf的蛋白結構上有一個特異性結合GTP-KRAS的RAS結合結構域RBD，將這個RBD結構域替換Vif蛋白N端的1-79位胺基酸序列，從而構建了一個新的嵌合蛋白RBD-Vif-C ； S2.將嵌合載體克隆到表達載體pcDNA3.1上，通過轉染進行瞬時表達， S3.將跨膜肽片段PTD連接到pet-32a的大腸桿菌表達載體上， S4.以RBD-Vif-C為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物RBD-Vif-C連接到pet_32a的表達載體上，並且PTD位於RBD-Vif-C的N端，形成融合表達載體PTD-RBD-Vif-C, S5.將PTD-RBD-Vif-C的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中， S6.對轉化的大腸桿菌進行培養， S7.經鎳柱純化，得到單一的PTD-RBD-Vif-C蛋白， 其中，S6中，所述培養是將轉化的大腸桿菌單菌落接種至含氨苄青黴素LB液體培養基中培養過夜；再按1:50體積比接種到37 °C預熱的含氨苄青黴素LB液體培養基中培養至0D600達0.6 ;表達PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,經誘導後收集菌體， S7中，所述純化的方法是將總菌體用PBS Buffer洗滌，重懸，超聲處理後，高速離心獲得裂解上清液，經鎳柱親和層析純化，收集洗脫的蛋白。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述的融合表達載體PTD-RBD-Vif-C的序列如SEQ NO:1所示，從N端到C端的結構分別為，跨膜肽PTD部分，RBD的Kras結合部位，Vif-C的降解部分。
4.一種根據權利要求1所述的嵌合載體在製備抗腫瘤藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的腫瘤為胰腺癌腫瘤、大腸癌腫瘤或肺癌腫瘤等KRAS相關的腫瘤。
6.一種根據權利要求1所述的嵌合載體在製備降解突變KRAS的藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/64GK104131034SQ201410275218
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】張輝, 潘婷 申請人:中山大學